耦合星形胶质细胞网络的大小、形状和方向性分析
October 4th, 2018
在这里, 我们提出了一个评估胶质网络组织的协议。所述方法最大限度地减少偏倚, 以提供这些网络的描述性度量, 如细胞计数、大小、面积和原子核内的位置。各向异性的评估与矢量分析。
这种方法可以帮助回答有关在大脑结构中组织天体网络的关键问题。该技术的主要优点是，它提出了一种无偏的方法，以计数标签细胞和记录其解剖组织在定义的结构。打开 ImageJFIJI，选择所需的文件，并在生物格式的导入选项窗口中单击"确定"。
要重新定义仅包含最终 Z 堆栈所需的光学切片的 Z 堆栈，请先选择 STK 和 Z 项目，然后单击工具栏中的堆栈旋钮。在投影类型设置中选择最大强度。保存文件，并命名它堆栈文件。
如果成像文件包含多个通道，请使用图像颜色和拆分通道仅显示具有星体网络图像的通道。通过选择图像、属性、像素（一个用于像素尺寸）来检查图像的像素设置。然后使用减法背景工具，打开过程，减去背景，以去除背景生物细胞素标签。
使用预览功能设置滚动球半径，通常设置为 50 像素。如果按照减法背景步骤进一步降低噪音，请选择过程、噪声并删除异常值。在哪个异常值设置中选择"亮"，并使用预览功能设置半径和阈值。
小心使用删除异常值工具，因为它可能会模糊数据，如下所示。使用图像调整阈值，调整阈值。选择默认模式和 B 和 W 模式。
单击申请。通过选择进程、二进制和二进制，使用二进制进程工具将图像转换为二进制图像。将文件另存为 tiff 文件，并将其命名为二进制文件。
要计算单元格，请首先通过单击分析和设置测量来设置测量类型。然后选择质心选项。确保二进制文件在屏幕上打开。
再次，打开分析菜单，这次选择分析粒子。接下来，选择"显示"和"轮廓"。这将生成一个显示检测结果的新文件。
优化参数以优化检测。要仅检测单元格，请使用介于 30 和 6000 之间的大小值，以及介于 0 到 1 之间的循环，其中一个单元格定义一个完美的圆，零个随机形状。通过单击"确定"运行检测。将出现两个表，一个标题为摘要的表，提供检测到的单元格数，以及一个标题为结果的表，提供每个单元格的 X 和 Y 坐标。
复制值并将其粘贴到电子表格应用程序中。将此表保存在名称检测表下。还将显示包含检测到单元格的图的文件。
将此文件另存为名称检测文件下的 tiff 文件。如果使用分析粒子工具检测为一组两个或多个标记单元格，则在应用分析粒子工具之前，通过选择过程、二进制和分水岭，在二进制图像上使用分水岭工具。要测量网络的表面区域，请使用 ImageJ 中的检测文件。
左键单击鼠标以在工具栏中选择多边形选择工具。再次左键单击，开始跟踪连接网络外部外围的所有单元的感兴趣区域或 ROI。右键单击以关闭多边形。
打开设置的测量窗口并选择"区域"选项。然后打开 ROI 管理器，然后通过单击"添加"在 ROI 管理器中添加跟踪多边形。通过单击 ROI 管理器中的度量值运行度量。
区域测量将显示在表中，以像素表示。不要忘记使用用于获得平方微米值的显微镜的转换系数转换此值。打开 ImageJFIJI 中的堆栈文件，并识别具有更强标记强度的修补单元格。
然后在电子表格应用程序中打开名为检测表的文件，并查找与修补的单元格及其相应坐标关联的数字。如果无法准确确定修补的细胞，请使用多边形工具包围生物细胞沉积较密集的区域，并在此位置称为修补细胞的位置。与以前一样使用 ROI 管理器在修补的单元位置绘制 ROI 并将其添加到 ROI 管理器。
接下来，设置测量值并选择质心选项。在 RIO 管理器中，单击度量值以获取跟踪区域的质心的坐标。使用这些坐标作为此特定网络的参考点。
使用此公式计算每个单元格的坐标，以引用修补的星细胞。在参考修补的星核细胞时表达每个细胞的坐标是计算从修补的星细胞中向量的重要步骤。使用此公式计算优先方向的主矢量的坐标。
网络优先方向的主要向量是网络中每个单元以前计算的所有向量的总和。将主矢量的长度除以网络中的单元格数，减去一个以排除修补的单元格，以规范化值并启用网络之间的比较。要确定每个网络在感兴趣的核心中的位置，请首先使用矢量图像编辑器打开四个 x 图像。
将尺寸窗口中的尺寸乘以 5，以增加四个 x 图像的大小。在这里，图像采样为 800 x 800 像素，因此采样分辨率更改为 4000 x 4000 像素。以 tiff 格式导出文件，并命名它调整大小为四 x。
将调整大小的四 x 图像的左上角与 Adobe Illustrator 文档的左下角对齐。该软件从左下角的参考点提供坐标。打开网络的 20 x 映像。
使用二进制文件或检测文件，因为它们更易于对齐。然后，在 20 x 图像的二进制文件中使用不透明度工具，将其与调整大小的 4 x 图像对齐。完成对齐后，选择并按住移液器工具，以便显示测量工具，并在左侧工具栏中选择该工具。
使用度量线工具单击 20 x 图像的左上角，将 20 x 参考点的坐标放到调整大小的 4 x 图像上。此 20 x 参考坐标可用于表示每个网络在原子核原理图图上的位置。为了总结数据，使用原子核作为矩形的规范化。
为此，请使用多边形工具在调整大小的四 x 图像中环绕原子核。然后打开 ROI 管理器并添加绘制的 ROI。如果看不到原子核的边界，请使用透明光的图像，在这种情况下，请记住先调整其大小。
在设置测量中，选择边界矩形选项以计算绘制的原子核中的最小矩形。最后，单击度量，然后按照书面协议中的步骤在边界矩形表示的规范化原子核中表示标记的单元格坐标。三叉主感觉核的后部分的单一星细胞，由SR101标记，用于全细胞记录，并填充0.2%的生物细胞素。
第五个菌道的电刺激增加了三叉主感觉核的后生部分的生物细胞标记，表示耦合细胞的数量增加。天体网络仍然局限于三叉主感觉核的后部分及其主要方向。该技术被开发用于在定义的结构中定位星谱网络，但可用于表示标记细胞在任何结构中的位置。
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概述
本研究提出了一种使用ImageJFIJI评估大脑结构中星形胶质细胞网络组织的协议。该方法强调减少偏差，并允许对细胞数量、大小、面积和位置进行详细测量，同时进行各向异性的向量分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 成像技术
背景
- 星形胶质细胞网络在大脑功能中扮演着关键角色。
- 了解它们的组织可以提供神经机制的洞察。
- 需要严谨的分析方法来减轻测量偏差。
研究目的
- 建立一个无偏见的协议来分析星形胶质细胞网络。
- 在特定大脑区域推导出星形胶质细胞组织的准确指标。
- 为理解星形胶质细胞的空间排列做出贡献。
所用方法
- 该方法利用成像软件（ImageJFIJI）来分析星形胶质细胞网络。
- 利用透射电子显微镜图像重建3D结构。
- 关键步骤包括背景减除、噪声降低和二值图像处理。
- 包括细胞位置测量和向量计算。
主要结果
- 该协议成功地量化了星形胶质细胞的特征和位置。
- 显著的向量分析揭示了网络的方向模式。
- 研究结果强调了对神经科学研究至关重要的空间组织。
结论
- 该协议提高了星形胶质细胞网络研究的可重复性和准确性。
- 研究结果有助于理解大脑中星形胶质细胞的结构复杂性。
