Name: 耦合星形胶质细胞网络的大小、形状和方向性分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学习使用ImageJFIJI分析星形胶质细胞网络的无偏方法，通过三维重建和矢量分析测量细胞数量、大小、面积及位置，揭示脑结构中的空间组织模式。该方法可提高神经科学研究的可重复性和准确性。

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本工作由加拿大卫生研究院资助，资助/奖项编号：14392。

<ol><li>Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+rhythmogenic+domains+defined+by+astrocytic+networks+in+the+trigeminal+main+sensory+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus.</a> Glia. 66 (2), 311-326 (2018).</li>
<li>Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+calcium%3A+homeostasis+and+signaling+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Review%22%5BJournal%5D)">Glial calcium: homeostasis and signaling function.</a> Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).</li>
<li>Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+glial+cells+contribute+to+motor+control%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">How do glial cells contribute to motor control?</a> Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).</li>
<li>Verkhratsky, A., Steinhauser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+in+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Review%22%5BJournal%5D)">Ion channels in glial cells.</a> Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).</li>
<li>Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotransmitter+Release+from+Astrocytes%3A+Functional%2C+Developmental%2C+and+Pathological+Implications+in+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain.</a> Frontiers Neuroscience. 9, 499(2015).</li>
<li>Montero, T. D., Orellana, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemichannels%3A+new+pathways+for+gliotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release.</a> Neuroscience. 286, 45-59 (2015).</li>
<li>Araque, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotransmitters+travel+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Gliotransmitters travel in time and space.</a> Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).</li>
<li>Augustin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anisotropic+panglial+networks+in+the+lateral+superior+olive%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive.</a> Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).</li>
<li>Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction-mediated+astrocytic+networks+in+the+mouse+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex.</a> Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).</li>
<li>Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+astroglial+networks+in+olfactory+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+State+of+America%22%5BJournal%5D)">Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).</li>
<li>Morquette, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+astrocyte-dependent+mechanism+for+neuronal+rhythmogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).</li>
<li>Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+intrinsic+bursting+in+trigeminal+sensory+neurons+parallels+the+acquisition+of+mastication+in+weanling+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).</li>
<li>Anders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+properties+of+astrocyte+gap+junction+coupling+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Science%22%5BJournal%5D)">Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).</li>
<li>Houades, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shapes+of+astrocyte+networks+in+the+juvenile+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biology%22%5BJournal%5D)">Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain.</a> Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).</li>
<li>Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+metabolic+networks+sustain+hippocampal+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission.</a> Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).</li>
<li>Claus, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barreloid+Borders+and+Neuronal+Activity+Shape+Panglial+Gap+Junction-Coupled+Networks+in+the+Mouse+Thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).</li>
<li>Cameron, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Incubation+of+Acute+Neuronal+Tissue+for+Electrophysiology+and+Calcium-imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).</li>
<li>Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+profile+and+properties+of+sulforhodamine+101--Labeled+glial+cells+in+acute+brain+slices+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Developmental profile and properties of sulforhodamine 101--Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).</li>
<li>Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+and+pannexin+hemichannels+in+brain+glial+cells%3A+properties%2C+pharmacology%2C+and+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 88(2013).</li>
<li>Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Ca%282%29%28%2B%29+acts+as+a+mediator+of+communication+from+neurons+to+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia.</a> Science Signaling. 5 (208), ra8(2012).</li>
<li>Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+hemichannels+in+astrocytes%3A+a+novel+mechanism+of+glutamate+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release.</a> Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).</li>
<li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+coupling+confers+isopotentiality+on+astrocyte+syncytium%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium.</a> Glia. 64 (2), 214-226 (2016).</li>
<li>Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+coupling+between+hippocampal+astrocytes+in+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices.</a> Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).</li>
<li>Ransom, B. R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+coupling%2C+without+dye+coupling%2C+between+mammalian+astrocytes+and+oligodendrocytes+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture.</a> Glia. 3 (4), 258-266 (1990).</li>
<li>Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+frequent+failure+of+lucifer+yellow+to+pass+between+two+electrically+coupled+neurons+in+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).</li>
<li>Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Tracer+Coupling+between+Pairs+of+Identified+Neurones+of+the+Mollusc+Lymnaea+Stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis.</a> Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).</li>
<li>Griemsmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Panglial+Gap+Junction+Networks+in+the+Thalamus%2C+Neocortex%2C+and+Hippocampus+Reveals+a+Unique+Population+of+Glial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells.</a> Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329 (5991), 571-575 (2010).</li>
<li>Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+release+prostaglandin+E2+to+modify+respiratory+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity.</a> eLife. 6, (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

