Name: 与复用电子检测的粒子的空间跟踪微流体平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 了解微流控CODES平台如何实现多通道粒子检测与尺寸测量。该技术结合电阻脉冲传感与码分多址复用，无需外部显微镜即可电子追踪粒子时空操控，适用于资源有限环境的即时检测应用。

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本工作得到了美国国家科学基金会资助项目（编号：ECCS 1610995）的支持。作者感谢电子与纳米技术研究所及帕克·H·佩蒂特生物工程与生物科学研究所工作人员在使用共享设施方面提供的支持。作者还感谢Chia-Heng Chu在手稿准备过程中提供的帮助。

1. 编码电极的设计
注意：图1a展示了微图案电极的三维结构。
<ol>
	<li>为微流控通道的编码设计一组四个7位Gold码23。
	<ol>
		<li>构建两个线性反馈移位寄存器（LFSR），每个寄存器代表一个本原多项式。</li>
		<li>利用LFSR生成一对优选的7位m-序列。</li>
		<li>对这对优选的m-序列进行循环移位，并在模2下相加，以生成四个不同的Gold码。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设计编码电极的布局（图1b）。
	<ol>
		<li>在三个角落放置三个电极端子，分别代表正极、负极和参考电极。</li>
		<li>将正极和负极电极走线布设在每条微流控通道的相对两侧。</li>
		<li>将正极和负极电极延伸为电极指状结构，插入微流控通道中，并按照唯一指定的Gold码进行排列（图1c）。</li>
		<li>将参考电极置于正极和负极电极指状结构之间。</li>
		<li>将正极和负极电极走线远离最外侧的参考电极指状结构，以尽量减少编码区域外的电导。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 表面电极的微加工
注意：图2b展示了表面电极的制备过程。
<ol>
	<li>将一片4英寸的硼硅酸盐玻璃晶圆浸入piranha溶液（98%浓硫酸 : 30%过氧化氢 = 5 : 1）中，在120 °C下处理20分钟，以去除所有有机污染物。随后将晶圆置于200 °C的加热板上加热20分钟，以除去残留水分。</li>
	<li>将晶圆转移至匀胶机。在晶圆表面滴加2 mL负性光刻胶，以3,000 rpm的转速旋转40秒，使晶圆表面均匀涂覆一层1.5-µm厚的光刻胶。</li>
	<li>将晶圆置于150 °C加热板上，对旋涂后的光刻胶烘烤1分钟。</li>
	<li>使用掩模对准仪，通过铬掩模将光刻胶暴露于365-nm紫外光（225 mJ/cm2）下进行曝光。</li>
	<li>将晶圆置于100 °C加热板上，对曝光后的光刻胶进行1分钟的后烘处理。</li>
	<li>将晶圆浸入光刻胶显影液（RD6）中显影15秒。用去离子水（DI水）轻轻喷淋冲洗晶圆，随后用压缩氮气吹干。</li>
	<li>将带有图案化光刻胶的晶圆放入电子束金属蒸发仪中，在基础真空度为3×10-6 Torr、沉积速率为1 Å/s的条件下，先沉积20 nm厚的铬层，再沉积80 nm厚的金层。</li>
	<li>将金属镀膜后的晶圆置于丙酮中超声浴中，在室温下以40 kHz频率、100%振幅处理30分钟，以蚀去底层的光刻胶，完成剥离工艺。</li>
	<li>使用常规切割锯将晶圆切割成较小的芯片。</li>
</ol>
3. 微流控通道 SU-8 模具的制备
注意：图2a展示了微流控通道模具的制备过程。
<ol>
	<li>使用与 2.1 节所述相同的步骤清洁并烘烤一片 4 英寸的硅片。</li>
	<li>将硅片转移至匀胶机。在硅片上倒入 4 mL 光刻胶，对硅片进行光刻胶涂覆。
	<ol>
		<li>以 500 rpm 转速旋转硅片 15 秒。</li>
		<li>以 1,000 rpm 转速旋转硅片 15 秒。</li>
		<li>以 3,000 rpm 转速旋转硅片 60 秒，以获得均匀涂覆的 15-µm 厚光刻胶层。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将硅片面朝上放置在浸有丙酮的洁净室擦拭布上，去除硅片背面和边缘的残留光刻胶。</li>
	<li>将硅片转移至加热板进行前烘。首先在 65 °C 下烘烤 1 分钟，然后迅速将硅片移至 95 °C 加热板上，继续烘烤 2 分钟。</li>
	<li>使用掩模对准仪，通过铬掩模将光刻胶暴露于 365-nm 紫外光（180 mJ/cm2）下进行曝光。</li>
	<li>曝光后，将硅片在 65 °C 下烘烤 1 分钟，随后在 95 °C 下烘烤 2 分钟。</li>
