Name: 厚自由漂浮组织切片中星形胶质细胞区域体积和瓷砖的分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学习在小鼠脑厚自由漂浮组织切片中分析星形胶质细胞区域体积和重叠的方法。该方案结合共聚焦显微镜成像和定制软件代码，为神经科学研究提供精确的细胞形态学测量技术。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

显微成像在北卡罗来纳大学神经科学显微成像中心（RRID:SCR_019060）完成，部分经费来自美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH-NINDS）神经科学中心支持基金 P30 NS045892 和美国国立卫生研究院儿童健康与人类发育研究所（NIH-NICHD）智力与发育障碍研究中心支持基金 U54 HD079124。图1使用 BioRender.com 制作。图4中的图像和数据转载自先前发表的文章9，已获得出版方许可。

<ol><li>Stogsdill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+neuroligins+control+astrocyte+morphogenesis+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis.</a> Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).</li>
<li>Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytogenesis%3A+where%2C+when%2C+and+how%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Astrocytogenesis: where, when, and how.</a> F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li>
<li>Houades, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shapes+of+astrocyte+networks+in+the+juvenile+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biology%22%5BJournal%5D)">Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain.</a> Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).</li>
<li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+in+mammalian+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+imaging+of+individual+astrocytes+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy.</a> Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92(2020).</li>
<li>Takano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemico-genetic+discovery+of+astrocytic+control+of+inhibition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo.</a> Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).</li>
<li>Baldwin, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HepaCAM+controls+astrocyte+self-organization+and+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling.</a> Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).</li>
<li>Amberg, N., Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+dissection+of+candidate+genes+in+mice+using+mosaic+analysis+with+double+markers%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100939(2021).</li>
<li>Dumas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+of+multiaddressable+genome-integrating+color+%28MAGIC%29+markers+to+individualize+cortical+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110(2020).</li>
<li>Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-glia+from+pallial+progenitors+produce+the+largest+clonal+clusters+of+the+brain%3A+time+frame+of+clonal+generation+in+cortex+and+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).</li>
<li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communication. 10 (1), 4884(2019).</li>
<li>O'Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functional+states+of+astrocytes+during+sleep+and+wakefulness%3A+Is+norepinephrine+the+master+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Sleep+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator.</a> Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).</li>
</ol>

作者无利益冲突。

本方案描述了一种用于分析小鼠大脑皮层星形胶质细胞占据体积及星形胶质细胞拼接行为的成熟方法，详细阐述了从灌注到图像分析的全部主要步骤。该方案需要使用在星形胶质细胞稀疏或嵌合表达荧光蛋白的小鼠脑组织。除这一要求外，任何年龄的小鼠均可用于本方案，仅需对灌注参数和包埋模具中添加的冷冻介质体积进行微小调整。尽管已有其他方法发表用于分析脑组织切片中星形胶质细胞的分支复杂性与体积7,11，但本方案具有若干独特优势。首先，本方案提供了一段自定义代码，可用于获取星形胶质细胞占据体积。星形胶质细胞占据体积与星形胶质细胞体积是不同的测量指标，前者测量的是星形胶质细胞所占据的全部空间，而不考虑其分支复杂程度。此外，本方案还阐述了如何利用星形胶质细胞占据体积的测量方法来计算星形胶质细胞占据区域的重叠体积，从而评估星形胶质细胞的拼接行为。最后，本方案详细讨论了可能影响星形胶质细胞占据体积及数据采集的潜在变量，包括封片条件、样本储存条件，以及成像与分析中的纳入与排除标准。除了这些独特特点外，本方案的许多部分——包括灌注、冷冻切片以及游离切片的免疫染色...