存在多种电生理学方法可用于评估星形胶质细胞之间的功能耦合23,24然而，这些方法无法提供有关星形胶质细胞网络解剖结构排列的信息。已有大量研究表明 &#34;染料或示踪剂偶联&#34;，如本研究中所示，仅发生在通过电生理方法检测到的部分偶联细胞中25,26,27，表明该方法检测到的细胞数量被低估。然而，这仍是观察偶联现象的最佳方法。当使用分子量小于1-1.2 KDa的示踪分子穿透间隙连接时，可获得更强的染料偶联。20通过监测荧光葡萄糖衍生物（2-NBDG）或荧光标记物（如某些Alexa染料或Lucifer Yellow）的扩散，可实现对耦合的活体可视化。13但由于其分子较小，生物胞素能产生更好的效果，并可在固定组织中进行定量分析。因此需注意，该...

许多研究描述了神经元与星形胶质细胞在亚细胞或突触水平上的相互对话如何影响神经元功能和突触传递。已明确星形胶质细胞对周围神经元活动具有敏感性；事实上，它们表达多种神经递质的受体，包括谷氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）、乙酰胆碱和三磷酸腺苷（ATP）（参见先前发表的综述2,3,4）。反过来，星形胶质细胞的突起包绕突触结构，并通过调节细胞外离子稳态以及释放多种因子或递质（如谷氨酸、D-丝氨酸和ATP），在突触部位及突触外位点影响神经元活动5,6,7。
有研究提出，星形胶质细胞还能够在网络层面调节神经元功能。证据表明，星形胶质细胞之间的耦合在空间上受到调控，并与具有明确解剖分区区域（如具有感觉表征的区域）中的神经元分段相对应，这表明星形胶质细胞倾向于与执行相同功能的其他星形胶质细胞发生耦合，而不仅仅是与邻近的细胞耦合。例如，在外侧上橄榄核中，大多数星形胶质细胞网络的排列方向与音调定位轴垂直8；而在桶状皮层或嗅小球中，星形胶质细胞之间的通讯在同一个桶状结构或嗅小球内部更强，而在相邻结构之间较弱9,10。在这两种情况下，星形胶质细胞网络均朝向嗅小球或桶状结构的中心排列9,10。
我们最近发现，星形胶质细胞活动通过降低细胞外 Ca²⁺ 浓度来调节神经元放电2+ ([Ca2+]e），可能是通过释放S100β（一种Ca2+结合蛋白11该效应在三叉神经主感觉核背侧部（NVsnpr）的一群三叉神经节律性神经元中得到证实，该区域被认为在咀嚼运动的产生中起重要作用，其机制在于这些神经元的节律性放电依赖于一种持续性钠电流（persistent Na⁺ current）。+ 由[Ca浓度降低所促进的电流2+]e11,12这些神经元中可诱发节律性放电 &#34;生理上&#34; 通过刺激其输入或人工降低[Ca2+]e我们进一步证明，星形胶质细胞间的耦合是神经元节律性放电所必需的1这提出了星形胶质细胞网络可能形成特定的功能域，在其中神经元活动能够实现同步与协调的可能性。为了验证这一假设，我们首先需要建立一种方法，以严格记录这些网络在NVsnpr中的组织结构。
以往关于星形胶质细胞网络的研究主要以细胞数量、连接密度以及覆盖的面积来描述其耦合程度。对星形胶质细胞网络形态及染料耦合方向的评估，大多通过比较在桶状皮层9、海马13,14,15、丘脑的桶状核区16、外侧上橄榄核8、嗅球小球10以及皮层14中沿两个轴（x轴和y轴）方向的网络大小来进行。本文所述方法可实现对网络中标记细胞的无偏计数，并估算其覆盖的面积。我们还开发了用于定义网络内耦合的优先取向，并判断该优先取向是否指向核团中心或其他方向的分析工具。与以往方法相比，本方案提供了一种描述诸如背侧三叉神经主感觉核等缺乏明确解剖分区结构中星形胶质细胞网络组织与取向的手段。在上述研究中，网络取向通常被描述为与结构自身已有明确记录的形态之间的关系（例如，丘脑中的桶状核、皮层中的桶状结构、海马和皮层中的分层结构、嗅球中的小球结构等）。此外，矢量分析方法使得在不同条件下揭示的耦合取向之间可进行比较。为了分析这些参数是否随网络在核团内的位置而变化，我们还建立了一种方法，将每个网络相对于核团边界进行定位还原。这些工具可轻松适用于其他脑区，用于研究耦合细胞网络。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemicals</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO4</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemicals</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemicals</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt; 无水葡萄糖</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 二水合物</td><td>Sigma</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖酸钾盐</td><td>Sigma</td><td>G45001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;无水</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>ATP&lt;sub&gt;Tris 