厚自由漂浮组织切片中星形胶质细胞区域体积和瓷砖的分析

该协议描述了用于切片，染色和成像小鼠大脑的自由浮动组织切片的方法，随后详细描述了星形胶质细胞区域体积和星形胶质细胞区域重叠或平铺的分析。

了解星形胶质细胞如何发育并建立其复杂的形态对于了解大脑如何发育和功能至关重要。该协议描述了如何分析脑组织中星形胶质细胞形态的关键方面。该协议使用自定义代码来测量厚组织切片中的星形胶质细胞区域体积。

该策略也可用于测量相邻星形胶质细胞之间的区域重叠量。通过将该方案与星形胶质细胞的遗传操作相结合，研究人员可以直接研究特定蛋白质和途径在星形胶质细胞发育中的作用以及星形胶质细胞 - 星形胶质细胞相互作用开始，通过将1毫升10%Triton X加入50毫升管中，用TBS填充管子来制备TBST的新鲜溶液。15毫升管。

接下来，标记24孔板，将不同样品放在不同列的不同溶液中的不同行中，然后在标记为洗涤1的前三列中加入1毫升TBST，洗涤2和洗涤3，并向第四列中加入1毫升封闭溶液。使用本生燃烧器将5.75英寸巴斯德移液管的末端熔化到一个小钩子中，准备玻璃镐，然后使用镐将组织切片从12孔板转移到24孔板的洗涤1柱中，然后在洗涤1，2中洗涤切片10分钟， 并使用玻璃镐将部分从一个孔转移到下一个孔，然后在封闭溶液中孵育切片一小时，从而获得3个孔。通过将抗体加入抗体溶液中制备q毫升一抗溶液，然后在4摄氏度下以大于或等于4， 000倍g的速度短暂涡旋并离心5分钟。

接下来，在一抗中将切片在4摄氏度下孵育2至3晚，同时摇动。一抗孵育后，从洗涤孔中吸取第1天TBST，然后向每个洗涤孔中加入1毫升新的TBST，并将切片移动到第一个洗涤孔中。接下来，在室温下在二抗中孵育切片3小时。

二抗孵育后，从洗涤孔中吸取第2天TBST，然后向每个洗涤孔中加入1毫升新的TBST，并将切片移动到第一个洗涤孔中。在最后的洗涤过程中，将镶嵌介质从4摄氏度中取出并使其升温至室温，然后准备2比1的TBS和去离子水的混合物，并将其添加到培养皿中。接下来，通过在表面加入800微升的2比1 TBS和去离子水混合物来制备显微镜载玻片。

将切片从洗涤3孔转移到培养皿中，然后使用细画笔，一次一个地将切片从培养皿转移到载玻片上的液体中。接下来，使用画笔仔细排列这些部分，使它们平放在幻灯片上。小心地，用P-1000移液管从载玻片中取出多余的液体，然后真空抽吸。

从载玻片中取出所有多余的液体后，使用转移移液器立即向每个部分添加1滴安装介质，并在载玻片上轻轻地铺上盖玻片。让安装介质扩散几分钟，然后通过真空抽吸清除从盖板下滑出的任何多余的安装介质。然后，用透明指甲油密封盖玻片的所有四个边缘。

让载玻片在室温下干燥 30 分钟，然后将其平放在 4 摄氏度下。使用10x物镜，找到用于成像的单个细胞并注意与实验相关的特定大脑区域或次区域，然后使用聚焦旋钮，确定整个星形胶质细胞是否包含在该部分中。然后，切换到更高倍率的油物镜，使电池聚焦。

在通过目镜观察时，使用对焦旋钮从细胞的顶部移动到底部，然后目视检查细胞以确保整个细胞都包含在该部分中。使用共聚焦显微镜相关的采集软件，调整采集参数以获得适当的信噪比和细节水平，然后对40倍物镜使用2倍变焦，如果使用60倍或63倍物镜，则不使用变焦。以0.5微米的步长设置Z-stack的上边界和下边界，确保整个星形胶质细胞被捕获，第一个和最后一个图像，而没有任何荧光标记细胞。

在开始分析之前，通过将文件粘贴到 XT 文件夹的 rtmatlab 子文件夹中，安装凸壳扩展文件 Xtspots ConvexHull。使用伊万里士文件转换器，将图像转换为IMS格式。接下来，在图像分析软件中打开图像文件，然后选择"3D 视图"按钮以在 3D 模式下查看图像，确保单元格符合包含条件。

要创建曲面，请单击蓝色的"添加新曲面"图标，然后通过在曲面创建工具的"大小"下的框中输入尺寸或拖动黄色框的边缘，在单元格周围创建一个感兴趣区域。接下来，通过拖动黄色条或在框中输入值来调整阈值绝对强度，以便灰色表面填充尽可能多的单元格信号，而不会超出单元格的边界。然后，单击绿色箭头以完成曲面的生成。

仔细检查新生成的曲面，并删除不属于单元格的任何曲面片，方法是选择它们，然后单击"铅笔编辑"工具，然后单击"删除"选项。要统一剩余的表面部分，请单击"漏斗过滤器"图标以全选，然后单击"铅笔编辑"图标并选择"统一"选项。单击橙色的"添加新点"图标，从下拉列表中选择正确的源通道，然后在框中输入估计的 XY 直径值为 0.400 微米。

接下来，单击绿色箭头以完成点的创建，然后重新选择点。单击过滤器图标，然后从下拉列表中选择到表面的最短距离表面 X（其中表面 X 是要分析的表面），确保下限阈值和上限阈值电源按钮均为绿色。接下来，在下限阈值框中输入最小距离负1.0微米，在上限阈值框中输入0.1微米的最大距离，然后单击"将部分复制到新点"按钮，确保在软件窗口的左上面板中选择新创建的点。

然后，单击"齿轮工具"图标，然后仅单击"凸壳"插件一次，等待 MATLAB 窗口出现，然后消失，从而在 3D 视图中形成一个实心船体。在左上面板中，确保选中"点 X 选择的凸壳"、"点 X 选择"为"新创建的点的最短距离"，然后单击船体将其选中。接下来，单击"图形统计信息"图标。

在"选择"选项卡中，确保从顶部下拉列表中选择"特定值"，然后从底部下拉列表中选择"体积"，然后记录船体的体积并保存文件，然后继续下一个图像。在表达膜靶向红色荧光蛋白的星形胶质细胞中测量星形胶质细胞的领土体积。敲低富含星形胶质细胞的细胞粘附分子hepaCAM，显着减少星形胶质细胞的领土体积。

使用双标记物的马赛克分析来生成小鼠，其中野生型星形胶质细胞表达红色荧光蛋白，hepaCam敲除星形胶质细胞表达绿色荧光蛋白。计算相邻的红色和绿色荧光蛋白星形胶质细胞对之间的区域重叠百分比。与仅野生型星形胶质细胞对相比，具有hepaCAM和绿色星形胶质细胞遗传修饰的小鼠与红色野生型邻居的领土重叠体积百分比显着增加。

该结果表明，对于正常的星形胶质细胞区域体积和星形胶质细胞平铺，需要使用hepaCAM。确保细胞符合纳入标准至关重要。不完整的单元格将具有较小的区域体积，并且可能会影响您的整体结果和结论。