细胞捕获使用一个微流体装置

我们准备的设备被包装成 10 或 20 个的套件，当它们到达时，它们被装在一个盒子里冷藏运输，套件包含您需要运行的所有组件。试剂盒中的实验是一个包含所有注射器和缓冲液的小包，它们可以保持在室温下。在这个实验中，我们还有一个协议的副本。

还有一个冷藏箱，里面装着实际的设备和所有需要冷藏的运行缓冲区。通常，试剂盒以 10 个或 20 个为一组包装。不使用时，套件应冷藏。

每个注射器和每个试剂盒组件都经过精心标记，标签与我们遵循的方案中的表格相对应。因此，在各个步骤中应使用哪种注射器或试剂盒组件没有歧义。打开设备包装并将它们放入生物安全柜后，我们将执行分离中性粒细胞并裂解它们以进行下游基因组应用的程序，因为我们将获得的救命值将用于分离，或者我们将从细胞裂解物中提取 RNA。

正因为如此，我们希望确保我们的区域是干净的，不仅是无菌意义上的，而且是环境中通常存在的任何 RNA。因此，用破坏 RNA 的溶液擦拭您的所有区域和设备非常重要。因此，通常我们会用 RNA、SAP 或 RNA 擦拭我们所有的工具和工作表面，您可以从许多制造商那里获得。

该设备已包装在热封袋中。每个设备都密封并标记此条形码。如果您正在处理任何临床样本，您应该记下此条形码。

因此，该装置被解封，盖子被取下，并被放置在泵保持歧管装置中。我们使用的血液样本是全血样本。我们将它流经标准的 1 mil BD 注射器，这被标记为 1 号注射器。

通常所做的是，将注射器从包装中取出，然后小心地从血管中取出盖子。你要做的是滴入 700 微升或 0.7 密耳的血液，并将其中的一半或 350 微升注入 1.5 密耳的试管中。谢谢。这样，您的血液就可以传递以进行进一步处理。

您的血液管可以继续传递，但在设备发生故障的情况下，您仍然有更多的血液残留。所以现在我们要做的是将装有血液的注射器装入这个针头上，该针头连接到带有该装置的一根管子上。我们希望非常、使用微流体隔离装置。

我们希望非常小心，不要将任何气泡引入设备中，否则设备将发生故障。因此，通常我们所做的是拿起注射器，向下推柱塞，将液体添加到设备的顶面，确保在我们喷射所有液体之前它已完全结合。我们停下来，小心地从针头上取下注射器本体，基本上用注射器中剩余的缓冲液填满针头尖端或针头的诱饵连接器。

我们处理掉它。然后，我们将取装有血液的注射器，将其插入这个诱饵中心。小心不要溅出血液，小心不要引入任何气泡。

最好使用握住注射器主体和管道的 kemo，以防任何血液溢出。一旦注射器连接到管道外壳或针头，我们就会用力敲击几下以去除连接器上可能存在的任何气泡。然后将该注射器装入注射泵，然后装入注射泵，并用锁定螺钉固定。

注射泵已打开，并且已经预设了我们的流动条件。我们将以每分钟 30 微升的速度将这些血液流过设备。将注射器本体装入注射泵后，我们将按下可移动柱塞臂上的按钮并将其向下滑动，直到它接触到柱塞的顶部并开始通过柱塞的尖端将流体推出。

这是一个钝尖的不锈钢针。一旦我们知道系统已准备就绪，我们就按 run。要开始血液流动，请按 Stop 停止它，然后取一根干净的 1.5 mil 离心管或 fendor 管，我们将小心地拔下插头。

仅拔下一个，从设备的一个端口拔下管路。拔下该管子后，我们会将其插入 1.5 mil fendor 管中。我们将按下 run（运行）以再次开始血液流动。

当我们看到一滴血形成时，我们停止泵并将其插入我们刚刚在设备中打开的入口。我们将按下 run（运行）开始血液流动，并将计时器设置为 5 分钟。我们希望确保血液均匀地充满所有腔室，并且设备中没有明显的气泡。