星形胶质细胞是具有复杂分支结构的细胞，在大脑中执行多种重要功能1在小鼠大脑皮层中，放射状胶质干细胞在胚胎晚期和出生后早期阶段产生星形胶质细胞2在出生后的前三周内，星形胶质细胞在体积和复杂性上逐渐增大，发育出数千条细小分支，直接与突触相互作用。1同时，星形胶质细胞与邻近的星形胶质细胞相互作用，形成独立且不重叠的区域，以覆盖整个大脑3，同时保持通信 通过 缝隙连接通道4. 损伤或创伤后，许多疾病状态下星形胶质细胞的形态和结构均受到破坏5，表明这些过程对大脑正常功能的重要性。在正常发育、衰老及疾病过程中分析星形胶质细胞的形态学特征，可为星形胶质细胞的生物学与生理学特性提供重要见解。此外，在基因操作后对星形胶质细胞形态进行分析，是揭示调控星形胶质细胞形态复杂性建立与维持的细胞与分子机制的重要工具。
小鼠脑内星形胶质细胞形态的分析因星形胶质细胞分支的复杂性及其拼接式分布特性而变得复杂。使用胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）这一星形胶质细胞特异性标志物进行抗体染色，仅能标记出主要分支，严重低估了星形胶质细胞形态的复杂程度1。其他细胞特异性标志物，如谷氨酸转运体1（GLT-1；slc1a2）、谷氨酰胺合成酶或S100β，对星形胶质细胞分支的标记效果更佳6，但引入了新的问题。星形胶质细胞的支配区域基本互不重叠，但在边缘区域存在轻微重叠。由于分支结构复杂，当相邻星形胶质细胞被同一颜色标记时，无法分辨一个细胞的终点与另一个细胞的起点。利用内源性荧光蛋白对星形胶质细胞进行稀疏或嵌合式标记可同时解决这两个问题：荧光标记物可完整填充细胞，呈现所有分支结构，并允许对单个星形胶质细胞进行成像，从而将其与邻近细胞区分开来。已有多种不同策略被用于实现星形胶质细胞的稀疏荧光标记，这些方法可包含或不包含遗传操作，包括病毒注射、质粒电穿孔或转基因小鼠品系。这些策略的具体实施细节已在先前发表的研究和方案中详细描述1,7,8,9,10,11,12,13。
本文介绍了一种通过稀疏标记星形胶质细胞的荧光标记小鼠脑组织来测量星形胶质细胞占位体积的方法（图1）。由于小鼠皮层中单个星形胶质细胞的平均直径约为60 µm，因此采用100 µm厚的脑切片，以提高完整捕获单个星形胶质细胞的效率。免疫染色并非必需，但建议进行以增强内源性荧光信号，便于共聚焦成像与分析。此外，免疫染色还可提高对星形胶质细胞细小分支的检测灵敏度，并减少成像过程中内源性蛋白的光漂白。为了增强抗体在厚切片中的渗透性，并在整个切片至成像过程中保持组织体积的稳定性，采用游离漂浮式脑切片。星形胶质细胞占位体积的分析使用 commercially available 图像分析软件完成。此外，本方案还描述了一种针对镶嵌式荧光标记组织切片中星形胶质细胞拼接（tiling）的分析方法，其中相邻的星形胶质细胞表达不同的荧光标记。该方案已在多项近期研究1,8,9中成功应用，用于表征正常脑发育过程中星形胶质细胞的生长特性，以及基因操作对星形胶质细胞发育的影响。

