通过全内反射荧光显微镜可视化G蛋白偶联受体的单事件分辨率网格蛋白介导的内吞作用

该程序的总体目标是可视化和定量活细胞中单个网格蛋白包被凹坑的动力学。这是通过首先将荧光标记的内吞蛋白和转运蛋白横切到贴壁细胞系中来实现的。下一步是使用全内反射、荧光或草皮显微镜对细胞进行成像。

然后使用图像处理和分析程序手动定量小组网格蛋白包被凹坑的寿命。最后一步是通过客观的自动检测和分析来量化网格蛋白包被凹坑的寿命。最终，草坪显微镜用于以单事件分辨率定量单个网格蛋白包被凹坑的动力学，以研究网格蛋白介导的 G 蛋白偶联受体的内吞作用。

这种方法可以帮助回答膜运输领域的关键问题，例如内吞作用的组装和动力学如何根据存在的不同内吞蛋白和转运蛋白而变化。要开始用编码标签 G 蛋白偶联受体或 GPCR 的质粒和/或 Claro 机制的组分转染 HEC 2 93 细胞。在 12 孔板中，如文本方案中所述，转染后第二天，向每个板中加入 0.5 毫升磷酸盐缓冲盐水或 PBS 和 1 毫摩尔 EDTA。

然后将三轮无菌 25 毫米盖玻片放入 6 个单独的孔中。孔板 用 2 毫升培养基填充每个孔。轻轻地将盖玻片向下推至孔底部，以防止细胞在盖玻片的底部生长。

接下来，手动搅拌 12 孔板的孔，以从孔底部取出细胞。加入 1 毫升含 10% FBS 的 DM EM 重新发送。然后将从一个孔中提起的细胞均匀地分布在三个盖玻片中。

成像前让细胞在盖玻片上生长至少 48 小时。还要确保细胞展开且平坦，以便对网格蛋白包被的凹坑和货物动力学进行成像。首先，按照文本方案中的说明，用抗体预孵育细胞。

然后准备使用一对镊子和一根 25 号针头将盖玻片转移到活细胞成像室中，针头的尖端弯曲成钩子。用惯用手握住一对镊子。将弯曲的针头放在另一根中。

转动针头，直到钩子向下弯曲，朝向玻璃杯。轻轻地将针钩面向下拖过六孔板的底部，直到它钩在盖玻片上。注意不要刮伤盖玻片的表面，因为它会分离细胞。

轻轻地将盖玻片从孔底部提起。将盖玻片靠在井壁上以获得支撑。使用镊子抓住盖玻片边缘附近，然后将盖玻片单元一侧向上移动到成像室。

组装腔室并添加 700 微升预热成像介质。将腔室转移到显微镜上后，使用草皮油浸物镜聚焦细胞，在常规落射、荧光或共聚焦照明模式下对细胞进行成像，以识别表达适当构建体的细胞，这是一项重要的安全预防措施。始终注意激光束的角度，并始终将其远离观察者。

接下来，向下聚焦到表达细胞的底面，直到细胞周围质膜的轮廓消失，细胞的底面出现。这在质膜定位的货物蛋白（如 mu 阿片受体）中最为明显。如果使用相同的激光器进行常规落射荧光成像，请增加激光的入射角，直到焦点外。

细胞内部的荧光消失，看不到细胞周围质膜的轮廓。进入草坪 m 后，确保激发激光通过物镜反射回来，并且在物镜上方不可见。通过检查激光点是否可见，优化焦点以获得清晰的图像。

鉴定出细胞后，至少每 3 秒采集一次图像，持续 10 分钟。重复所有步骤以对其他单元格进行成像。要开始分析内吞动力学，请在图像中打开文件 J.Images 存储为单个 TIFF 文件堆栈。

带叶间通道。通过在弹出窗口中选择图像超级堆栈和堆栈到超级堆栈，将图像转换为超级堆栈。输入获取的渠道数。

为 Zack 输入 1，然后输入影片帧数。hyper stack 格式生成一个带有两个滚动条的窗口。使用顶部栏在通道中移动，使用底部栏在时间中移动。

滚动到将检测其寿命的蛋白质的通道。移过影片的第一帧，以减少包含预先存在的网格蛋白包被的凹坑或整个持续时间不可见的 CCP。在随机选择的点周围绘制感兴趣区域或 ROI

