星形胶质细胞区域体积与拼接在厚切游离组织切片中的分析

了解星形胶质细胞如何发育并建立其复杂形态，对于理解大脑的发育与功能至关重要。本方案描述了如何分析脑组织中星形胶质细胞形态的关键特征。该方案使用自定义代码在厚组织切片中测量星形胶质细胞占据体积。

该策略还可用于测量相邻星形胶质细胞之间 territory 的重叠程度。通过将本方案与星形胶质细胞的遗传学操作相结合，研究人员可直接探究特定蛋白和信号通路在星形胶质细胞发育及星形胶质细胞-星形胶质细胞相互作用中的作用。首先，通过将1毫升10% Triton X加入50毫升离心管中，并用TBS定容至50毫升，配制新鲜的TBST溶液。为每只小鼠脑组织准备2毫升封闭液和抗体溶液：在15毫升离心管中将山羊血清与TBST混合均匀。

接下来，标记一个24孔板，将不同样品置于不同行，并将不同溶液置于不同列中，然后向标记为洗涤1、洗涤2和洗涤3的前三列各加入1毫升TBST，向第四列加入1毫升封闭液。用本生灯将一支5.75英寸巴斯德吸管的末端熔成小钩状，制备成玻璃挑针，然后用该挑针将组织切片从12孔板转移至24孔板的洗涤1列中，随后使用玻璃挑针将切片依次从一个孔转移至下一个孔，在洗涤1、2和3孔中各洗涤10分钟，之后将切片在封闭液中于4°C孵育1小时。取q毫升抗体溶液，加入一抗配制一抗溶液，短暂涡旋混匀，并在4°C、≥4,000 × g条件下离心5分钟。

接着，将切片置于一抗溶液中，在 4 摄氏度下振荡孵育 2 至 3 个晚上。一抗孵育结束后，吸除第一天的 TBST 洗涤液，然后向每个洗涤孔中加入 1 毫升新鲜 TBST，并将切片转移至第一个洗涤孔中。随后，在室温下将切片与二抗孵育 3 小时。

二抗孵育后，吸除第2天洗涤孔中的TBST，然后向每个洗涤孔中加入1毫升新鲜TBST，并将切片转移至第一个洗涤孔中。在最后一次洗涤期间，将封片剂从4摄氏度取出，使其升至室温，同时配制TBS与去离子水按2:1比例混合的溶液，并加入培养皿中。接着，通过在载玻片表面加入800微升TBS与去离子水按2:1比例混合的溶液，制备显微镜载片。

将切片从洗涤3孔板转移至培养皿中，然后使用细毛笔将切片逐个从培养皿转移至载玻片上的液体中。接着，用毛笔小心地将切片在载玻片上展平。随后，用P-1000移液器小心吸除载玻片上多余的液体，再进行真空抽吸。

当载玻片上所有多余的液体去除后，立即使用移液管向每个组织区域滴加一滴封片剂，并轻轻盖上盖玻片。让封片剂自然扩散数分钟，然后用真空抽吸法除去从盖玻片边缘溢出的多余封片剂。随后，用透明指甲油密封盖玻片的四个边缘。

将载玻片在室温下干燥30分钟，然后将其平放于4摄氏度保存。使用10倍物镜定位用于成像的单个细胞，并记录与实验相关的特定脑区或亚区，然后通过调焦旋钮判断整个星形胶质细胞是否完全包含在切片内。随后，切换至更高倍率的油镜物镜，并将细胞调至清晰对焦。

通过目镜观察时，使用调焦旋钮从细胞顶部移动到底部，然后目视检查细胞，确保整个细胞均位于切片范围内。使用共聚焦显微镜配套的采集软件，调整采集参数以获得适当的信噪比和细节水平；使用40倍物镜时采用2倍放大，使用60倍或63倍物镜时则不使用放大。设置Z轴层扫的上下边界，步长为0.5微米，确保首张和末张图像完整捕获整个星形胶质细胞，且细胞无任何荧光标记。

开始分析之前，将凸包扩展文件 XtspotsConvexHull 复制到 XT 文件夹的 rtmatlab 子文件夹中以完成安装。使用 Imaris 文件转换器将图像转换为 IMS 格式。接着，在图像分析软件中打开图像文件，并点击 3D 视图按钮以三维模式查看图像，确保细胞符合纳入标准。

要创建一个表面，请点击蓝色的“添加新表面”图标，然后通过在表面创建工具的尺寸框中输入数值，或拖动黄色框的边缘，在细胞周围创建一个感兴趣区域。接下来，通过拖动黄色滑块或在框中输入数值来调整“阈值绝对强度”，使灰色表面尽可能填充细胞信号，但不超出细胞边界。随后，点击绿色箭头以完成表面的生成。

仔细检查新生成的表面，通过选中不属于细胞的任何表面部分，然后单击铅笔编辑工具，接着选择删除选项，将其删除。为合并剩余的表面部分，单击漏斗过滤器图标以全选，然后单击铅笔编辑图标并选择合并选项。单击橙色的“添加新斑点”图标，从下拉列表中选择正确的源通道，然后在输入框中输入估计的 XY 直径值 0.400 微米。

接下来，单击绿色箭头以完成斑点的创建，然后重新选择这些斑点。单击“筛选”图标，并从下拉列表中选择“到表面的最短距离 表面 表面 表面 X”，其中“表面 X”为正在分析的表面，确保下限阈值和上限阈值的电源按钮均为绿色。接着，在下限阈值框中输入最小距离为 -1.0 µm，在上限阈值框中输入最大距离为 0.1 µm，然后单击“复制到新斑点”按钮，并确保软件窗口左上方面板中已选中新创建的斑点。

随后，单击齿轮工具图标，然后仅单击一次凸包插件，并等待 MATLAB 窗口出现后消失，从而在 3D 视图中生成一个实心凸包。在左上方面板中，确保已选中“点集 X 选择的凸包，最短距离”，其中“点集 X 选择”为新创建的点集，然后单击该凸包以选中它。接下来，单击图统计图标。

在“选择”选项卡中，确保从顶部下拉列表中选择“特定值”，然后从底部下拉列表中选择“体积”，记录细胞壳的体积并保存文件，接着进入下一张图像。星形胶质细胞区域体积的测量是在表达膜靶向红色荧光蛋白的星形胶质细胞中进行的。敲低星形胶质细胞富集的细胞黏附分子 hepaCAM 可显著减小星形胶质细胞的区域体积。

利用双标记嵌合分析技术生成了小鼠，其中野生型星形胶质细胞表达红色荧光蛋白，而hepaCam基因敲除的星形胶质细胞表达绿色荧光蛋白。计算了相邻红色与绿色荧光蛋白标记的星形胶质细胞对之间的 territory 重叠百分比。结果显示，携带hepaCAM基因修饰并表达绿色荧光蛋白的星形胶质细胞与其红色野生型邻近细胞之间的 territory 重叠体积百分比显著高于仅由野生型星形胶质细胞组成的细胞对。

该结果表明，hepaCAM 对星形胶质细胞正常区域体积和星形胶质细胞拼接是必需的。必须确保细胞符合纳入标准。不完整的细胞其区域体积会较小，可能影响整体结果和结论。