细胞挤压作为一种稳定且基于微流控的细胞内递送平台

落管实验的总体目标是通过机械扰动，将大分子无载体地递送至靶细胞。该过程首先将靶细胞与所需的递送材料混合成悬液，并装入特制微流控装置的储液腔中。第二步，对微流控装置加压，使细胞在压力驱动下流经一组微流控通道，通道的狭窄结构会挤压细胞，从而实现细胞膜的瞬时可逆性破坏。

接下来，让细胞在目标递送材料存在的情况下孵育，以促进该材料扩散进入细胞质。在此期间，细胞膜得以修复。通过流式细胞术获得的结果显示，大分子已成功递送。

与现有的转染和脂质体转染等方法相比，该技术的主要优势在于能够有效处理其他方法难以转导的细胞类型和材料。该方法可解答生物学领域的一些关键问题，例如如何提高细胞重编程效率。该技术的应用前景还延伸至癌症的治疗与诊断，因为该系统能够操控免疫细胞，从而增强其抗肿瘤效果。

首先，制备或购买此处所示的微流控装置、装置支架、塑料流体储液池和O型圈（具体细节见随附的文字版实验方案），然后将三个可密封容器部分装满70%乙醇。将装置放入第一个容器中，储液池和O型圈放入第二个容器中，支架放入第三个容器中。随后，将三个容器剩余空间完全用70%乙醇填满。

接下来，在使用前将装有储液池和O型圈的容器以及装有支架的容器放入超声波清洗仪中处理5到10分钟。这有助于去除之前实验残留的任何污染物，同时在生物安全柜中用70%乙醇擦拭工作台面。然后用70%乙醇擦拭所有所需材料（包括三个容器和一对镊子）进行灭菌，并将其放入生物安全柜中，准备开始组装。

首先，在工作区域放置两到三张低尘擦拭纸。然后用镊子将乙醇容器中的塑料储液槽取出，并将其置于擦拭纸上，以促进储液槽内表面乙醇的毛细吸附和挥发。轻轻敲击储液槽，以帮助去除残留的乙醇溶液。

如有必要，使用加压气体将储液槽彻底吹干。待储液槽干燥后，将O型圈插入储液槽对应的槽位中。然后使用镊子将芯片正面朝上放入装置 holder 中。

确保芯片平整地放置在支架中，必要时使用镊子进行调整。如果芯片无法正确安装到支架中，则在后续步骤中存在破损的风险。接下来，将储液池轻轻放置在支架上，并与卡扣对齐。

确保 O 型密封圈不会从槽中脱落。在此过程中，轻轻按压储液槽，直至其卡入到位。确保储液槽两侧均已固定，且芯片位置正确。

切勿用力按压储液池，因为压力可能导致芯片破裂，影响原代细胞或贴壁细胞的培养。细胞系应在实验前一至两天接种，使其在实验时融合度不超过80%。

实验当天，在实验开始前立即收集细胞，并将其重悬于培养基或其他所需的缓冲液中，细胞浓度为每毫升100万至1000万个细胞。然后将细胞悬液小心地通过40微米的细胞筛网，以防止细胞团块和基质堵塞装置。

过滤后，取300微升细胞悬液，与所需浓度的递送材料在另一试管中混合。本演示中，每50微升细胞悬液加入2微升浓度为5毫克/毫升的葡聚糖，以及2微升Alexa 488同位素对照抗体。

接下来，用移液器轻柔地混匀 100 微升细胞。然后使用凝胶上样枪头，将细胞和递送材料移入其中一个储液槽中，将压力管连接至装满的储液槽，并用手指拧紧结以确保适当密封。随后将调节器上的气压调整至 70 PSI，以控制细胞通过装置时的速度。

应针对每个实验中使用的特定细胞和微流控芯片组合优化压力。一切准备就绪后，将装置升至与视线齐平的位置，并调整方向，使储液池中的液体清晰可见。然后按下按钮阀，对储液池加压，启动细胞流动。

观察液体从储液器流出的速度。如果液体流速明显低于初始流速，则表明安装的装置可能已堵塞，需要更换。堵塞引起的剪切力增加将导致高于正常水平的细胞死亡。

当液面距离储液槽底部约两毫米时，迅速将调节器调至零 PSI 以停止液体流动。必须在储液槽排空之前停止气流，否则样品可能会被喷出收集储液槽。随后，从流出储液槽中收集处理后的细胞，并将其转移至微量离心管中。

在室温下，这些细胞将持续摄取物质长达10分钟。10分钟后，向细胞中加入额外培养基进行培养，或根据实验需求继续使用细胞。重复这些步骤以收集所需数量的处理后细胞；若芯片发生堵塞，可按需更换芯片，并在后续每份样品处理中丢弃已堵塞的C型装置。

改变流动方向以尽量减少堵塞效应。收集细胞结束后，轻轻拨开卡扣臂，将储液槽从主支架上拆下。然后将需要重复使用的各部件放入相应的储存容器中，并用新鲜的70%乙醇充满。

最后，将所有使用过的芯片放入单独的容器中，以进行妥善处理。检测了HeLa细胞的递送效率和细胞活力。经过一系列实验，测试了三种不同的微流控芯片，在最高达600毫米每秒的速度范围内进行了评估。

这些实验结果表明，在所测试的每种芯片中，提高流速均能改善荧光标记的三聚糖精（3 kDa）向细胞内的递送效果。此外，流速提高也会导致测试装置中细胞活力下降约20%。该程度的细胞死亡相对较低，在设计不当的装置中，细胞死亡率通常要高得多。

左侧所示对照细胞群体对太平洋蓝标记的葡聚糖的摄取，主要是由于有限的表面结合和内吞作用所致。这些细胞与处理组细胞暴露于递送材料的时间相同。右侧为在暴露于与对照组相同浓度的葡聚糖条件下，通过微流控装置的活细胞群体。

阴影区域内的细胞被视为未递送，而分界线右侧的细胞则定义为已递送。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一小时内完成。在完成此操作后，还可进行其他方法，如后续眼科检查，以在技术开发后进一步回答递送效率和材料功能等其他问题。

该技术为再生医学领域的研究人员利用直接蛋白递送方法探索成年原代细胞的细胞重编程铺平了道路。观看本视频后，您应能充分了解如何针对所需应用搭建并操作自挤压系统。