	<li>将硅片浸入显影液中，轻轻摇晃容器 3 分钟。然后用异丙醇（IPA）冲洗硅片，并用压缩氮气吹干。若硅片表面出现白色残留物，需再次将其浸入显影液中延长显影时间并重新干燥。</li>
	<li>将硅片置于 200 °C 加热板上烘烤 30 分钟，以实现完全干燥。</li>
	<li>使用台阶仪在硅片不同位置测量图案化光刻胶的厚度，以确保其均匀性。</li>
	<li>采用气相沉积法对模具硅片进行硅烷化处理。在培养皿中加入 200 µL 三氯硅烷，并与 SU-8 模具硅片一同置于真空干燥器中处理 8 小时。</li>
</ol>
4. 微流控 CODES 装置的组装
<ol>
	<li>将带有模具的4英寸硅片放入直径为150毫米的培养皿中，并用胶带从边缘固定。</li>
	<li>按10:1的比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物与交联剂，取50 g混合物倒入培养皿中。将培养皿置于真空干燥器中脱气1小时，然后在65 °C烘箱中固化至少4小时（图2a）。</li>
	<li>使用解剖刀切割固化后的PDMS层，并用镊子将其从模具硅片上剥离。原理验证装置的尺寸约为20 mm × 7 mm。随后使用直径为1.5 mm的活检打孔器在PDMS上打孔，作为微流控通道的进样口和出样口。</li>
	<li>将PDMS部件的图案面贴附于洁净室粘性胶带上，以清洁其表面。</li>
	<li>用丙酮、异丙醇（IPA）、去离子水依次冲洗带有表面电极的玻璃基底，并用压缩氮气吹干。</li>
	<li>将PDMS和玻璃基底的表面置于射频等离子体发生器中，在100 mW功率下进行30秒的氧气等离子体处理，使两者的微加工面朝上。</li>
	<li>在光学显微镜下将PDMS微流控通道与玻璃基底上的表面电极对准，然后使两个经等离子体活化的表面紧密接触。</li>
	<li>将装置置于70 °C加热板上加热5分钟，玻璃面朝向加热板。</li>
	<li>通过焊接将电极的焊盘与导线连接。</li>
</ol>
5. 模拟生物样品的制备
<ol>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下，将HeyA8人卵巢癌细胞培养于添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中，直至细胞融合度达到80%。</li>
	<li>使用玻璃移液管吸除培养瓶中的培养基。加入1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后再次吸除。</li>
	<li>加入2 mL 0.05%（w/v）胰蛋白酶溶液，在37 °C孵育2分钟，以悬浮贴壁细胞；然后加入4 mL培养基以中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>将细胞悬液在试管中以100 × g离心5分钟，使细胞沉淀；随后完全吸除上清液。</li>
	<li>用移液器轻轻吹打，以1–2 mL 1× PBS重悬细胞，机械性分散细胞团块。</li>
	<li>吸取少量细胞悬液至移液器中，使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。</li>
	<li>用PBS稀释细胞悬液，制备终浓度为105–106个细胞/mL的样品。</li>
</ol>
6. 运行微流控 CODES 装置
注意：图3展示了实验装置。
<ol>
	<li>将微流控 CODES 装置放置在光学显微镜的载物台上。</li>
	<li>使用电子函数发生器，向芯片上的参考电极施加 400 kHz 的正弦波信号。</li>
	<li>将正负检测电极分别连接至两个独立的跨阻放大器，以将每个电极的电流信号转换为电压信号。</li>
	<li>使用差分电压放大器将正检测电极的电压信号从负检测电极的电压信号中减去，从而获得双极性信号。</li>
	<li>使用高速相机对装置的运行过程进行光学记录，用于验证和表征。</li>
	<li>使用注射泵以恒定流速（50–1,000 µL/h）驱动细胞悬液通过微流控 CODES 装置。</li>
	<li>使用锁相放大器测量阻抗调制信号。
	<ol>
		<li>将参考交流信号连接至锁相放大器的参考输入端，将差分双极性信号作为输入信号连接至锁相放大器。</li>
		<li>从锁相放大器输出端获取差分信号的有效值（RMS）幅值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过数据采集板以 1 MHz 的采样率将锁相放大器的输出信号采集至计算机，用于进一步分析。</li>
</ol>
7. 传感器信号的处理
