Name: 电池挤压作为一种强大的，微流控细胞内传送平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学习利用微流控装置通过机械变形将大分子无载体递送至靶细胞的方法。该技术适用于难转染细胞类型，在癌症免疫治疗与细胞重编程研究中具有重要应用价值。

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感谢 T. Shatova 在实验设计和数据分析方面的有益讨论。感谢 G. Paradis、麻省理工学院科赫研究所流式细胞术核心设施的工作人员以及麻省理工学院微系统技术实验室的工作人员提供的帮助和专业技术支持。本研究得到了美国国立卫生研究院资助项目 RC1 EB011187-02、DE013023、DE016516、EB000351 的支持，以及美国国家癌症研究所癌症中心支持（核心）资助项目 P30-CA14051 和 MPP-09Call-Langer-60 的部分支持。

1. 储存
<ol>
	<li>将储液池、支架、O型圈和微流控装置保存在70%乙醇中。使用容器（例如 带盖的广口瓶或烧杯，以防止蒸发以及灰尘或外界颗粒的污染。将装置放入第一个容器（1），储液器和O形圈放入第二个容器（2），支架放入第三个容器（3）。</li>
</ol>
注意：使用70%乙醇保存的目的是维持无菌状态。如果溶液的唯一组分是乙醇和水（即 无变性剂的情况下，所有系统组分应完全兼容，且不会随时间降解。
<ol start="2">
	<li>每次使用前更换容器（2）和（3）中的乙醇溶液，以防止实验间交叉污染，并减少可能导致堵塞的杂质颗粒。</li>
</ol>
2. 实验准备
<ol>
	<li>每次使用前，将容器（2）和（3）放入超声波清洗仪中处理 5–10 分钟&#160;，以去除先前实验中可能残留的污染颗粒。</li>
	<li>使用 70% 乙醇溶液清洁生物安全柜内的工作区域。</li>
	<li>将所有材料（3 个容器和镊子）在放入生物安全柜前喷洒 70% 乙醇溶液进行表面消毒。</li>
</ol>
3. 组装
<ol>
	<li>在工作区域放置 2-3 块低纤维脱落擦拭布。</li>
	<li>用镊子将塑料储液槽从容器中取出，置于擦拭纸上，以促进内表面乙醇溶液的蒸发。轻轻敲击储液槽表面，或向其中吹气，以促进乙醇溶液的去除。</li>
	<li>将O型圈插入储液槽的相应槽位中。</li>
	<li>从各自的容器中取出支架和芯片，并让乙醇挥发（约1-2分钟）。</li>
	<li>使用镊子将所需芯片正面朝上放置（即 在支架中对准芯片的定位孔（将定位孔朝上）。将装有芯片的支架抬升至与视线齐平，检查芯片是否平整地置于支架内，必要时用镊子进行调整。重要提示：若芯片在支架中未正确就位，后续步骤中存在芯片破损的风险。</li>
	<li>接下来，轻轻地将储液槽放置在支架上，并与卡扣对齐。在此过程中，注意确保O型圈不要从槽中脱落。</li>
	<li>轻轻按压储液池，直至其卡入到位。确保储液池两侧均已固定，并确认芯片处于正确位置。</li>
</ol>
4. 细胞制备
<ol>
	<li>对于贴壁细胞（原代细胞或已建立的细胞系）：在实验前1-2天接种细胞，确保实验当天细胞融合度不超过80%。</li>
	<li>将细胞置于悬浮状态（在PBS或相应培养基中），目标操作浓度为1.0 × 106 个细胞/ml&#160;至1.0 × 107 个细胞/ml。注意：我们未观察到细胞浓度对递送效率有显著影响。</li>
	<li>在另一管中混合细胞与目标递送物质，以获得实验所需的物质浓度。重要提示：由于所述递送方法依赖扩散作用实现递送，较高的物质浓度将导致更高的递送效率。如条件允许，建议初次试验使用1 µM的目标物质溶液，后续实验可根据需要逐步降低浓度。本设备已有报道使用的最低浓度为10 nM21。</li>
</ol>
5. 操作
<ol>
	<li>将细胞与递送材料的混合物移液至储液池中（当前设计的最大容量为 150 µl）。注意：大多数装置设计均为完全可逆，因此流体在通道中的流动方向无关紧要。样品可加载至两个储液池中的任意一个。</li>
	<li>将压力管连接至已填充的储液池，并拧紧螺母以确保密封良好（通常用手拧紧即可）。</li>
	<li>在调压阀上将压力调节至所需水平。此操作控制细胞通过装置的速度。请注意，按下按钮前细胞流动不会开始。</li>
</ol>
注意：在先前的研究中，氮气或压缩空气作为载气均表现出相同良好的效果。
<ol start="4">
	<li>将装置抬升至与视线齐平，并调整方向，使储液器中的液体清晰可见。注意：请监测液面高度，在储液器排空前关闭系统。</li>
	<li>按下按钮以加压储液池并启动细胞流动。</li>
	<li>当液面距离储液槽底部约 2 mm 时，迅速将调节器调至 0 psi 以停止流动。重要提示：若未在储液槽排空前及时停止流动，可能导致样品从收集储液槽中被喷出。另需注意，若液柱移动速度明显缓慢，或相较于初始流速显著减慢（例如 运行速度减慢3倍），表明安装的装置可能已堵塞，需要更换。使用堵塞的装置可能导致细胞死亡率升高。</li>
	<li>从相应的储存器中收集处理后的细胞，并将其放入所需的收集管/板中。重要提示：此阶段切勿将收集的细胞用任何缓冲液稀释，因为穿孔后的细胞在最多10分钟内会持续摄取物质20此时间窗过后，将细胞用所需的培养基/缓冲液稀释。</li>
	<li>如需收集更多处理过的细胞或尝试其他实验条件，可根据需要重复步骤 5.1–5.7。请注意，芯片具有可逆性，因此样品可加载至任意储液池中。若芯片发生堵塞，应及时更换。丢弃已堵塞的装置。</li>
</ol>
6. 拆卸
<ol>
	<li>轻轻推开卡扣臂，将储液槽从主支架上拆下。</li>
	<li>将各部件放入相应的储存容器中（详见第1节）。</li>
	<li>将使用过的芯片放入单独的容器中以待处理。</li>
</ol>