<table><tbody><tr><td>#5 镊子</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>1 mL TB 注射器</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS（Tris 缓冲盐水）</td><td></td><td></td><td>30 g Tris，80 g NaCl，2 g KCl，用 HCl 调至 pH 7.4，加 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 定容至 1 L；室温（RT）保存</td></tr><tr><td>1x TBS</td><td></td><td></td><td>100 mL 10x TBS + 900 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；室温保存</td></tr><tr><td>1x TBS + 肝素</td><td></td><td></td><td>28.2 mg 肝素 + 250 mL 1x TBS；4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-106MP</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107MP</td><td></td></tr><tr><td>TBS 中含 30% 蔗糖</td><td></td><td></td><td>15 g 蔗糖，用 1x TBS 定容至 50 mL；4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>TBS 中含 4% PFA（多聚甲醛）</td><td></td><td></td><td>40 g PFA，4–6 粒 NaOH 小球，100 mL 10x TBS，加 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 定容至 1 L；4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Avertin</td><td></td><td></td><td>0.3125 g 三溴乙醇，0.625 mL 甲基丁醇，加 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 定容至 25 mL；4 &amp;deg;C 保存；配制后 2 周内弃用</td></tr><tr><td>封闭和抗体缓冲液</td><td></td><td></td><td>含 10% 山羊血清的 TBST；4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>CD1 小鼠</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>脑组织收集管</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-20</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦图像采集软件</td><td>Olympus</td><td>FV31S-SW</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV3000RS</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Thermo Scientific</td><td>CryoStar NX50</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机刀片</td><td>Thermo Scientific</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>包埋模具</td><td>Polysciences</td><td>18646A-1</td><td></td></tr><tr><td>冷冻介质</td><td></td><td></td><td>30% 蔗糖:OCT 按 2:1 混合；室温保存</td></tr><tr><td>GFP 抗体</td><td>Aves Labs</td><td>GFP1010</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Thermo Scientific</td><td>158920010</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗鸡 IgG 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>版本 9.8.0</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>金属便当盒</td><td>AQUARIUS</td><td>N/A</td><td>来自 Amazon，&quot;DIY 大型趣味盒&quot;</td></tr><tr><td>甲基丁醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖剪</td><td>Roboz</td><td>RS-5921</td><td></td></tr><tr><td>封片介质</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris（pH 8.0），90% 甘油，0.5% N-丙基没食子酸酯；4 &amp;deg;C 保存；有效期最长 2 个月</td></tr><tr><td>指甲油</td><td>VWR</td><td>100491-940</td><td></td></tr><tr><td>N-丙基没食子酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>02370-100G</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>镜油</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td>与显微镜/物镜配套使用</td></tr><tr><td>6&quot; 手术剪</td><td>Roboz</td><td>RS-6820</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>Fisher Scientific</td><td>88861043</td><td>最低所需转速：25 rpm</td></tr><tr><td>画笔</td><td>Bogrinuo</td><td>N/A</td><td>来自 Amazon，&quot;细节画笔 - 微型画笔&quot;</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管（5.75&quot;）</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管（9&quot;）</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>RFP 抗体</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>切片介质</td><td></td><td></td><td>甘油:1x TBS 按 1:1 混合；室温保存</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>TBST（TBS + Triton X-100）</td><td></td><td></td><td>含 0.2% Triton 的 1x TBS；室温保存</td></tr><tr><td>移液管</td><td>VWR</td><td>414004-002</td><td></td></tr><tr><td>三溴乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>三（羟甲基）氨基甲烷</td><td>Thermo Scientific</td><td>424570025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100（高纯度）</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-489-120</td><td></td></tr><tr><td>XTSpotsConvexHull</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>作为补充材料提供的自定义 XTension 插件</td></tr></tbody></table>

星形胶质细胞区域体积与拼接在厚切游离组织切片中的分析

Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections

星形胶质细胞具有惊人的形态复杂性，使其能够与大脑内的几乎所有类型的细胞和结构相互作用。通过这些相互作用，星形胶质细胞主动调控多种关键的大脑功能，包括突触形成、神经传递以及离子稳态。在啮齿类动物大脑中，星形胶质细胞在出生后的前三周内体积和复杂性逐渐增加，并建立起彼此独立、不重叠的结构域，以覆盖整个大脑。本实验方案提供了一种成熟的方法，用于分析小鼠脑组织游离切片中星形胶质细胞的结构域体积及其拼接（tiling）情况。首先，本方案描述了组织取材、冷冻切片以及游离脑组织切片免疫染色的操作步骤。其次，本方案介绍了如何使用商业化的图像分析软件进行图像采集，并分析星形胶质细胞结构域体积及结构域重叠体积。最后，本文讨论了这些方法的优势、重要注意事项、常见问题及局限性。该方案需要对星形胶质细胞进行稀疏或嵌合式荧光标记的脑组织样本，且设计为可配合常规实验室设备、共聚焦显微镜以及商业化图像分析软件使用。