<ol>
	<li>将记录的电学数据导入 MATLAB 进行后期处理和解码。</li>
	<li>在数字域中使用巴特沃斯滤波器（MATLAB 内置函数）对记录的信号进行滤波，以去除高频噪声（&#62;2.5 kHz）。</li>
	<li>从传感器信号生成模板码库。
	<ol>
		<li>识别设备中每个传感器对应的代表性非重叠码信号，并从数据集中提取这些信号片段作为独立的波形向量。</li>
		<li>通过信号功率对每个模板码波形向量进行归一化处理。使用 MATLAB 内置函数（bandpower）测量信号功率。</li>
		<li>使用 MATLAB 函数（resample）通过数字方式生成具有不同持续时间的归一化码信号版本，以扩展模板库，适应细胞在电极上流动速度的变化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在滤波后的波形中识别对应于传感器活动的信号片段（阈值：信噪比 SNR &#62; 12 dB）。信噪比低于该阈值的波形将被视为噪声。</li>
	<li>采用基于连续干扰消除的迭代算法对记录信号中各个传感器活动片段进行解码，该技术常用于多用户码分多址（CDMA）通信网络24,25。
	<ol>
		<li>使用滑动点积计算每个信号片段与模板库中所有模板的互相关。</li>
		<li>识别产生最大自相关峰值的模板，以确定主导的单个传感器码信号。记录该自相关峰值的时间和幅度。</li>
		<li>根据测得的自相关峰值幅度和时间信息（在步骤 7.5.2 中确定），通过缩放已识别的码模板构建估计的传感器码信号。</li>
		<li>从原始数据中减去估计的传感器码信号。</li>
		<li>从步骤 7.5.1 开始重复该过程，直到残差信号与模板库中的任何信号均无显著相似性，数学上定义为相关系数小于 0.5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用优化过程对步骤 7.5 得到的初始传感器信号估计值进行优化。
	<ol>
		<li>通过叠加每次迭代中估计的单个传感器信号重建信号。</li>
		<li>在原始估计值附近扫描单个传感器信号的幅度、持续时间和时序，基于最小二乘法逼近26，获得与记录的电信号最佳拟合的结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将电信号与光学图像进行校准，将估计传感器信号的幅度转换为细胞尺寸。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此前，多个电阻脉冲传感器已被集成到微流控芯片中28,29,30,31,32。在这些系统中，电阻脉冲传感器要么未实现多路复用28,29,30,31，要么需要各个传感器在不同频率下独立驱动32。在这两种情况下，芯片上的每个电阻脉冲传感器都需要专用的外部连接，因此若不增加硬件复杂性，便无法集成大量传感器。微流控 CODES（Microfluidic CODES）的重要优势在于，它能够在结构简单的设备中，通过单一输出端口同...

准确检测和分析悬浮在液体中的细胞、细菌或病毒等生物颗粒，对于多种应用具有重要意义1,2,3。微流控装置在尺寸上与这些生物颗粒相匹配，为此目的提供了独特优势，例如高灵敏度、温和的样品操作以及高度可控的微环境4,5,6,7。此外，微流控装置可被设计为结合流体动力学与力场，以被动分离具有不同特性的异质性生物颗粒群体8,9,10,11,12。在这些装置中，颗粒的分布结果可用作读出信号，但空间信息通常只能通过显微镜获取，这使得微流控装置必须依赖实验室基础设施，从而限制了其实际应用。因此，若能集成一种传感器，可在颗粒于微流控装置上被操控的同时实时报告其时空分布信息，则有望实现低成本、集成化的芯片实验室装置，这类装置在移动性高、资源有限的检测环境中尤为具有吸引力。
薄膜电极已被用作微流控装置中的集成传感器，适用于多种应用13,14。电阻脉冲传感（RPS）在微流道中对小颗粒进行集成检测方面尤其具有吸引力，因为它能够通过直接的电学测量提供一种稳定、灵敏且高通量的检测机制15。在RPS中，浸没于电解液中的一对电极之间的阻抗调制被用于检测颗粒。当颗粒穿过尺寸与其相近的孔隙时，电流中瞬态脉冲的数量和幅度分别用于颗粒计数和尺寸测定。此外，传感器几何结构可通过光刻分辨率进行设计，以调控电阻脉冲波形，从而提高检测灵敏度16,17,18,19，或用于估计颗粒在微流道中的垂直位置20。