盐&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>GTP&lt;sub&gt;Tris 盐&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>生物胞素</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>甘珀酸二钠盐</td><td>Sigma</td><td>C4790</td><td></td></tr><tr><td>亲和素-生物素复合物：ABC试剂盒</td><td>Vestor Laboratories</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-Alexa 594</td><td>Molecular Probes</td><td>S11227</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通</td><td>Fisher Chemicals</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Chemicals</td><td>X5-1</td><td></td></tr><tr><td>水性封片剂1：Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>甲苯基合成树脂封片剂：Permount</td><td>Fisher Chemicals</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>载玻片干燥台</td><td>Fisherbrand</td><td>11-474-470</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-544A</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片 ColorFrost</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisherchemicals</td><td>04042-500</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FluoView FV 1000 共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40X 水浸物镜</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>20X 水浸物镜</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFL20XW</td><td></td></tr><tr><td>4X 水浸物镜</td><td>Olympus</td><td>XLFLUOR4X/340</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP 225</td><td></td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>Sony</td><td>CX-ST50</td><td></td></tr><tr><td>黑白监视器</td><td>Sony</td><td>SSM-125</td><td></td></tr><tr><td>Digidata</td><td>Molecular Devices</td><td>1322A</td><td></td></tr><tr><td>膜片钳放大器</td><td>Axon Instrument</td><td>Mulitclamp 700A</td><td></td></tr><tr><td>电生理数据采集软件</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 8</td><td></td></tr><tr><td>电生理数据分析软件</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampfit 8</td><td></td></tr><tr><td>成像分析软件</td><td>ImageJFIJI</td><td>开源软件，包含插件包的FIJI版本</td><td></td></tr><tr><td>矢量图像编辑器</td><td>Adobe</td><td>Illustrator CS4</td><td></td></tr><tr><td>电子表格应用程序</td><td>Microsoft Office</td><td>Excel 2010</td><td></td></tr></tbody></table>