计算一个点可见的帧数。要开始分析对象识别，请在图像分析软件中打开原始图像文件，默认情况下会出现。出现彩色图像。

使用显示调整窗口调整通道的亮度。单击通道的名称以更改显示的颜色。取消选中渠道旁边的框以阻止其显示。

通过单击带有橙色点的图标来创建点。选择单元格周围的 ROI，使用它来排除会错误地检测明亮前缘和斑块的区域。测量光斑的直径，为算法提供初始估计值。

切换到切片模式，然后单击光斑的两极端以测量其直径。对 4 个或 5 个圆形斑点执行此作，这些圆点看起来表明 A CCP 在放弃前形成后处于高度稳定性，使用这些测量值计算低至最接近的 10 微米的平均直径。要检测点返回到超越模式，请选择适当的检测通道。

输入平均测量直径，通常为 0.3 或 0.4 微米。单击蓝色前进箭头以量化斑点。通过调整滤镜来按质量过滤污点，以捕获尽可能多的没有背景的污点。

默认情况下，质量筛选器处于选中状态。使用质量曲线作为指南来设置适当的阈值。使用鼠标左键将滤波器的底部阈值移动到曲线中的第一个下降。

这是筛选器的良好起点。因为这个位置通常会将检测细化为仅可见点。删除编辑点中的arant spot 屏幕切换到选择模式并单击点 变为黄色后，单击删除。

然后单击蓝色箭头以继续构建算法。通过将 tracks 设置为 broni in motion来测量 tracks。CCP 不应表现出任何定向运动，仅穿过质膜的微小漂移。

此算法最适合该运动。接下来，将 Max Distance （最大距离） 设置为一个较小的值，例如 0.7 微米。设置较小的距离可最大程度地减少相邻斑点的连接，并且仍然允许通过 CCP 或细胞移动持续跟踪细胞斑点。

然后将 max gap size 设置为 1。这允许在仅缺少一帧时继续跟踪。连续的间隙大小超过 3 会导致不同的轨道错误地链接在一起。

下一步是将轨迹视图切换到 dragon tail。滚动影片以观察检测质量。如果正在连接相邻点，请将最大距离减小到 0.7 微米以下。

如果斑点太容易被打碎，请增加最大间隙大小。单击蓝色箭头以创建轨迹。这将导致 filter track 屏幕对 track 进行过滤。

使用强度过滤器去除其他亮斑。然后使用置换过滤器去除进入草皮田的内体。请谨慎使用，因为较长的点也会有较长的位移。

单击绿色双箭头以完成协议。要导出数据，请转到 statistics 选项卡。单击单个软盘图标以导出所选统计信息。

单击看起来像一系列软盘的图标以导出所有统计数据。聚焦 A 贴壁质膜和共聚焦模式，揭示一个充满暗淡荧光的细胞。相反，聚焦细胞中心会发现质膜是细胞周围的荧光环。

当切换到传统的 epi、fluorescence 或角度不正确的 turf 时，离焦荧光会变得明显。当草皮角度正确时，质膜非常清晰、清晰明亮，并且脱焦。荧光不再干扰图像。

当 β 抑制蛋白位于胞质池中时，草皮田中的抑制蛋白很少，并且看起来朦胧且呈外侧焦点。一旦 MOR 被激动剂 β 激活，arrestin 就会被募集到质膜上，β arrestin 和受体都会重新分布到 CCP。这些集群的生命周期是手动量化的。

使用完成内吞作用的三个参数，表示 CCP 的斑点可以完全消失、闪烁和闪烁，或者挤压更大的结构。此处显示的是使用 MA 检测的 CCP经过过滤以去除非动态斑块结构、覆盖的白色球体、表示检测到的斑点、在其整个生命周期内无法检测到的较暗的斑点也被质量过滤器排除。观看此视频后，您应该对如何使用草坪显微镜观察单个导管编码凹坑有很好的了解。