图1 展示了本实验方案主要步骤和工作流程的示意图。 图2 显示使用图像分析软件生成表面、在表面附近生成斑点以及生成凸包等关键步骤的截图。 图3 展示了该技术在确定星形胶质细胞区域重叠/镶嵌中的应用。在 图 4此前已发表论文中的代表性结果9 展示本方案的应用。在 图 4A 和 图 4B，敲低星形胶质细胞富集的细胞黏附分子 hepaCAM 显著降低了星形胶质细胞的占域体积。在 图 4C 和 图4D采用双标记嵌合体分析（MADM）技术，在小鼠皮层中引入稀疏的嵌合标记及同步的遗传修饰。通过MADM技术，成功构建了野生型星形胶质...

本方案描述了对小鼠脑组织游离切片进行切片、染色和成像的方法，随后详细介绍了星形胶质细胞区域体积以及星形胶质细胞区域重叠或拼接的分析方法。

星形胶质细胞具有惊人的形态复杂性，使其能够与中枢神经系统内的几乎所有类型的细胞和结构相互作用。

了解星形胶质细胞如何发育并建立其复杂形态，对于理解大脑的发育与功能至关重要。本方案描述了如何分析脑组织中星形胶质细胞形态的关键特征。该方案使用自定义代码在厚组织切片中测量星形胶质细胞占据体积。该策略还可用于测量相邻星形胶质细胞之间 territory 的重叠程度。通过将本方案与星形胶质细胞的遗传学操作相结合，研究人员可直接探究特定蛋白和信号通路在星形胶质细胞发育及星形胶质细胞-星形胶质细胞相互作用中的作用。首先，通过将1毫升10% Triton X加入50毫升离心管中，并用TBS定容至50毫升，配制新鲜的TBST溶液。为每只小鼠脑组织准备2毫升封闭液和抗体溶液：在15毫升离心管中将山羊血清与TBST混合均匀。接下来，标记一个24孔板，将不同样品置于不同行，并将不同溶液置于不同列中，然后向标记为洗涤1、洗涤2和洗涤3的前三列各加入1毫升TBST，向第四列加入1毫升封闭液。用本生灯将一支5.75英寸巴斯德吸管的末端熔成小钩状，制备成玻璃挑针，然后用该挑针将组织切片从12孔板转移至24孔板的洗涤1列中，随后使用玻璃挑针将切片依次从一个孔转移至下一个孔，在洗涤1、2和3孔中各洗涤10分钟，之后将切片在封闭液中于4°C孵育1小时。取q毫升抗体溶液，加入一抗配制一抗溶液，短暂涡旋混匀，并在4°C、≥4,000 × g条件下离心5分钟。接着，将切片置于一抗溶液中，在 4 摄氏度下振荡孵育 2 至 3 个晚上。一抗孵育结束后，吸除第一天的 TBST 洗涤液，然后向每个洗涤孔中加入 1 毫升新鲜 TBST，并将切片转移至第一个洗涤孔中。随后，在室温下将切片与二抗孵育 3 小时。二抗孵育后，吸除第2天洗涤孔中的TBST，然后向每个洗涤孔中加入1毫升新鲜TBST，并将切片转移至第一个洗涤孔中。在最后一次洗涤期间，将封片剂从4摄氏度取出，使其升至室温，同时配制TBS与去离子水按2:1比例混合的溶液，并加入培养皿中。接着，通过在载玻片表面加入800微升TBS与去离子水按2:1比例混合的溶液，制备显微镜载片。将切片从洗涤3孔板转移至培养皿中，然后使用细毛笔将切片逐个从培养皿转移至载玻片上的液体中。接着，用毛笔小心地将切片在载玻片上展平。随后，用P-1000移液器小心吸除载玻片上多余的液体，再进行真空抽吸。当载玻片上所有多余的液体去除后，立即使用移液管向每个组织区域滴加一滴封片剂，并轻轻盖上盖玻片。让封片剂自然扩散数分钟，然后用真空抽吸法除去从盖玻片边缘溢出的多余封片剂。随后，用透明指甲油密封盖玻片的四个边缘。将载玻片在室温下干燥30分钟，然后将其平放于4摄氏度保存。