我们最近提出了一种可扩展且简单的多重电阻脉冲传感技术，称为微流控编码正交电学检测技术（Microfluidic Coded Orthogonal Detection by Electrical Sensing, Microfluidic CODES）21。Microfluidic CODES 依赖于一个相互连接的电阻脉冲传感器网络，每个传感器由微加工电极阵列构成，能够以独特且可区分的方式调制导电性，从而实现多重检测。我们特别设计了每个传感器，使其产生类似于码分多址22（CDMA）通信网络中所用数字编码的正交电信号，因此即使来自不同传感器的信号发生干扰，也能从单一输出波形中唯一地还原出各个电阻脉冲传感器的信号。通过这种方式，该技术将颗粒在二维空间中的位置信息压缩为一维电信号，从而能够在微流控芯片的不同位置对颗粒进行监测，同时最大限度地降低器件和系统层面的复杂性。
本文介绍了一套详细的实验与计算方法操作流程，用于实现微流控 CODES 技术，并展示了该技术在模拟生物样品分析中的代表性应用结果。以包含四个多路复用传感器的原型器件结果为例，本文提供了以下方面的操作方案：（1）采用微流控 CODES 技术制备微流控器件的微加工工艺；（2）实验装置的组成说明，包括电子、光学和流体硬件；（3）用于解码来自不同传感器的干扰信号的计算机算法；（4）在微流控通道中对癌细胞进行检测与分析的结果。我们相信，其他研究人员可依据本文所述的详细操作流程，将本技术应用于各自的科研工作中。

<table><tbody><tr><td>98% 硫酸&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BDH Chemicals</td><td>BDH3074-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>30% 过氧化氢&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BDH Chemicals</td><td>BDH7690-3</td><td></td></tr><tr><td>三氯硅烷</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>235725-100G</td><td></td></tr><tr><td>NR9-1500PY 负性光刻胶</td><td>Furuttex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光刻胶显影液 RD6</td><td>Furuttex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>BDH Chemicals</td><td>BDH1101-4LP</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2015 负性光刻胶</td><td>Microchem</td><td>SU8-2015</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 显影液</td><td>Microchem</td><td>Y010200</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷 (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>BDH Chemicals</td><td>BDH1133-4LP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Amresco</td><td>K952-100ML</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>PHD 22/2000 注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2001</td><td></td></tr><tr><td>HF2LI 锁相放大器</td><td>Zurich Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HF2TA 电流放大器</td><td>Zurich Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-U 显微镜</td><td>Nikon Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS-Fi2 高清彩色相机&amp;nbsp;</td><td>Nikon Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>v7.3 高速相机</td><td>Phantom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCIe-6361 