活体双光子成像观察小鼠海马区小胶质细胞动态

取一只表达小胶质细胞荧光蛋白的转基因小鼠，麻醉后将其固定在带有电动载物台的立体定位仪上，并置于双光子显微镜下。

颅骨上安装有一个带玻璃底的金属管，该金属管轻柔地压平海马体角回1区（CA1区）上方的alveus，确保形成清晰的光学界面，且不造成

对 underlying 组织施加过大的压力。

用水填充金属管以优化光学透射。

在激发波长下启动脉冲激光器。

利用脑实质的荧光和金属管的反射光，调节 CA1 区的焦距。

调整小鼠头部位置，使玻璃底部与成像平面平行，确保整个视野内的焦点均匀一致。

调整物镜以获得最佳分辨率，并观察CA1区小胶质细胞的活体动态。

接下来，对齿状回进行成像，其中荧光标记的小胶质细胞可证实 CA1 区的完整性。

将小鼠放置在双光子显微镜物镜下方的头部固定装置中，并置于电动控制的XY扫描台上。随后，在玻璃底部与物镜之间填充水，避免产生气泡。在脉冲激光持续照射下，根据脑实质发出的荧光以及金属管边缘反射的光线，调节焦距至CA1区域。

通过倾斜头部固定装置来调整小鼠头部的角度，使玻璃底部与成像平面平行。然后，调节物镜的校正环，以在CA1区目标结构的深度处获得最高分辨率。接着，在距玻璃底部500微米深度处，确认齿状回分子层（DG）中的荧光细胞在整个视野中均能成像。只有在手术成功的情况下，才能立即检测到DG信号。

确保小胶质细胞已恢复其分支状形态，然后对CA1区感兴趣层进行活体成像。