电池挤压作为一种强大的，微流控细胞内传送平台
2013年11月7日
细胞的快速机械变形已成为细胞内输送大分子和纳米材料的一种很有前途的，矢量-free方法。这个协议提供了关于如何使用该系统进行范围广泛的应用中的详细步骤。
下降实验的总体目标是使用机械破碎将大分子载体自由地递送到靶细胞。这是通过首先将目标细胞类型与所需的递送材料一起置于悬浮液中，然后加载到专门设计的微流体装置的储液器中来实现的。作为第二步，微流体装置被加压，细胞被驱动通过一系列微流体通道，这些通道挤压细胞以促进瞬时膜破坏。
接下来，让细胞在靶标递送材料存在下孵育，以促进材料扩散转运到细胞质中。当细胞膜被修复时。获得的结果表明，通过使用流式细胞术有效递送大分子。
与现有方法（如 ation 和 lipo perfection）相比，该技术的主要优势在于，它能够解决其他方法无法有效提供的具有挑战性的细胞类型和材料。这种方法可以回答生物领域的关键问题，例如如何改进细胞重编程。该技术的意义延伸到癌症的治疗和诊断，因为该系统能够纵免疫细胞以增强其抗肿瘤功效。
首先，制造或购买此处显示的微流体装置、装置支架、塑料储液罐和 O 形圈，并在随附的文本协议中列出详细信息，然后用 70% 乙醇中途填充三个可密封容器。将设备放在第一个容器中，将储液槽和 O 形圈放在第二个容器中，将支架放在第三个容器中。然后用 70% 乙醇填充容器的其余部分。
接下来，放置装有储液槽和 O 形圈的容器以及装有支架的容器，在使用前将超声波浴中放置 5 到 10 分钟。这将有助于去除先前实验中的任何污染颗粒，同时组件用 70% 乙醇在生物安全柜中擦拭工作空间。然后用 70% 乙醇擦拭包括三个容器和一对镊子在内的所有必需材料，然后将它们放入生物安全柜内开始组装。
首先，在工作区域放置两到三块低绒毛湿巾。然后用镊子从乙醇容器中取出塑料储液器，并将它们放在湿巾上，以促进乙醇从其内表面吸出和蒸发。轻轻敲击储液槽以帮助去除乙醇溶液。
如有必要，使用加压气体完全吹扫储液罐。储液槽干燥后，将 O 形圈插入储液槽上的相应插槽中。然后使用镊子将芯片正面朝上放入设备支架中。
确保芯片平放在支架中，必要时使用镊子进行调整。如果设备不能正确安装在其支架中，则有可能在后续步骤中损坏。接下来，轻轻地将储液槽放在支架上，并将它们与夹子对齐。
确保 O 形圈不会从插槽中脱落。在此过程中，轻轻按压储液槽，直至它们卡入到位。确保储液槽的两侧都牢固，并且芯片似乎处于正确的位置。
不要用力按压储液槽。因为压力可能会打破初级或粘附的芯片。细胞系，在实验前一到两天放置细胞，使它们的汇合度不超过 80%。
在实验当天。在实验前，立即收获细胞并复苏，将它们以每毫升 1 到 1000 万个细胞的浓度悬浮在培养基或其他所需的缓冲液中。然后小心地将细胞悬液穿过 40 微米细胞过滤器网，以防止细胞团块和基质堵塞装置。
过滤后，将 300 μL 细胞悬液与所需浓度的递送材料混合在单独的试管中。在这个演示中，使用了 2 微升糊精（每毫升 5 毫克）和 2 微升 Alexa。每 50 μL 细胞悬液添加 4 88 种同位素对照抗体。
接下来，通过移液轻轻混合 100 μL 细胞。然后使用凝胶加载吸头，将细胞和输送材料移液到任一储液槽中，将压力管连接到装满的储液槽上，并用手拧紧结以确保正确的天花板。然后将调节器上的气压调节至 70 PSI，以控制细胞通过设备的速度。
应针对每个实验中使用的特定电池和微流体芯片组合优化压力。一切准备就绪后，将设备抬高至与眼睛齐平并调整其方向，以便储液槽中的液体易于看到。然后按下按钮阀，对储液槽加压并开始细胞流速。
观察流体从储液罐中流出的速度。如果流体相对于其初始流速明显减慢，则安装的设备可能已堵塞，需要更换。阻塞引起的剪切力增加将导致比正常细胞死亡更大的细胞死亡。
当液位距离储液罐底部约 2 毫米时，迅速将调节器调至零 PSI 以停止流动。在储液槽排空之前停止空气流动非常重要，否则样品可能会从收集储液槽中喷出。然后从流出容器中收集处理过的细胞，并将其放入微量离心管中。
在室温下，额定电池将继续吸收材料长达 10 分钟。10 分钟后，用额外的培养基接种细胞，或根据实验需要继续使用细胞。重复这些步骤以收集所需数量的处理细胞，如果芯片堵塞并丢弃 C 堵塞的装置，则根据需要更换芯片，用于每个后续样品。
更改流向以最大程度地减少堵塞效果。收集完细胞后，将夹臂推到一边，轻轻断开储液槽与主支架的连接。然后将每个要重复使用的部分放入适当的储存容器中，并用新鲜的 70% 乙醇填充它们。
最后，将所有用过的芯片放入单独的容器中进行妥善处理。测量 hela 细胞的递送效率和细胞活力。经过一系列实验，以高达每秒 600 毫米的速度测试了三种不同的微流体芯片。
这些测试表明，对于每个测试的芯片，增加的流速改善了荧光偶联的 3 道尔顿糊精向细胞的输送。此外，速度的提高也导致测试设备中的细胞活力下降了约 20%。这个细胞死亡量相对较低，并且在设计不适当的设备中通常要高得多。
Pacific blue 偶联糊精被左图所示的对照细胞群的摄取是有限的表面结合和内吞作用的结果。因为细胞暴露于递送材料的时间与处理过的细胞相同。右边是活细胞群，它们在暴露于与对照细胞相同浓度的糊精时通过微流体装置。
阴影区域中的单元格被视为未送达，而线条右侧的单元格被定义为已送达。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一小时内完成。按照这个程序，可以执行其他方法，寿命验光后 为了回答其他问题，如交付效率和材料功能 开发后。
这项技术为再生医学领域的研究人员使用直接蛋白质递送探索成体原代细胞中的细胞编程铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何为所需应用设置和作自挤压系统有很好的了解。
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概述
本文介绍了一种通过快速机械变形将大分子传递到目标细胞的无载体方法。该协议概述了使用微流控装置来促进这一过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 微流控技术
- 细胞内传递技术
背景
- 机械破坏为将材料传递到细胞中提供了一种新方法。
- 该方法可以针对难以转染的挑战性细胞类型。
- 它在癌症治疗和免疫细胞操作中有潜在应用。
- 使用流式细胞术来评估传递的有效性。
研究目的
- 开发一种高效的大分子细胞内传递方法。
- 提高对细胞重编程技术的理解。
- 提高免疫细胞对肿瘤的治疗效果。
使用的方法
- 微流控装置的制造和灭菌。
- 细胞悬液和传递材料的准备。
- 微流控装置的加压以诱导细胞变形。
- 使用流式细胞术分析来评估传递成功率。
主要结果
- 成功将大分子传递到目标细胞中。
- 流式细胞术确认了有效的细胞内摄取。
- 该方法比传统传递技术表现出优势。
- 突出了在癌症治疗中的潜在应用。
结论
- 这种机械传递方法是针对挑战性细胞类型的一种有前景的替代方法。
- 它为细胞操作和治疗研究开辟了新的途径。
- 需要进一步研究以优化该技术的各种应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Vector-free intracellular delivery remains a critical bottleneck in therapeutic development, particularly for primary immune cells and hard-to-transfect cell types. This microfluidic squeezing platform enables direct cytosolic delivery of macromolecules and nanomaterials without chemical modification or specialized buffers, reducing mechanistic ambiguity in target validation. By improving delivery efficiency in challenging systems, the method supports predictive confidence in early discovery and de-risks translational pathways for immunotherapy and regenerative medicine applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of therapeutic hypotheses in primary immune cells and reprogramming models.