如果有气泡阻碍了流入任何腔室，您可以拿一把镊子沿着小通道运行它们，这些通道通向捕获室或离开捕获室的小通道。这个装置填充得很好，所以五分钟后，你按下注射泵上的停止按钮以停止血液流动，松开注射器的夹子，将其从注射泵支架中取出。然后我们将使用 3 号注射器，它装有不含核酸酶的 PBS，我们将使用，我们基本上要这样做，再次确保设备表面是结合的，以避免任何气泡，我们将轻敲注射器以制造任何气泡，确保任何气泡都在注射器主体的顶部。

松开注射泵上的臂，将 3 研磨针筒插入泵中。将其向下拧紧，然后向下推柱塞，直到它接触到注射器的柱塞。我们点击运行，等待液体灌注设备，然后等待 a 在不锈钢针尖看到液滴。

当您看到液滴形成时，您就会停止泵。我们要取出血液，即装有血液的不锈钢尖端。我们将插入洗涤缓冲液并按下 run。

我们将让它运行 5 分钟。您应该拿一块干净的擦去，擦掉任何少量的血液，这些血液可能在入口或出口处。在通过设备运行洗涤缓冲液五分钟后，设备中的任何血液应完全清除，您可以看到设备中基本上不会留下任何红血， 设备看起来会很清晰。因此，我们要做的是在 5 分钟后，我们将停止洗涤缓冲液运行。

同样，我们将从注射泵上取下注射器。我们将 1.5 mil 微型离心管盖上，就在柔性出口管上。我们将小心地提起管子，微型离心管，将废液管从设备中拉出。

我们要把它扔进一个生物危害容器里。套件中有一个新的出口管，它实际上是由特氟龙制成的。它上面又有一个不锈钢尖端。

我们将用这种新的出口管替换旧的出口管。我们将采用出口管，并尝试将其弯曲成 U 形或 V 形。然后，该试剂盒还带有一个 kaya 切碎柱，它可以剪切 DNA，基本上使您的细胞生命匀浆。

因此，我们将打开撕碎机塔的紫色盖子，将出口管放入 Kay Shredder 塔中。我们要从试剂盒中取出 2 号注射器，上面写着，对于 RLT，我们将使用它。这是一个标准的 BD 一密耳注射器，带有 22 号钝头，不锈钢。

我们将使用它从 kyogen 注入 350 微升标准 RLT 到设备中。因为该装置的死体积约为 50 μL，所以我们想做的是注射 RLT，但在 RLT 后面，我们想注射一个空气塞，将装置的死体积释放到 chi 碎纸机柱中。所以我们要做的是拿起注射器，拉动，抽取 350 微升空气，然后是 350 微升或 0.35 密耳的 RLT，RLT 现在位于注射器的底部。

抵制将注射器翻转过来并注入空气的诱惑。空气在那里确保我们将所有 RLT 都放入我们的 Kay 碎纸机柱中。我们将从洗涤缓冲液中拉出管路。

我们将用 RLT 插入注射器，并在大约 30 秒的时间内将 RLT 缓慢注入设备中，确保出口管将其废物喷射到 chi 碎纸机柱中。一旦空气开始注入设备，您就按下管道机并等待所有液体释放到 Kay Shredder 柱中。我们收集 kay 碎纸机柱，然后在台式微中心保险丝上以 15， 000 RPM 或最大 RPM 的平衡将其在微中心离心机上旋转两分钟。

因此，在旋转色谱柱 2 分钟后，我们将样品从中取出，样品现在在 RLT 中，我们将其放入随附的紫色瓶盖冻存管中。如果您正在处理临床样品，请对这些冻存管进行采样，您将在实验开始时对其进行标记。这是冷冻瓶中的裂解物。

该冻存管立即置于零下 80 度 AC C 的冰箱中，并储存起来以备运输或以后的 RNA 提取。所以这是分离中性粒细胞的替代方案。我们不是用 RLT 缓冲液裂解细胞，而是用标准组织学染色剂对细胞进行染色。