- 获得的洞察可以为未来的大脑功能和病理研究提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding astrocytic network organization provides mechanistic insights into glial-neuronal communication, supporting target validation in CNS drug discovery. Quantitative analysis of network size, shape, and directionality enables de-risking of hypotheses related to synaptic modulation and circuit function. This method supports predictive confidence in preclinical models by characterizing a key regulatory system in brain physiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of astrocytic network properties as potential therapeutic targets in neurological disorders.
- Operational Value: Provides unbiased, automated detection of labeled cells to reduce variability in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative metrics of network size and preferential orientation for assay standardization.
- Operational Value: Supports reproducible preparation of biological systems for compound screening in glial-modulating pathways.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates comparison of astrocytic networks across brain regions or conditions to align with disease-relevant systems.
- Operational Value: Enables normalization of network position within anatomical structures for cross-study consistency.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by providing quantitative imaging outputs that inform target selection and mechanistic de-risking prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding astrocytic network roles in neuronal circuit function.
- Screening: Delivers standardized, quantitative readouts of network morphology for assay validation.
- Analytics: Enables vectorial analysis and normalization to compare network organization across experimental conditions.
- Translational Research: Connects network metrics to functional domains in predefined brain nuclei for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging analysis pipeline for glial network characterization across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in glial-targeted hypotheses through objective network metrics.
- Operational Value: Ensures reproducibility and scalability of astrocytic network analysis across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing confidence in target biology.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS targets based on network-level validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal image analysis and fluorescence microscopy.
- Dependent on ImageJFIJI or compatible software for automated processing.
- Necessitates standardization of background subtraction and thresholding parameters.
- Involves adaptation of ROI tracing and vector calculation steps for different brain structures.
- Limited by the need for dye-coupling to visualize functional astrocytic networks.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:30
Data Preparation
2:32
Cell Counting
4:10
Measuring Astrocytic Network Area
5:04
Determining the Main Direction Vector
6:52
Placing the Analyzed Networks in the Nucleus of Interest
9:11
Results: Astrocytic Networks Labeled with Biocytin in NVsnpr
9:49
Conclusion