<ol><li>Schaffert, D., Wagner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+synthetic+polymer-based+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems.</a> Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).</li>
<li>Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knocking+down+barriers%3A+advances+in+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Knocking down barriers: advances in siRNA delivery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).</li>
<li>Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+therapeutics%3A+a+summary+and+pharmacological+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+by+Direct+Delivery+of+Reprogramming+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyvalent+Oligonucleotide+Gold+Nanoparticle+Conjugates+as+Delivery+Vehicles+for+Platinum%28IV%29+Warheads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).</li>
<li>Jiang, Z. -X., Zhang, Z. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+PTPs+with+small+molecule+inhibitors+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).</li>
<li>Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Delivery+of+Quantum+Dots+for+Live+Cell+Labeling+and+Organelle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking.</a> Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).</li>
<li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+Dots+for+Live+Cells+in+Vivo+Imaging%2C+and+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics.</a> Science. 307, 538-544 (2005).</li>
<li>Dahan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+Dynamics+of+Glycine+Receptors+Revealed+by+Single-Quantum+Dot+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking.</a> Science. 302, 442-445 (2003).</li>
<li>Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+Silica+Nanoparticles+for+Intracellular+Delivery+of+Membrane-Impermeable+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).</li>
<li>Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+development+of+polymers+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Design and development of polymers for gene delivery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).</li>
<li>Joseph, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipids+used+in+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cationic lipids used in gene transfer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-structure-regulated+cell-membrane+penetration+by+monolayer-protected+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles.</a> Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).</li>
<li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+intracellular+protein+delivery+platform+based+on+single-protein+nanocapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules.</a> Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).</li>
<li>Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotube+Molecular+Transporters%3A+Internalization+of+Carbon+Nanotube-Protein+Conjugates+into+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).</li>
<li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+escape+pathways+for+delivery+of+biologicals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.</a> Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).</li>
<li>li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+Gene+Therapy%3A+New+Developments+In+Vivo+and+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro.</a> Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).</li>
<li>Fox, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cells+in+microfluidic+devices%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cells in microfluidic devices: a review.</a> Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).</li>
<li>Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonoporation%3A+Mechanical+DNA+Delivery+by+Ultrasonic+Cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+and+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation.</a> Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).</li>
<li>Sharei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vector-free+microfluidic+platform+for+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonendocytic+Delivery+of+Functional+Engineered+Nanoparticles+into+the+Cytoplasm+of+Live+Cells+Using+a+Novel%2C+High-Throughput+Microfluidic+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device.</a> Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).</li>
</ol>

