分析耦合星形胶质细胞网络的大小、形状和方向性

该方法有助于解答有关星形胶质细胞网络在脑结构中组织方式的关键问题。此技术的主要优势在于，它提供了一种无偏倚的方法来计数标记细胞，并记录其在特定结构内的解剖学分布。打开 ImageJFIJI，选择所需文件，然后在生物格式的导入选项窗口中点击“确定”。

为了重新定义一个仅包含最终Z堆栈所需光学切片的Z堆栈，首先选择STK和Z投影，然后点击工具栏中的堆栈旋钮。在投影类型设置中选择最大强度。保存文件，并将其命名为堆栈文件。

如果成像文件包含多个通道，请使用图像颜色和拆分通道功能，仅显示星形胶质细胞网络图像的通道。通过选择图像、属性、像素，并将像素尺寸设为1，来检查图像的像素设置。然后通过打开处理菜单并选择背景减除工具，去除生物胞素标记的背景信号。

使用预览功能设置滚动球半径，通常设置为 50 像素。如果在减去背景步骤后仍需要进一步降低噪声，请选择“处理”、“噪声”和“去除异常值”。在“异常值类型”设置中选择“亮”，并使用预览功能设置半径和阈值。

使用去除异常值工具时需谨慎，因为该工具可能会模糊数据，如此处所示。通过图像、调整、阈值来调节阈值。选择默认值以及黑白模式。

单击应用。通过选择处理、二值化、生成二值图像，使用二值化处理工具将图像转换为二值图像。将文件保存为 tiff 文件，并将其命名为二值文件。

进行细胞计数时，首先通过点击“分析”并设置测量类型来设定测量方式，然后选择“质心”选项。确保二值图像文件已在屏幕上打开。

再次打开分析菜单，然后选择“分析颗粒”。接着，选择“显示”和“轮廓”。这将生成一个新文件，显示检测结果。

优化参数以优化检测效果。若仅检测细胞，请使用30至6000之间的大小值，以及0到1之间的圆形度值，其中1代表完美的圆形，0代表任意形状。单击“确定”运行检测。将出现两个表格：一个名为“摘要”的表格，提供检测到的细胞数量；另一个名为“结果”的表格，提供每个细胞的X和Y坐标。

复制这些数值并粘贴到电子表格应用程序中。将此表格另存为“检测表”。同时，还将生成一个包含已检测细胞图像的文件。

将此文件另存为名为“检测文件”的 tiff 文件。如果使用“分析粒子”工具将两个或多个标记的细胞检测为单个细胞，请在应用“分析粒子”工具之前，通过选择“处理”、“二值化”和“分水岭”工具对二值图像进行分水岭处理。要测量网络的表面积，请在 ImageJ 中使用检测文件。

单击鼠标左键以在工具栏中选择多边形选择工具。再次单击鼠标左键，开始勾画一个连接网络外部边缘所有细胞的兴趣区域（ROI）。单击鼠标右键以闭合多边形。

打开测量设置窗口，选择区域选项。然后打开ROI管理器，通过点击“添加”将绘制的多边形加入ROI管理器中。在ROI管理器中点击“测量”以运行测量。

面积测量结果将显示在一个表格中，并以像素为单位表示。请勿忘记使用所用显微镜的转换系数，将该数值转换为平方微米。在 ImageJFIJI 中打开堆栈文件，并通过较强的标记强度识别已进行膜片钳的细胞。

然后在电子表格应用程序中打开名为“detection table”的文件，找到与 patched cell 相关联的编号及其对应的坐标。如果无法准确确定 patched cell，可使用多边形工具圈选出生物胞素沉积较密集的区域，并将该位置视为 patched cell 的位置。与之前相同，使用 ROI manager 在 patched cell 所在位置绘制一个 ROI，并将其添加到 ROI manager 中。

接下来，设置测量并选择质心选项。在 RIO 管理器中，点击“测量”以获取所绘制区域质心的坐标。将这些坐标用作该特定网络的参考点。

使用此公式计算每个细胞相对于所记录星形胶质细胞的坐标。将每个细胞的坐标表示为相对于所记录星形胶质细胞的位置，是计算从所记录星形胶质细胞出发的矢量的重要步骤。使用此公式计算优势取向主矢量的坐标。

网络优势取向的主要向量是网络中每个细胞先前计算出的所有向量的总和。将主向量的长度除以网络中的细胞数量减一（以排除被记录的细胞），以标准化数值并实现不同网络之间的比较。为确定每个网络在目标细胞核中的位置，首先使用矢量图像编辑器打开四通道x图像。

在尺寸窗口中将各维度乘以五，以增大四倍图像的尺寸。此处，图像的采样尺寸为 800 × 800 像素，因此采样分辨率更改为 4000 × 4000 像素。将文件以 TIFF 格式导出，并将其命名为 resized four x。

将调整大小后的4倍图像的左上角与Adobe Illustrator文档的左下角对齐。该软件的坐标系以左下角为参考点。打开网络的20倍图像。

使用二值文件或检测文件，因为它们更容易进行对齐。然后，调整20倍图像二值文件的不透明度工具，使其与重新调整大小的4倍图像对齐。对齐完成后，选择并按住移液器工具，使测量工具出现，然后在左侧工具栏中选择该工具。

使用测量工具点击 20 x 图像的左上角，以获取该 20 x 参考点在重缩放后的 4 x 图像上的坐标。这些 20 x 参考坐标可用于在细胞核示意图上表示每个网络的位置。为汇总数据，将细胞核归一化为一个矩形。

为此，请使用多边形工具在已调整大小的4倍图像中圈选出细胞核。然后打开ROI管理器，添加所绘制的感兴趣区域（ROI）。如果细胞核边界无法看清，请使用带有透明光效的图像，此时需记得先进行图像缩放。

在设定测量时，选择“边界矩形”选项，以计算所绘制细胞核内的最小矩形。最后点击“测量”，然后按照书面实验方案中的步骤，将标记细胞的坐标表示在由边界矩形所代表的标准化细胞核中。位于三叉神经主感觉核背侧的一个星形胶质细胞被SR101标记，被选中进行全细胞记录，并灌注了0.2%生物胞素（biocytin）。

对第五束进行电刺激会增加三叉神经主感觉核背侧部分的生物胞素标记，表明偶联细胞数量增加。星形胶质细胞网络局限于三叉神经主感觉核背侧部分及其主要取向内。该技术最初用于确定星形胶质细胞网络在特定结构中的位置，但也可用于表达任何结构中标记细胞群体的位置。