一个污点。因此，我们将设备密封装置从袋子中取出，再次打开包装，记下设备上的批号并放置培养皿。在培养皿架中。

我们将从一号袋式注射器中取出 1 mil 注射器，将 700 微升血液注入其中一半，并将其中 350 微升注入 eend DPH 管中。我们先把这个放在一边。取 4 号注射器，其中包含我们将用于选择的管道，将血液注射到设备中。

以化学方式从管子尖端固定针头的底部。取下注射器本体并填充诱饵。适配器将缓冲并处理该注射器。

我们将使用化学湿巾将含血注射器插入针头，以收集任何溢出物。我们将轻敲注射器以去除针头和注射器主体之间连接处的任何气泡。我们将注射器装入注射泵，通过向下推注射泵的移动臂来灌注或灌注管道。

我们将从设备的一个出口（捕获设备）断开管路，并将其放入 1.5 mil 的 einor管中。然后，我们将通过推动注射泵上的运行来开始流血。我们将等待不锈钢尖端形成一滴血。

液滴形成后，您按下停止轻拍血液，将其插入设备并按下运行。现在我们设置一个 5 分钟的计时器。好的，流经设备 5 分钟后，按下注射泵上的停止按钮并释放注射器。

我们将用包含洗涤缓冲液的 3 mil 注射器替换该注射器，该注射器只有一个 XPBS。同样，我们要确保设备的顶部是结合的，然后我们将移除含有血液或 plus run 的针尖。开始灌注设备。

我们将形成液滴，将其插入设备中，然后按 run dab 去除入口或出口管上的任何血液，在洗涤步骤后让其流动 5 分钟。同样，我们将停止注射泵并从泵架中取出注射器。为了进行标准的 GIM 维持，我们首先要固定细胞并使用 100% 甲醇对其进行脱水。

所以，我们有一个注射器，一个预装了甲醇的 3 mil 注射器。同样，我们将灌注注射器，确保甲醇流动，停止注射泵，将其插入设备，然后按 Run。我们要将它们在甲醇溶液中固定 2 到 4 分钟。

因此，在固定和甲醇固定 2 到 4 分钟后，我们停止泵，释放装有甲醇的注射器，然后在这里我们将装入一个注射器，一个 3 mil 注射器，其中包含 Sigma 的 eem sustain 标准 eem sustain，在去离子水中稀释 1 到 5。稀释后，我们装入注射器中，在注射器的末端，我们安装了 0.8 微米的过滤器，以过滤掉任何进入的颗粒，这些颗粒最终会堵塞设备。污渍 5 到 10 分钟。

然后我们用 Deion i 的水冲洗。因此，在染色 5 到 10 分钟后，我们将停止注射泵，我们将用含有去离子水的注射器更换带有染色缓冲液的注射器，我们基本上要冲洗掉，直到我们看到 SAI 的蓝色已经从装置中清洗掉。从设备中冲洗掉多余的 gim sustain 后，我们停止洗涤溶液。

然后我们要做的是从入口处取出水注射器。然后我们要取设备的出口管。我们将用镊子在最后夹住该管子。

这是一个柔性 tigon 管，我们要将其插回设备的入口。这样可以密封设备并保持细胞水分和形态完整。现在，我的同事 John Hong Chang 博士将展示一种分离 CD 四个阳性淋巴细胞的替代方案，然后直接在微流体设备内进行免疫荧光染色。

我叫 Shong Hong，今天我要向大家演示微流控设备中的细胞染色，现阶段已经可以向大家展示如何使用微 flic 免疫亲和分离设备从前所未有的全血中特异性分离血细胞。出于他的目的，他想给细胞除虱，并从这些分离的细胞中获取蛋白质和 DNA 含量。嗯，出于我的研究目的，我对获取细胞感兴趣，然后获得细胞计数，例如，从全血中获得 CD 4 细胞计数，并将其用作诊断目的的指标。