分析耦合星形胶质细胞网络的大小、形状和方向性

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

越来越多的研究表明，星形胶质细胞不仅在突触和单细胞水平上调节神经元功能，还在神经网络水平上发挥调节作用。星形胶质细胞通过缝隙连接相互紧密连接，而这些连接处的耦合是动态且高度受调控的。近年来逐渐形成的一个新概念是，星形胶质细胞的功能具有特异性，并且会根据其所关联的神经环路功能进行适应性调整。因此，需要建立能够测量星形胶质细胞网络多种参数的方法，以更准确地描述其通信和耦合所遵循的规律，并进一步理解其功能。
本文利用图像分析软件（例如，ImageJFIJI），介绍了一种用于分析通过染料偶联揭示的星形胶质细胞网络共聚焦图像的方法。该方法可实现：1）对标记细胞进行自动化且无偏倚的检测；2）计算网络的大小；3）计算染料在网络内扩散的优先方向；4）将网络重新定位至感兴趣区域。
该分析可用于表征特定区域的星形胶质细胞网络，比较与不同功能相关的不同区域的网络，或比较在不同条件下获得的、对细胞间偶联产生不同影响的网络。这些观察结果可能引出重要的功能学思考。例如，我们分析了三叉神经核团中的星形胶质细胞网络，在此前的研究中已证明，该区域星形胶质细胞的偶联对于神经元从紧张性放电转变为节律性爆发放电至关重要1。通过测量该核团中星形胶质细胞网络的大小、空间局限性及其优势取向，我们可以对其所限定的功能域提出假设。已有若干研究表明，其他多个脑区（包括桶状皮层、外侧上橄榄核、嗅球小球层、丘脑感觉核团以及视觉皮层等）也可能受益于类似的分析方法。

脑内细胞间的耦合并非静态，而是受到多种因素动态调控。所描述的方法旨在分析不同条件下显现的星形胶质细胞网络，并理解其在NVsnpr中的组织方式。这些结果已发表1。我们在三种不同条件下，对NVsnpr背侧部单个星形胶质细胞进行生物胞素填充：静息状态（无任何刺激的对照条件）、无Ca2+环境，以及对投射至该核团的感觉纤维进行电刺激后。每种条件下星形胶质细胞生物胞素填充的实验设置如图6A-C左侧所示。
在对照条件下观察到生物胞素标记细胞的网络，证实了NVsnpr星形胶质细胞在静息状态下存在基础的细胞间偶联。在11个测试样本中，生物胞素扩散形成的网络由11 ± 3个细胞组成（图6A 中间图，图6D</s...

本文介绍了一种评估星形胶质细胞网络结构的实验方案。该方法可最大限度地减少偏差，提供对这些网络的描述性测量指标，如细胞数量、大小、面积以及在核团内的位置。各向异性通过矢量分析进行评估。