作者 Armon Sharei、Robert Langer 和 Klavs F. Jensen 是 SQZ Biotechnologies 公司的股东，该公司生产本文所使用的微流控设备。

所述实验步骤的某些方面（即 除了芯片设计和运行速度之外的其他因素可能需要根据系统所应用的细胞类型和递送材料进行优化。以下讨论涉及实验设计时需考虑的一些最常见因素。
为了提高荧光标记化合物的递送信号，需要解决背景荧光的来源问题。例如，可在递送后5–10分钟内洗涤细胞，以在培养或进一步处理前去除多余的物质，从而减少表面结合和内吞作用的影响。如果选择省略洗涤步骤，则最好将处理后的细胞在目标培养基中稀释5–10倍，以降低周围溶液中目标物质的浓度，从而减少内吞速率。在某些情况下（例如蛋白质递送），可能需要主动阻断细胞表面（例如使用未标记的牛血清白蛋白），以最大限度地减少递送材料的非特异性结合。在特定应用中，若通过流式细胞术测得未处理组的荧光强度比内吞对照组低一个数量级以上，则表面结合或内吞作用可能构成干扰因素。需要注意的是，背景信号问题仅与递送材料的直接荧光检测相关；而功能检测（例如细胞重编程）通常不受影响，因为被内吞或表面结合的材料通常不具备活性。
为了提高细胞处理后的存活率，需要...

将大分子递送至细胞质是治疗和科研应用中的关键步骤。例如，纳米颗粒介导的递送在基因治疗1,2中已显示出潜力，而蛋白质递送则是在临床3和实验室4环境中调控细胞功能的一种有前景的方法。其他材料，如小分子药物、量子点或金纳米颗粒，在从癌症治疗5,6到细胞内标记7,8以及单分子示踪9等多种应用中也备受关注。
细胞膜对大分子物质通常具有高度不通透性。许多现有技术利用聚合物纳米颗粒10,11、脂质体12或化学修饰13来促进膜的破坏或通过内吞作用递送物质。在这些方法中，递送效率和细胞存活率往往依赖于目标分子的结构和细胞类型。这些方法在递送结构均一的物质（如核酸）时可能较为高效，但通常不适用于结构更为多样的物质（如蛋白质14,15和纳米材料7）的递送。此外，大多数此类方法所依赖的内体破裂机制常常效率低下，导致大量物质滞留在囊泡结构中16。最后，许多为常用细胞系开发的方法在应用于原代细胞时效果不佳。
在某些应用中，膜穿孔方法（如电穿孔17,18和声穿孔19）是一种有吸引力的替代方案；然而，这些方法可能导致细胞存活率较低，并且可能受到目标递送材料电荷的限制。
细胞的快速机械变形是一种基于微流控技术的递送方法，近年来在细胞重编程20和纳米材料递送21方面展现出相较于现有技术的优势。该方法依赖于对细胞膜的机械性扰动，以促进周围缓冲液中物质向细胞质内的递送。该系统已在以往难以处理的细胞类型（例如原代免疫细胞和干细胞）以及材料（例如抗体和碳纳米管）中展现出显著的应用潜力。本文描述了利用此类装置实现靶向大分子胞内递送的一般操作流程。该流程可广泛适用于大多数细胞类型和递送材料；然而，对于此前未报道过的应用，建议根据我们先前发表的设计指南20对实验条件进行简要优化。迄今为止，该系统已成功用于RNA、DNA、金纳米颗粒、量子点、碳纳米管、蛋白质以及葡聚糖聚合物的递送20,21。

