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取带有荧光标记星形胶质细胞的免疫染色小鼠脑切片。星形胶质细胞的细胞质发出红色荧光，而细胞核发出蓝色荧光。
将载玻片放在合适的物镜下的共聚焦显微镜载物台上。
使用采集软件，调整焦点并选择标记星形胶质细胞质和细胞核的荧光团。
开始实时成像并优化成像参数以减少采集图像中的噪声。
在采集参数下，选择低速扫描模式以捕获更高质量的二维图像。
将星形胶质细胞的最上方位置确定为 Z 堆栈的起点，将最低位置确定为终点。
定义覆盖整个单元深度的切片数。
合并切片以生成星形胶质细胞的三维图像。
要开始共聚焦显微镜，请将载玻片放在显微镜载物台上并选择 63 倍物镜。打开采集软件后，单击采集选项卡中的智能设置，然后选择适当的荧光团。这里使用了DAPI和Alexa Fluor 555。
接下来，单击最佳信号，然后单击应用。然后单击设置曝光以允许计算机确定最佳曝光参数。
要优化图像，请打开"通道"窗口并将图像切换为"实时"。如果需要，调整焦点。然后单击 1 AU 以优化针孔。调整增益以获得最佳强度。
最后，将数字增益设置为 2 和 3 之间。优化后，停止实时图像并打开"采集模式"窗口。通过单击 X x Y 调整帧大小，然后选择 1024 x 1024。另外，选择慢速。
接下来，打开"平均"选项卡并选择一个大于或等于 4 的数字。然后点击 捕捉 按钮并保存捕获的 2D 图像。要设置 3D 成像，请打开"智能设置"选项卡并标记 Z-Stack 项目，这将导致堆栈窗口打开。
要设置 Z 堆栈的第一个和最后一个位置，请再次单击实时并将焦点调整到星形胶质细胞的最上方位置。单击"首先设置"。现在将焦点调整到星形胶质细胞的最低位置，然后单击"最后设置"。然后停止实时取景。
接下来，通过单击"最佳"来选择间隔以设置切片数量。这里，间隔是 1.01 微米。最后，单击"开始实验"并在扫描完成后保存图像。