数据采集板&amp;nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>781050-01</td><td></td></tr><tr><td>BNC-2120 屏蔽连接器模块</td><td>National Instruments</td><td>777960-01&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PX-250 等离子体处理系统</td><td>Nordson MARCH&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于颗粒空间追踪的多路复用电子检测微流控平台

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

生物样本的微流控处理通常涉及在不同力场下对悬浮颗粒进行差异化操控，从而根据感兴趣的生物特性实现样本的空间分离。为了将所得的空间分布用作检测读数，微流控装置通常需要进行显微分析，而这依赖于复杂且成本较高、便携性较差的仪器设备。为克服这一局限，我们开发了一种集成化电子传感技术，可在微流控芯片的不同位置对颗粒进行多重检测。我们的技术称为微流控编码检测技术（Microfluidic CODES），它将电阻脉冲传感与码分多址技术相结合，将二维空间信息压缩为一维电信号。本文展示了微流控编码检测技术在多个微流控通道中分布的培养癌细胞的检测与尺寸分析方面的实际应用。通过高速显微镜验证，该技术能够完全以电子方式准确分析高密度的细胞群体，无需依赖外部仪器。因此，微流控编码检测技术有望推动低成本、集成化的芯片实验室设备的发展，特别适用于生物样本的即时检测。

一种微流控 CODES 装置，包含分布在四个微流控通道上的四个传感器，如图 1b所示。在该系统中，每个微流控通道的横截面设计为接近细胞尺寸，以确保（1）多个细胞无法并行通过电极上方，（2）细胞始终靠近电极，从而提高检测灵敏度。每个传感器设计为生成唯一的 7 位数字编码。随后使用细胞悬液对该装置进行测试。图 4展示了对应于四个独立传感器的记录电信号及其相应的理想数字编码。记录信号与理想的方波脉冲高度吻合，尽管存在微小偏差。这些偏差源于多种因素的综合作用，包括共面电极间非均匀电场、不同电极对之间的耦合效应、细胞的球形形态以及细胞在微流控通道中恒定的流动速度。我们基于记录的传感器信号构建了模板库。通过将记录信号与库中所有模板进行相关性比对，确定了产生最大自相关峰的模板（图 4）。由于各微流控通道的数字编码设计为相互正交，因此在此过程中可稳健地识别出主导的自相关峰。利用该方法，我们可计算确定细胞所通过的微流控通道、传感器信号持续时间，进而推算出细胞的流动速度。
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我们展示了一种集成表面电极网络的微流控平台，该平台结合了电阻脉冲传感（RPS）与码分多址（CDMA）技术，可实现多个微流控通道中颗粒的多重检测与尺寸测量。

生物样品的微流控处理通常涉及在不同力场作用下对悬浮颗粒进行差异化操控，以实现……

本实验的主要目标是展示一种微流控平台，该平台结合了电阻脉冲传感技术与码分多址技术，可在多个微流控通道中实现颗粒的多重检测与尺寸分析。这一技术被称为微流控 CODES，有助于实现完全集成且真正便携的芯片实验室装置，特别适用于资源有限环境下生物样本的即时检测。该技术的主要优势在于，能够通过电子方式追踪颗粒在微流控芯片上的空间与时间操控，从而无需显微镜等外部仪器。 我们的技术与软光刻兼容，可轻松集成到微流控装置中，用于颗粒的分馏，并提供类似于库尔特计数器的直接电子读出。开始构建微流控装置时，首先生成一组四个七位的金码。然后使用计算机辅助设计（CAD）软件（如 AutoCAD）根据这些金码设计四种独特的电极布局。最后，将设计好的电极布局的光掩膜交由光掩膜供应商进行制备。接着，将一片四英寸的硼硅酸盐玻璃晶圆浸入5:1的piranha溶液中，在120摄氏度下处理20分钟。清洗后，将晶圆置于加热板上，在200摄氏度下加热20分钟，以蒸发残留的水分。将洁净干燥的晶圆放入旋涂仪中。在晶圆上施加 2 毫升负性光刻胶溶液，以 3000 转/分钟的转速旋涂 40 秒。将旋涂后的晶圆置于热板上，在 150 摄氏度下烘干 1 分钟。用铬掩模覆盖晶圆，形成所需的电极图案。将带有掩模的光刻胶表面暴露于365纳米紫外光下，照射剂量为225毫焦每平方厘米。随后将曝光后的光刻胶在热板上于100摄氏度烘烤一分钟。将晶圆浸入光刻胶显影液中15秒，随后用去离子水轻轻喷洗图案化晶圆，并在氮气流下吹干。接着，将已形成图案的晶圆放入电子束金属蒸发仪中，在晶圆表面以每秒一埃的速率依次沉积20纳米厚的铬层和80纳米厚的金层。