双光子显微镜，用于研究小鼠脑切片中化合物的小胶质细胞过程吸引力

双光子显微镜下将小鼠脑切片放入含有aCSF的灌注室中。

该小鼠经过基因工程改造，可在小胶质细胞中表达 GFP，从而能够跟踪小胶质细胞的运动。

用支架固定切片。

使用明场照明，定位感兴趣区域。

切换到荧光照明以可视化小胶质细胞。

测试化合物填充微量移液器，将其安装在注射器支架上，然后将其降低以接触切片。

激活双光子成像模式，将低能量近红外光聚焦到组织中。

在激光的焦点处，两个光子结合它们的能量激发 GFP，发出荧光。

多个 Z 平面上捕获图像以聚焦小胶质细胞突起。

记录基线活性，然后注射化合物并继续记录。

该化合物与小胶质细胞受体结合，触发信号通路，驱动小胶质细胞过程向化合物源延伸。

监测注射部位附近荧光随时间的增加，以跟踪运动。

开始记录前30分钟，将蠕动泵连接到具有顶部和底部灌注的定制记录室，以优化组织切片的氧合和活力，并用50毫升超纯水清洁整个灌注系统。在清洁周期结束时，在恒定碳原化下，在玻璃烧杯中用50毫升aCSF开始灌注记录室，并使用一次性广口转移移液器将第一片要成像的切片转移到烧杯上以去除透镜纸。

当切片沉入烧杯底部时，将切片转移到记录室并将切片支架放置在切片上，以尽量减少灌注流引起的移动。使用明场照明在 5 至 10 倍的放大倍率下瞄准感兴趣的大脑区域。然后使用25倍物镜和0.35倍水浸透镜调整视野的位置。

使用荧光照明定位荧光小胶质细胞，并用含有终浓度目标化合物的 10 微升 aCSF 回装移液器。轻轻摇晃将吸头朝下，以去除吸头中滞留的任何气泡，然后将填充的移液器安装到连接到 5 毫升注射器的移液器支架中，柱塞位于 5 毫升位置并安装在三轴显微纵器上。

将移液器轻轻地朝切片降低，同时控制和调整物镜，直到移液器吸头轻轻接触切片表面。现在调整激光器并将显微镜切换到多光子模式。确保腔室与任何光源隔绝，并打开未去扫描的探测器。设置增益并使用具有颜色编码上限的查找表，以避免图像中的像素饱和。

然后开始记录总持续时间至少 30 分钟，五分钟后在 5 秒内将注射器柱塞从 5 到 1 毫升位置缓慢压下，以将化合物涂抹到切片上。对于图像分析，首先使用 ImageJ 对感兴趣的文件进行 Z 投影和漂移校正。然后在 Icy 中打开修改后的文件，并在注射部位中心绘制一个直径为 35 微米的圆形感兴趣区域。

使用 ROI 再次运行电影以确保其位置正确。然后，使用感兴趣区域强度演化插件测量感兴趣区域随时间变化的平均强度，并将结果保存为.xls文件。