所以使用的设备与 Ken 的设备非常相似。它由 outta P-D-M-S-A 直腔制成。几何形状略有不同，因此作参数略有不同，而一般来说，整体作过程非常相似。

因此，我将跳过所有细胞捕获和冲洗步骤，直接进入细胞计数程序中的细胞染色步骤。所以这里我有一个设备，它已经从全血中捕获了一半的细胞，并且该设备已经用 PBS 冲洗了。因此，出站细胞已经从设备中洗出，我提前准备了一种专门用于标记细胞的抗体混合物，被分离到设备中。

因此，我们在这里使用的抗体浓度已经过优化，可在荧光显微镜下对具有非常高荧光强度的细胞进行染色。所以这个过程非常简单。我们将装满抗体溶液的注射器装入注射泵上，然后确保流速设置为我们需要的正确参数。

然后我们启动注射泵，观察管路的末端，确保溶液已经流出，这样管路中就不会再有气泡。然后我们可以将管路插入我们捕获细胞的微流体设备中。现在抗体流入设备中，对我们分离的细胞进行染色，在设备中，这里的流速，我每分钟使用 5 微升，但根据那里的设备几何形状，您可能希望使用不同的流速参数来实现您的目的。

我们将抗体溶液流入 5 分钟，这足以替换 micropho 通道内的所有溶液。因此，在抗体注射后，我们将停止流血。因此，我们以每分钟 5 μL 的速度在抗体中漂浮 5 分钟，以替换微通道内的所有溶液。

之后，我们停止流式，让设备在室温下孵育 30 分钟。因此，这应该在黑暗中进行，这样抗体就不会在细胞、荧光抗体与染色抗体一起孵育时被淬灭。因此，在染色通常 15 分钟到 30 分钟后，我们只需从设备上拔下管路，然后用缓冲注射器更换抗体注射器，即可从设备中洗掉未结合的抗体。

所以这里的洗涤液在 PBS 溶液中含有 1% BSA。BSA 用于阻止抗体在表面不结合，我们将做同样的事情。因此，首先我们调整注射泵的流速，以确保它是我们想要的正确流速，然后我们启动注射泵，确保液体确实从管道中流出，然后再将其插入设备。

这样做的目的是没有气泡残留在管道中。因此，当我们注入时，没有气泡进入我们的设备。因此，我们只需将管路插入设备中，让它再流动 5 分钟，以替换所有洗出的抗体，即设备中所有未结合的抗体。

洗涤步骤后，我们将用 1% PFA 固定细胞。这样做的目的是，如果可以立即进行成像，该设备可以存放几周到几周。所以这个过程非常简单。

这类似于我们以前所做的。我们将注射器装入泵上，将流速调整到我们想要的流速，然后启动注射泵，将管道插入我们的设备，以注入 Paraform IDE 溶液，这是固定剂到我们的设备中以固定细胞。同样，我们让它流淌大约五分钟。

因此，PFA 替换了设备中的所有缓冲液，以固定设备中的所有电池。因此，在 PFA 固定步骤之后，我们只需取下 PFA 注射器，现在设备就可以进行成像了。在某些情况下，人们希望细胞核染色与他们的细胞表面标志物染色叠加显示。

因此，为此，将在最后使用 DPI 进行细胞核染色。因此，我们只需在打开注射泵时加载 DPI 注射器，然后将 DPI 流入我们的设备。所以现在将在这些细胞中对细胞核进行染色以显示细胞的位置。

因此，DPI 染色图像稍后可以与表面标志物染色叠加以显示细胞的位置。因此，在 DPI 染色结束时，我们需要再次用缓冲溶液洗掉 L 波段 DPI P。因此，我们再次使用含有 1% BSA 的 PBS 来洗掉出站 dpi。

而且这个作和我们之前做的类似。我们只需将缓冲液注射器插入我们的设备中，然后让缓冲液流入设备以洗掉未结合的 dap。这就是在微液装置中对细胞进行染色的整个过程。

在所有染色程序之后，这些设备就可以进行成像了。由于我们进行了 PFA 固定，因此这些设备也可以存放几周。如果无法立即进行图像成像。