然后将镀有金属的晶圆在丙酮中进行超声加热处理30分钟，频率为40千赫兹，振幅为100%，以刻蚀下方的光刻胶。根据需要使用划片锯将晶圆切割成较小的片。开始制备微流控通道模具时，以与前述硼硅酸盐晶圆相同的方法清洗并干燥一片四英寸的硅晶圆。将硅片放入旋涂仪中，加入4毫升负性光刻胶溶液。先以500 rpm转速旋涂15秒，再以1,000 rpm转速旋涂15秒，最后以3,000 rpm转速旋涂60秒。将硅片正面朝上放置在浸有丙酮的无尘布上，以去除硅片背面及边缘残留的光刻胶。将晶圆在 65 摄氏度下烘烤 1 分钟，然后在 95 摄氏度下烘烤 2 分钟。将用于微流控通道的铬掩模图案放置在干燥的晶圆上。用 365 纳米紫外光以 180 毫焦每平方厘米的剂量曝光光刻胶，然后再次将晶圆在 65 摄氏度和 95 摄氏度下分别烘烤 1 分钟和 2 分钟。将已图形化的晶圆放入光刻胶显影液容器中，轻轻摇晃容器三分钟。用异丙醇冲洗显影后的晶圆，并在氮气气流下吹干。将晶圆在200摄氏度下烘烤30分钟，然后使用台阶仪检测光刻胶图形在晶圆表面的厚度是否均匀。将晶圆与一个敞口的培养皿（内含200微升三氯硅烷）一同放入真空干燥器中。让晶圆在干燥器中与三氯硅烷接触八小时，以实现晶圆表面的硅烷化。开始组装装置时，使用通用型洁净室胶带将硅晶圆模具固定在一个直径为150毫米的培养皿中。在培养皿中加入50克10:1比例的聚二甲基硅氧烷预聚物混合物，并在真空干燥器中脱气1小时。将脱气后的混合物在65摄氏度下固化至少4小时。使用解剖刀切下固化的PDMS层，然后用镊子将固化的层从模具上剥离。将PDMS切成小块。使用活检打孔器打出微流控通道的进样口和出样口孔。将PDMS层图案面朝下放置在透明胶带上，以清洁微加工表面。用丙酮、异丙醇和去离子水冲洗先前制备的带有玻璃基底的电极。在氮气流下干燥基底。将PDMS层和基底放入射频等离子体发生器中，功率设为100毫瓦，微机械面朝上。将微机械表面在氧气等离子体中活化处理30秒。随后使用光学显微镜将图案化的PDMS层与表面电极对齐。对齐后，使两表面接触，以将PDMS层密封在玻璃基底上。确保玻璃基底上的涂层电极图案与PDMS微流控通道正确对齐至关重要。正确对齐后，颗粒与表面电极的相互作用将产生用于多重检测的特定编码波形。将组装好的器件在70摄氏度下烘烤5分钟，玻璃面朝下。最后，将导线焊接到电极焊盘上，完成器件组装。开始实验时，将微流控器件放置在光学显微镜载物台上。将器件的参比电极连接至锁相放大器的信号输出端口，并施加400千赫的正弦波信号。将正极和负极传感器电极分别连接到两个独立的跨阻放大器。将两个跨阻放大器连接到锁相放大器的差分电压输入端，使正极传感器信号从负极传感器信号中减去。将锁相放大器的解调输出端连接到数据采集单元。在数据采集软件中，将锁相放大器输出的采样率设置为 1 兆赫兹。设置高速相机以光学方式记录显微镜下观察到的器件工作过程。将制备好的细胞悬液吸入注射器中。将样品注射器固定在注射泵上，并将注射器连接至进样通道。将出样通道导向废液容器。使用注射泵以恒定流速推动细胞悬液通过装置，同时记录阻抗调制信号。实验完成后，使用分析软件处理电学数据。将处理后的电信号与高速相机拍摄的图像进行比较，以建立细胞大小的校准曲线。将细胞悬液流经一种具有四种独特电极图案的微流控传感器装置，这些电极图案源自正交传感器编码。四个传感器的信号均来自单一的电信号输出。通过将记录的传感器信号与所有可能的编码进行相关性比对，识别出每个记录信号对应的独立传感器，从而产生清晰可辨的自相关峰。采用迭代算法解析了四个通道同时检测细胞时由干扰信号产生的波形。将记录的波形与所有可能的编码进行相关运算，并识别出最大的自相关峰。对应单个传感器信号被重建并从输入波形中减去。残余信号作为输入传递至下一次迭代，该过程持续进行，直至残余信号不再产生自相关峰为止。基于最小二乘法近似，采用优化算法对估计信号进行优化，以实现重构波形与原始记录波形之间的最佳拟合。随后，根据估计传感器信号的通道编号、幅度、持续时间及相对时序，确定细胞的位置、大小以及通过传感器的时间。通过将电信号与高速相机的光学测量结果进行比较，对该方法进行了验证。一旦掌握，该技术非常易于实施，因为从硬件角度来看，它极为简单。该技术不包含任何有源片上元件，可直接与软光刻技术兼容，且信号处理依赖于一种简单的计算算法。通过本实验方案，您可以制备带有基于编码的多重电传感器的微流控芯片，并解码电信号以实现生物分析测量。这种多功能、可扩展的电子传感技术可轻松整合到各种微流控装置中，通过在芯片上对粒子进行时空追踪，实现定量检测。观看本视频后，您将充分掌握微流控CODES技术的设计、制备与实施方法。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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