<table><tbody><tr><td>设备支架 &amp;和塑料储液槽</td><td>SQZ 生物技术公司</td><td>支架</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa 分析仪</td><td>Becton Dickinson</td><td>N/A</td><td>科赫研究所核心设施所使用的流式细胞仪</td></tr><tr><td>微流控装置</td><td>SQZ 生物技术公司</td><td>细胞挤压</td><td></td></tr><tr><td>O型圈</td><td>麦克马斯特</td><td>9452K311</td><td></td></tr><tr><td>操作设备用压力系统</td><td>SQZ 生物技术公司</td><td>压力系统</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

细胞挤压作为一种稳定且基于微流控的细胞内递送平台

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

细胞的快速机械变形已成为一种有前景的无载体方法，可用于大分子和纳米材料的细胞内递送。该技术在应对以往具有挑战性的应用方面展现出潜力，包括向原代免疫细胞递送、细胞重编程、碳纳米管以及量子点的递送。这种无载体微流控平台依赖于细胞膜的机械性破坏，以促进目标物质向细胞质的递送。本文详细描述了此类微流控装置的使用方法，包括装置组装、细胞准备及系统操作。对于此前未报道的应用，该递送方法需对装置类型和操作条件进行简要优化。所提供的操作说明可广泛适用于大多数细胞类型和递送材料，因为该系统无需特殊缓冲液或化学修饰/偶联步骤。本研究还提供了提升装置性能的建议，并针对堵塞、递送效率低以及细胞活力差等潜在问题给出了故障排除方案。

图1展示了微流控递送系统的示意图。图2a-b展示了在存在荧光标记的3 kDa葡聚糖20的条件下，使用不同装置设计处理HeLa细胞的典型结果。如果操作步骤正确，系统性能将对装置类型和运行速度敏感。因此，在进行更复杂的实验之前，应针对特定应用优化这些条件。在图中所示的操作条件下，细胞存活率保持在80%以上；然而必须注意，次优的递送参数（例如不合适的芯片类型）可能导致存活率低于30%。因此，对于任何此前未报道过的细胞类型，必须同时优化细胞存活率和递送效率。如果装置设计不适合目标细胞类型，结果可能从无递送效果到细胞大量死亡（例如存活率为10%）不等。如果实验条件不合适，例如目标物质结合到细胞表面，则可能无法准确测量递送效果，因为表面结合信号可能掩盖细胞质内的信号。
图2c-d 展示了我们在活细胞群体中测量递送效率的首选方法。图2c 中的对照组旨在反映细胞暴露于递送材料时所产生的全部表面结合和内吞效应...