使用10倍物镜定位用于成像的单个细胞，并记录与实验相关的特定脑区或亚区，然后通过调焦旋钮判断整个星形胶质细胞是否完全包含在切片内。随后，切换至更高倍率的油镜物镜，并将细胞调至清晰对焦。通过目镜观察时，使用调焦旋钮从细胞顶部移动到底部，然后目视检查细胞，确保整个细胞均位于切片范围内。使用共聚焦显微镜配套的采集软件，调整采集参数以获得适当的信噪比和细节水平；使用40倍物镜时采用2倍放大，使用60倍或63倍物镜时则不使用放大。设置Z轴层扫的上下边界，步长为0.5微米，确保首张和末张图像完整捕获整个星形胶质细胞，且细胞无任何荧光标记。开始分析之前，将凸包扩展文件 XtspotsConvexHull 复制到 XT 文件夹的 rtmatlab 子文件夹中以完成安装。使用 Imaris 文件转换器将图像转换为 IMS 格式。接着，在图像分析软件中打开图像文件，并点击 3D 视图按钮以三维模式查看图像，确保细胞符合纳入标准。要创建一个表面，请点击蓝色的“添加新表面”图标，然后通过在表面创建工具的尺寸框中输入数值，或拖动黄色框的边缘，在细胞周围创建一个感兴趣区域。接下来，通过拖动黄色滑块或在框中输入数值来调整“阈值绝对强度”，使灰色表面尽可能填充细胞信号，但不超出细胞边界。随后，点击绿色箭头以完成表面的生成。仔细检查新生成的表面，通过选中不属于细胞的任何表面部分，然后单击铅笔编辑工具，接着选择删除选项，将其删除。为合并剩余的表面部分，单击漏斗过滤器图标以全选，然后单击铅笔编辑图标并选择合并选项。单击橙色的“添加新斑点”图标，从下拉列表中选择正确的源通道，然后在输入框中输入估计的 XY 直径值 0.400 微米。接下来，单击绿色箭头以完成斑点的创建，然后重新选择这些斑点。单击“筛选”图标，并从下拉列表中选择“到表面的最短距离 表面 表面 表面 X”，其中“表面 X”为正在分析的表面，确保下限阈值和上限阈值的电源按钮均为绿色。接着，在下限阈值框中输入最小距离为 -1.0 µm，在上限阈值框中输入最大距离为 0.1 µm，然后单击“复制到新斑点”按钮，并确保软件窗口左上方面板中已选中新创建的斑点。随后，单击齿轮工具图标，然后仅单击一次凸包插件，并等待 MATLAB 窗口出现后消失，从而在 3D 视图中生成一个实心凸包。在左上方面板中，确保已选中“点集 X 选择的凸包，最短距离”，其中“点集 X 选择”为新创建的点集，然后单击该凸包以选中它。接下来，单击图统计图标。在“选择”选项卡中，确保从顶部下拉列表中选择“特定值”，然后从底部下拉列表中选择“体积”，记录细胞壳的体积并保存文件，接着进入下一张图像。星形胶质细胞区域体积的测量是在表达膜靶向红色荧光蛋白的星形胶质细胞中进行的。敲低星形胶质细胞富集的细胞黏附分子 hepaCAM 可显著减小星形胶质细胞的区域体积。利用双标记嵌合分析技术生成了小鼠，其中野生型星形胶质细胞表达红色荧光蛋白，而hepaCam基因敲除的星形胶质细胞表达绿色荧光蛋白。计算了相邻红色与绿色荧光蛋白标记的星形胶质细胞对之间的 territory 重叠百分比。结果显示，携带hepaCAM基因修饰并表达绿色荧光蛋白的星形胶质细胞与其红色野生型邻近细胞之间的 territory 重叠体积百分比显著高于仅由野生型星形胶质细胞组成的细胞对。该结果表明，hepaCAM 对星形胶质细胞正常区域体积和星形胶质细胞拼接是必需的。必须确保细胞符合纳入标准。不完整的细胞其区域体积会较小，可能影响整体结果和结论。