星形胶质细胞不仅在突触和单细胞水平上调节神经元功能，而且在网络水平上也发挥调节作用，这一点已变得越来越明确。

该方法有助于解答有关星形胶质细胞网络在脑结构中组织方式的关键问题。此技术的主要优势在于，它提供了一种无偏倚的方法来计数标记细胞，并记录其在特定结构内的解剖学分布。打开 ImageJFIJI，选择所需文件，然后在生物格式的导入选项窗口中点击“确定”。为了重新定义一个仅包含最终Z堆栈所需光学切片的Z堆栈，首先选择STK和Z投影，然后点击工具栏中的堆栈旋钮。在投影类型设置中选择最大强度。保存文件，并将其命名为堆栈文件。如果成像文件包含多个通道，请使用图像颜色和拆分通道功能，仅显示星形胶质细胞网络图像的通道。通过选择图像、属性、像素，并将像素尺寸设为1，来检查图像的像素设置。然后通过打开处理菜单并选择背景减除工具，去除生物胞素标记的背景信号。使用预览功能设置滚动球半径，通常设置为 50 像素。如果在减去背景步骤后仍需要进一步降低噪声，请选择“处理”、“噪声”和“去除异常值”。在“异常值类型”设置中选择“亮”，并使用预览功能设置半径和阈值。使用去除异常值工具时需谨慎，因为该工具可能会模糊数据，如此处所示。通过图像、调整、阈值来调节阈值。选择默认值以及黑白模式。单击应用。通过选择处理、二值化、生成二值图像，使用二值化处理工具将图像转换为二值图像。将文件保存为 tiff 文件，并将其命名为二值文件。进行细胞计数时，首先通过点击“分析”并设置测量类型来设定测量方式，然后选择“质心”选项。确保二值图像文件已在屏幕上打开。再次打开分析菜单，然后选择“分析颗粒”。接着，选择“显示”和“轮廓”。这将生成一个新文件，显示检测结果。优化参数以优化检测效果。若仅检测细胞，请使用30至6000之间的大小值，以及0到1之间的圆形度值，其中1代表完美的圆形，0代表任意形状。单击“确定”运行检测。将出现两个表格：一个名为“摘要”的表格，提供检测到的细胞数量；另一个名为“结果”的表格，提供每个细胞的X和Y坐标。复制这些数值并粘贴到电子表格应用程序中。将此表格另存为“检测表”。同时，还将生成一个包含已检测细胞图像的文件。将此文件另存为名为“检测文件”的 tiff 文件。如果使用“分析粒子”工具将两个或多个标记的细胞检测为单个细胞，请在应用“分析粒子”工具之前，通过选择“处理”、“二值化”和“分水岭”工具对二值图像进行分水岭处理。要测量网络的表面积，请在 ImageJ 中使用检测文件。单击鼠标左键以在工具栏中选择多边形选择工具。再次单击鼠标左键，开始勾画一个连接网络外部边缘所有细胞的兴趣区域（ROI）。单击鼠标右键以闭合多边形。打开测量设置窗口，选择区域选项。然后打开ROI管理器，通过点击“添加”将绘制的多边形加入ROI管理器中。在ROI管理器中点击“测量”以运行测量。面积测量结果将显示在一个表格中，并以像素为单位表示。请勿忘记使用所用显微镜的转换系数，将该数值转换为平方微米。在 ImageJFIJI 中打开堆栈文件，并通过较强的标记强度识别已进行膜片钳的细胞。然后在电子表格应用程序中打开名为“detection table”的文件，找到与 patched cell 相关联的编号及其对应的坐标。如果无法准确确定 patched cell，可使用多边形工具圈选出生物胞素沉积较密集的区域，并将该位置视为 patched cell 的位置。与之前相同，使用 ROI manager 在 patched cell 所在位置绘制一个 ROI，并将其添加到 ROI manager 中。接下来，设置测量并选择质心选项。在 RIO 管理器中，点击“测量”以获取所绘制区域质心的坐标。将这些坐标用作该特定网络的参考点。使用此公式计算每个细胞相对于所记录星形胶质细胞的坐标。将每个细胞的坐标表示为相对于所记录星形胶质细胞的位置，是计算从所记录星形胶质细胞出发的矢量的重要步骤。使用此公式计算优势取向主矢量的坐标。网络优势取向的主要向量是网络中每个细胞先前计算出的所有向量的总和。将主向量的长度除以网络中的细胞数量减一（以排除被记录的细胞），以标准化数值并实现不同网络之间的比较。为确定每个网络在目标细胞核中的位置，首先使用矢量图像编辑器打开四通道x图像。在尺寸窗口中将各维度乘以五，以增大四倍图像的尺寸。此处，图像的采样尺寸为 800 × 800 像素，因此采样分辨率更改为 4000 × 4000 像素。将文件以 TIFF 格式导出，并将其命名为 resized four x。将调整大小后的4倍图像的左上角与Adobe Illustrator文档的左下角对齐。该软件的坐标系以左下角为参考点。打开网络的20倍图像。使用二值文件或检测文件，因为它们更容易进行对齐。然后，调整20倍图像二值文件的不透明度工具，使其与重新调整大小的4倍图像对齐。对齐完成后，选择并按住移液器工具，使测量工具出现，然后在左侧工具栏中选择该工具。使用测量工具点击 20 x 图像的左上角，以获取该 20 x 参考点在重缩放后的 4 x 图像上的坐标。这些 20 x 参考坐标可用于在细胞核示意图上表示每个网络的位置。为汇总数据，将细胞核归一化为一个矩形。为此，请使用多边形工具在已调整大小的4倍图像中圈选出细胞核。然后打开ROI管理器，添加所绘制的感兴趣区域（ROI）。如果细胞核边界无法看清，请使用带有透明光效的图像，此时需记得先进行图像缩放。在设定测量时，选择“边界矩形”选项，以计算所绘制细胞核内的最小矩形。最后点击“测量”，然后按照书面实验方案中的步骤，将标记细胞的坐标表示在由边界矩形所代表的标准化细胞核中。位于三叉神经主感觉核背侧的一个星形胶质细胞被SR101标记，被选中进行全细胞记录，并灌注了0.2%生物胞素（biocytin）。对第五束进行电刺激会增加三叉神经主感觉核背侧部分的生物胞素标记，表明偶联细胞数量增加。星形胶质细胞网络局限于三叉神经主感觉核背侧部分及其主要取向内。该技术最初用于确定星形胶质细胞网络在特定结构中的位置，但也可用于表达任何结构中标记细胞群体的位置。