- Operational Value: Provides a reproducible, buffer-free system for delivering transcription factors, antibodies, or nucleic acids to assess target engagement.
- Predictive Value: Supports go/no-go decisions by confirming intracellular delivery of effector molecules prior to functional assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, flow-cytometry-based readouts of delivery efficiency across cell types and material concentrations.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through controlled shear rates and device geometry, minimizing variability in high-throughput screens.
- Assay Readiness: Outputs delivery percentage and viability metrics that enable compound or material ranking in lead identification workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-scale immune cell modulation to preclinical evaluation of enhanced anti-tumor efficacy.
- Mechanistic De-risking: Confirms cytosolic delivery of immunomodulatory proteins, reducing reliance on endogenous expression systems.
- Disease-Relevant Systems: Supports testing in primary T cells, dendritic cells, and stem cells relevant to cancer immunotherapy and regenerative medicine.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing in early biology, assay-ready sample generation for screening, and mechanistic validation prior to in vivo studies.
- Discovery Biology: Facilitates target validation by delivering CRISPR components, siRNAs, or antibodies to confirm pathway involvement in immune activation or cell fate.
- Screening: Delivers libraries of nanomaterials or peptides to immune cells for uptake and functional screening under standardized shear conditions.
- Analytics: Provides flow cytometry-derived delivery efficiency and viability percentages as quantitative endpoints for condition comparison.
- Translational Research: Enables preclinical testing of engineered immune cells with delivered payloads to assess tumor-killing activity in co-culture models.
- Enterprise Reuse: Platform design allows reuse across cell types and payloads with only pressure and chip optimization, supporting scalable deployment in discovery and process development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces false negatives in target validation by achieving delivery in primary and non-dividing cells where viral or lipid-based methods fail.
- Operational Value: Eliminates need for payload conjugation, specialized buffers, or viral production, simplifying workflow and reducing cost per condition.
- Strategic Value: Increases confidence in early-stage immunomodulatory candidates by confirming intracellular delivery before resource-intensive animal studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of delivery-dependent biologics, such as cytokine engagers or transcription factor therapies, based on achievable cytosolic concentrations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, cell suspension preparation, and pressure regulation to avoid clogging or excessive shear-induced death.
- Depends on access to microfluidic chips, pressure regulators, reservoir systems, and flow cytometry for readout; compatible with standard biosafety cabinet workflows.
- Necessitates standardization of cell concentration (1–10 million/mL), pre-straining through 40 µm filters, and incubation time (≤10 min post-delivery) for reproducibility across users and sites.
- Requires optimization of pressure (e.g., 70 PSI) and flow speed per cell type and chip design to balance delivery efficiency and viability, with viability loss typically <20% under optimized conditions.
- Limited by potential clogging from aggregates or debris, necessitating cell straining and regular chip exchange; performance varies with cell size, membrane stiffness, and payload molecular weight.