细胞的快速机械变形已成为一种有前景的无载体方法，可用于将大分子和纳米材料递送至细胞内。本方案详细介绍了如何将该系统应用于多种不同场景的操作步骤。

快速机械变形细胞已成为一种颇具前景的无载体方法，可用于将大分子和纳米材料递送至细胞内。

落管实验的总体目标是通过机械扰动，将大分子无载体地递送至靶细胞。该过程首先将靶细胞与所需的递送材料混合成悬液，并装入特制微流控装置的储液腔中。第二步，对微流控装置加压，使细胞在压力驱动下流经一组微流控通道，通道的狭窄结构会挤压细胞，从而实现细胞膜的瞬时可逆性破坏。接下来，让细胞在目标递送材料存在的情况下孵育，以促进该材料扩散进入细胞质。在此期间，细胞膜得以修复。通过流式细胞术获得的结果显示，大分子已成功递送。与现有的转染和脂质体转染等方法相比，该技术的主要优势在于能够有效处理其他方法难以转导的细胞类型和材料。该方法可解答生物学领域的一些关键问题，例如如何提高细胞重编程效率。该技术的应用前景还延伸至癌症的治疗与诊断，因为该系统能够操控免疫细胞，从而增强其抗肿瘤效果。首先，制备或购买此处所示的微流控装置、装置支架、塑料流体储液池和O型圈（具体细节见随附的文字版实验方案），然后将三个可密封容器部分装满70%乙醇。将装置放入第一个容器中，储液池和O型圈放入第二个容器中，支架放入第三个容器中。随后，将三个容器剩余空间完全用70%乙醇填满。接下来，在使用前将装有储液池和O型圈的容器以及装有支架的容器放入超声波清洗仪中处理5到10分钟。这有助于去除之前实验残留的任何污染物，同时在生物安全柜中用70%乙醇擦拭工作台面。然后用70%乙醇擦拭所有所需材料（包括三个容器和一对镊子）进行灭菌，并将其放入生物安全柜中，准备开始组装。首先，在工作区域放置两到三张低尘擦拭纸。然后用镊子将乙醇容器中的塑料储液槽取出，并将其置于擦拭纸上，以促进储液槽内表面乙醇的毛细吸附和挥发。轻轻敲击储液槽，以帮助去除残留的乙醇溶液。如有必要，使用加压气体将储液槽彻底吹干。待储液槽干燥后，将O型圈插入储液槽对应的槽位中。然后使用镊子将芯片正面朝上放入装置 holder 中。确保芯片平整地放置在支架中，必要时使用镊子进行调整。如果芯片无法正确安装到支架中，则在后续步骤中存在破损的风险。接下来，将储液池轻轻放置在支架上，并与卡扣对齐。确保 O 型密封圈不会从槽中脱落。在此过程中，轻轻按压储液槽，直至其卡入到位。确保储液槽两侧均已固定，且芯片位置正确。切勿用力按压储液池，因为压力可能导致芯片破裂，影响原代细胞或贴壁细胞的培养。细胞系应在实验前一至两天接种，使其在实验时融合度不超过80%。实验当天，在实验开始前立即收集细胞，并将其重悬于培养基或其他所需的缓冲液中，细胞浓度为每毫升100万至1000万个细胞。然后将细胞悬液小心地通过40微米的细胞筛网，以防止细胞团块和基质堵塞装置。过滤后，取300微升细胞悬液，与所需浓度的递送材料在另一试管中混合。本演示中，每50微升细胞悬液加入2微升浓度为5毫克/毫升的葡聚糖，以及2微升Alexa 488同位素对照抗体。接下来，用移液器轻柔地混匀 100 微升细胞。然后使用凝胶上样枪头，将细胞和递送材料移入其中一个储液槽中，将压力管连接至装满的储液槽，并用手指拧紧结以确保适当密封。随后将调节器上的气压调整至 70 PSI，以控制细胞通过装置时的速度。应针对每个实验中使用的特定细胞和微流控芯片组合优化压力。一切准备就绪后，将装置升至与视线齐平的位置，并调整方向，使储液池中的液体清晰可见。然后按下按钮阀，对储液池加压，启动细胞流动。观察液体从储液器流出的速度。如果液体流速明显低于初始流速，则表明安装的装置可能已堵塞，需要更换。堵塞引起的剪切力增加将导致高于正常水平的细胞死亡。当液面距离储液槽底部约两毫米时，迅速将调节器调至零 PSI 以停止液体流动。必须在储液槽排空之前停止气流，否则样品可能会被喷出收集储液槽。随后，从流出储液槽中收集处理后的细胞，并将其转移至微量离心管中。在室温下，这些细胞将持续摄取物质长达10分钟。10分钟后，向细胞中加入额外培养基进行培养，或根据实验需求继续使用细胞。重复这些步骤以收集所需数量的处理后细胞；若芯片发生堵塞，可按需更换芯片，并在后续每份样品处理中丢弃已堵塞的C型装置。改变流动方向以尽量减少堵塞效应。收集细胞结束后，轻轻拨开卡扣臂，将储液槽从主支架上拆下。然后将需要重复使用的各部件放入相应的储存容器中，并用新鲜的70%乙醇充满。最后，将所有使用过的芯片放入单独的容器中，以进行妥善处理。检测了HeLa细胞的递送效率和细胞活力。经过一系列实验，测试了三种不同的微流控芯片，在最高达600毫米每秒的速度范围内进行了评估。这些实验结果表明，在所测试的每种芯片中，提高流速均能改善荧光标记的三聚糖精（3 kDa）向细胞内的递送效果。此外，流速提高也会导致测试装置中细胞活力下降约20%。该程度的细胞死亡相对较低，在设计不当的装置中，细胞死亡率通常要高得多。左侧所示对照细胞群体对太平洋蓝标记的葡聚糖的摄取，主要是由于有限的表面结合和内吞作用所致。这些细胞与处理组细胞暴露于递送材料的时间相同。右侧为在暴露于与对照组相同浓度的葡聚糖条件下，通过微流控装置的活细胞群体。阴影区域内的细胞被视为未递送，而分界线右侧的细胞则定义为已递送。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一小时内完成。在完成此操作后，还可进行其他方法，如后续眼科检查，以在技术开发后进一步回答递送效率和材料功能等其他问题。该技术为再生医学领域的研究人员利用直接蛋白递送方法探索成年原代细胞的细胞重编程铺平了道路。观看本视频后，您应能充分了解如何针对所需应用搭建并操作自挤压系统。