analysis-astrocyte-territory-volume-tiling-thick-free-floating-tissue

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

厚自由漂浮组织切片中星形胶质细胞区域体积和瓷砖的分析

本视频演示了使用荧光标记的星形胶质细胞，通过一抗和二抗对固定的小鼠脑组织切片进行免疫染色，并通过共聚焦显微镜捕获染色后星形胶质细胞图像的实验流程。...

小鼠脑组织切片中荧光标记星形胶质细胞的免疫染色

来源： Moye, S. L., et.al. 利用荧光黄电泳技术可视化星形胶质细胞形态。 J. Vis. Exp. (2019)。...

使用荧光染料电泳法在固定的小鼠脑切片中可视化星形胶质细胞形态

来源：Bagheri, M., et. al. 星形胶质细胞三维共聚焦形态计量分析方案。J. Vis. Exp.

使用共聚焦显微镜对免疫标记的星形胶质细胞进行三维成像

中枢神经系统中的星形胶质细胞在受到有害刺激时会改变其功能和结构特性。本报告介绍了一种在疾病状态或治疗干预后评估星形胶质细胞三维形态的实验方案。...

星形胶质细胞三维共聚焦形态计量分析方案

本文介绍了一种评估星形胶质细胞网络结构的实验方案。该方法可最大限度地减少偏差，提供对这些网络的描述性测量指标，如细胞数量、大小、面积以及在核团内的位置。各向异性通过矢量分析进行评估。...

分析耦合星形胶质细胞网络的大小、形状和方向性

所述流程旨在对大于千兆字节的电子显微镜数据集进行分割，以提取完整细胞的形态。一旦细胞在三维空间中完成重建，即可使用根据特定需求定制的软件直接在三维空间中进行定性和定量分析，也可借助虚拟现实技术克服视野遮挡问题。...

一种用于胶质细胞与神经元细胞三维重建及虚拟现实分析的方法

星形胶质细胞具有复杂的形态结构，表现为具有多个突起和密集的分布区域。为了分析其精细的形态特征，本文介绍了一种可靠的在轻度固定的组织中进行细胞内 Lucifer yellow...

使用 Lucifer Yellow 离子电泳技术可视化星形胶质细胞形态

本文介绍了一种体外活体成像方法，用于可视化小鼠星形胶质细胞中细胞器的细胞内运输以及质膜蛋白的转运过程。该方案还提供了一种图像分析方法，用于确定货物运输的路径和动力学特征。...

可视化与分析星形胶质细胞内细胞器及其他货物的胞内运输

星形胶质细胞在大脑皮层中均匀分布，这使得在细胞水平上分析其复杂形态具有挑战性。本方案采用基于子宫内电穿孔的多色标记方法，以标记单个皮层星形胶质细胞，并结合用户友好的图像分析流程，对其体积和形态进行分析。...

子宫内电穿孔法将多靶点基因组整合彩色（MAGIC）标记递送至个体小鼠皮层星形胶质细胞

结合病毒载体转导与基于CLARITY方法的脑组织透明化技术，可实现对大量神经元和星形胶质细胞的同时观察与研究。...

透明化大脑中星形胶质细胞与神经元空间相互作用的研究

学习在小鼠脑厚自由漂浮组织切片中分析星形胶质细胞区域体积和重叠的方法。该方案结合共聚焦显微镜成像和定制软件代码，为神经科学研究提供精确的细胞形态学测量技术。

星形胶质细胞区域体积与拼接在厚切游离组织切片中的分析

探索更多视频