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科研

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神经科学

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本文描述了从分离的海马体制备急性脑切片的方法，以及在刺激Schaffer侧支的同时，对辐射层中的星形胶质细胞和神经元进行同步电生理记录的技术。同时演示了药理学分离星形胶质细胞钾离子和谷氨酸转运体电流的方法。...

急性海马脑片中突触激活的星形胶质细胞与神经元反应的双通道电生理记录

本文介绍了一种用于诱导神经元稳态可塑性的方案改良方法，以研究星形胶质细胞G蛋白偶联受体的可塑性。该方法近期已被用于检测幼年小鼠星形胶质细胞I型代谢型谷氨酸受体（mGluRs）的变化，也可应用于测量成年小鼠组织中多种星形胶质细胞GPCR的表达上调或下调，可在原位（in situ）和在体（in...

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中枢神经系统中的星形胶质细胞在受到有害刺激时会改变其功能和结构特性。本报告介绍了一种在疾病状态或治疗干预后评估星形胶质细胞三维形态的实验方案。...

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我们展示了在一种新型生物材料包被中，自组装形成的三维结构，其中星形胶质细胞的胞体及其突起沿纵向整齐排列成束。这些工程化的"活体支架"具有微米级直径，却可延伸至厘米级长度，可作为研究神经发育机制的实验平台，或通过引导神经元迁移和/或轴突导向来促进神经再生。...

三维组织工程化定向星形胶质细胞网络以模拟发育机制并促进神经系统再生

此处描述的AWESAM方案是快速、简便且经济地从其他脑细胞中分离培养小鼠星形胶质细胞的最佳方法。AWESAM星形胶质细胞表现出自发性Ca2+ 与星形胶质细胞相似的信号传导、形态及基因表达谱 体内.

培养 在体 内使用快速、简单且经济的AWESAM方案培养类小鼠星形胶质细胞

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利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型

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使用 Lucifer Yellow 离子电泳技术可视化星形胶质细胞形态

本文介绍了一种体外活体成像方法，用于可视化小鼠星形胶质细胞中细胞器的细胞内运输以及质膜蛋白的转运过程。该方案还提供了一种图像分析方法，用于确定货物运输的路径和动力学特征。...

可视化与分析星形胶质细胞内细胞器及其他货物的胞内运输

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透明化大脑中星形胶质细胞与神经元空间相互作用的研究

本方案描述了对小鼠脑组织游离切片进行切片、染色和成像的方法，随后详细介绍了星形胶质细胞区域体积以及星形胶质细胞区域重叠或拼接的分析方法。...

星形胶质细胞区域体积与拼接在厚切游离组织切片中的分析

学习使用ImageJFIJI分析星形胶质细胞网络的无偏方法，通过三维重建和矢量分析测量细胞数量、大小、面积及位置，揭示脑结构中的空间组织模式。该方法可提高神经科学研究的可重复性和准确性。

分析耦合星形胶质细胞网络的大小、形状和方向性

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