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JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

电池挤压作为一种强大的，微流控细胞内传送平台

使用微流控装置捕获细胞

一种新型的微流控系统已利用被动泵送现象和用户可控的流体输送系统开发而成。鉴于其成本低、操作简便、体积精确、速度快、可重复性和自动化等优点，该微流控系统有望广泛应用于多种生物学领域。...

基于液滴的高速被动泵送微流控装置递送系统

结合单分散液滴生成与细胞及颗粒的惯性有序排列，我们描述了一种在千赫兹速率下单个液滴内封装特定数量细胞或颗粒的方法。对于单颗粒和双颗粒液滴，该方法的封装效率是无序封装的两倍以上。...

高通量单细胞与多细胞微封装

我们开发了一种用于微尺度细胞刺激实验的自动化细胞培养与检测平台。该平台在培养和刺激少量细胞群体以及回收裂解液用于分子分析方面，具有操作简便、功能多样和控制精确的优点。该平台非常适合使用珍贵细胞和/或试剂的研究。...

一种用于微尺度细胞刺激实验的多功能自动化平台

通过微流控喷射技术作用于液滴界面脂双层，可可靠地生成具有可控膜不对称性、跨膜蛋白整合及物质包封能力的囊泡。该技术可用于研究多种需要区室化生物分子的生物系统。...

利用微流控喷射技术生成脂质双层囊泡

开发了一种微流控涡旋辅助电穿孔平台，可对相同细胞群体依次递送多种分子，并实现精确且独立的剂量控制。在电穿孔前进行的基于尺寸的目标细胞纯化步骤，有助于提高分子递送效率和处理后细胞的存活率。...

用于顺序分子递送的微尺度涡流辅助电穿孔仪

本文介绍了一种利用微流控平台分离和培养单细胞的实验方案，该平台采用了一种新型的微孔设计概念，可实现高效的单细胞分离和长期克隆培养。...

一种用于高通量单细胞分离与培养的微流控平台

制备了一种微流控芯片，用于生成成对的金点以实现串联气泡产生，并在附近形成纤维连接蛋白包被的岛状结构用于单细胞图案化。通过粒子图像测速技术对所产生的流场进行了表征，并用于研究多种生物效应，包括细胞膜穿孔、膜形变以及细胞内钙离子响应。...

一种带有表面图案化的微流控系统，用于在单细胞水平上研究空化气泡与细胞的相互作用及其产生的生物效应

本方案描述了一种低成本声流控装置的组装与操作方法，该装置通过超声造影剂诱导的声孔效应，实现分子对细胞的快速递送。...

用于增强分子化合物向细胞递送的声流控装置的组装与操作

本方案描述了一种微流控系统的设计、制备和表征方法，该系统能够自动排列、固定并精确压缩数百个黑腹果蝇（Drosophila...

通过高通量微流控压缩系统对多细胞生物体进行机械刺激

学习利用微流控装置通过机械变形将大分子无载体递送至靶细胞的方法。该技术适用于难转染细胞类型，在癌症免疫治疗与细胞重编程研究中具有重要应用价值。

细胞挤压作为一种稳定且基于微流控的细胞内递送平台

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