Name: 三维组织工程化排列的星形胶质细胞网络, 以概括发展机制和促进神经系统再生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学习利用水凝胶微柱自组装三维星形胶质细胞束的方法，用于神经再生治疗。该技术通过模拟天然神经解剖结构，促进神经元迁移和轴突导向，为中枢神经系统损伤修复提供新型体外模型。

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财务支持由美国国立卫生研究院提供［U01-NS094340（Cullen） &amp;#38; F31-NS090746（Katiyar）]，迈克尔·J·福克斯基金会[治疗管线项目#9998（Cullen）]，宾夕法尼亚大学医学院神经科学中心试点奖（Cullen），美国国家科学基金会[研究生研究奖学金DGE-1321851（Struzyna）]，美国退伍军人事务部[RR&amp;#38;D 优秀奖评审 #B1097-I（Cullen），以及美国陆军医学研究与物资司令部 [#W81XWH-13-207004（Cullen）] &amp;#38; W81XWH-15-1-0466（Cullen）]

作者无任何利益冲突需要披露。

与周围神经系统（PNS）较为支持性的环境相比，中枢神经系统（CNS）在应对神经损伤和神经退行性病变的有害后果方面能力尤为有限。在哺乳动物中枢神经系统遭受严重损伤后，会形成胶质瘢痕，其核心由纤维化细胞和炎性细胞构成，外围则被一层致密无序的反应性星形胶质细胞网络所包围，这些星形胶质细胞分泌抑制轴突再生的蛋白聚糖。14该瘢痕对轴突末端的再生起到物理和生化层面的阻碍作用12此外，成年哺乳动物中枢神经系统在创伤或神经退行性病变导致细胞丢失后，可用于补充新神经元的来源十分有限，因为具有神经发生能力的区域仅局限于侧脑室下区（SVZ）、海马齿状回，以及可能存在的其他通常处于非活跃状态的区域。54一种理想策略应能规避中枢神经系统（CNS）有限再生能力的两个方面，而现有方法尚无法解决这一问题。为此，本研究团队开发了基于星形胶质细胞的支架结构，旨在为神经元向神经元缺失区域迁移以及再生轴突生长锥的定向延伸提供活体通路。这些星形胶质细胞活体支架由包裹在琼脂糖微柱内部的胶原基质中排列整齐的星形胶质细胞束构成。与传统用于中枢...

中枢神经系统（CNS）在对抗神经元丢失和/或轴突通路功能障碍方面的能力有限，这些情况常见于创伤性脑损伤（TBI）、脑卒中、脊髓损伤（SCI）以及神经退行性疾病1,2,3,4,5。CNS中的神经发生仅局限于脑部少数特定区域，这限制了丢失神经元的再生6,7。此外，由于缺乏定向引导、存在轴突发育抑制因子以及神经组织损伤后出现的反应性星形胶质细胞增生，CNS中丢失的轴突通路再生能力不足2,8,9,10。星形胶质细胞通常在维持离子稳态、神经递质清除、突触形成以及神经血管耦合等方面发挥多种支持神经元的功能11。然而，即使神经组织受到轻微损伤，星形胶质细胞也可能发生分子、结构和功能上的改变，并转变为肥大状态11。在严重神经创伤的响应中，这些变化导致形成一种具有“半暗带”的瘢痕结构，其中半暗带包含迁移的反应性星形胶质细胞，而病灶核心则包括从破裂的血脑屏障（BBB）渗漏的白细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和成纤维细胞11,12,13。这些反应性星形胶质细胞呈现出丝状、无序的突起形态，并表现出中间丝蛋白和硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）表达升高，从而阻碍神经再生12。尽管胶质瘢痕最初有助于恢复血脑屏障的完整性，并防止炎症反应向周围健康组织扩散，但它却成为阻碍轴突再生的物理和生化屏障12,14,15,16。例如，遇到胶质瘢痕的轴突会形成肿胀的营养不良性生长锥，并出现生长受阻12。此外，损伤后星形胶质细胞突起的紊乱排列也阻碍了再生轴突的延伸17。这些抑制性特征的结果表现为严重神经创伤（包括TBI和SCI）患者常出现的持久性身体和神经功能障碍。
尽管中枢神经系统（CNS）的功能性再生面临诸多外在挑战，但已有研究表明轴突本身具备内在的再生能力。例如，与胶质瘢痕接触的营养不良性生长锥具有动态特性，提示这些末端仍保留着延伸能力12。因此，人们认为阻碍轴突再生的主要因素是损伤后中枢神经系统的抑制性微环境，而通过减少胶质瘢痕形成和/或在瘢痕区域构建再生桥梁以提供更有利的微环境将具有显著优势。事实上，先前的研究已证明，中枢神经系统神经元能够利用外周神经移植物作为桥梁，穿过损伤区域延伸轴突，因为外周神经移植物为轴突再生提供了更有利的环境12,18,19。已有多种策略致力于利用这种残存的再生潜能。例如，在多种损伤模型中调控细胞生长信号通路，已实现轴突再生并减少胶质瘢痕形成10,20,21。此外，研究显示，使用软骨素酶ABC处理可切断大多数硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）的糖链，从而减轻反应性星形胶质细胞分泌的CSPGs所产生的抑制效应22。尽管结果令人鼓舞，但这些方法无法为生长锥提供定向引导，可能导致异常再生12，同时也未能解决神经元丢失的问题。基于细胞的策略已被用于尝试克服胶质瘢痕的影响并补充丢失的细胞，尤其是神经元。一些研究团队将反应性星形胶质细胞去分化为神经元，而另一些团队则将神经前体细胞移植至中枢神经系统损伤区域，以重建损伤部位并促进轴突再生23,24,25。然而，单纯干细胞移植受限于细胞存活率低、整合效果差以及在受损组织中滞留能力弱等问题5。此外，这些基于细胞的策略尚无法恢复长距离的轴突通路，尤其难以实现可控性的重建。因此，研究人员正在探索将生物材料与其他方法结合，作为递送多种神经细胞、前体细胞及生长因子的载体26。基于生物材料的策略具有高度的设计可控性，可构建出模拟靶组织三维（3D）微环境中特定物理、触向性和趋化性信号的结构27,28,29,30,31,32,33,34。重现这些微环境信号对于移植细胞表现出类似天然的形态、增殖、迁移和信号传导等神经生物学特性至关重要29。尽管具备上述优势，但仍需突破传统细胞接种型生物材料支架的局限，以同时促进定向的长距离轴突再生并替代丢失的神经元。
一种颇具前景的替代方法基于神经组织工程构建的“活体支架”，该方法与其他基于细胞的策略不同，因其含有具备预先形成的细胞结构的活神经细胞，能够模拟天然神经解剖结构和/或发育机制，从而促进神经环路的靶向替代、重建与再生4,35设计活体支架时需考虑神经细胞的表型与来源，以及由相关生物材料组成所决定的力学/物理特性和生化信号35. 制备完成后 体外，这些活体支架可被植入 体内 呈递细胞黏附分子以及趋化和神经营养信号，以根据再生过程的状态和进展主动调控神经细胞迁移和轴突生长35胶质细胞可作为构建活体支架工程化细胞结构的基础，因为这些细胞介导多种发育机制。 体内在大脑发育过程中，新生神经元依赖于放射状胶质细胞从脑室区向发育中的皮质板延伸的基底突起，作为其定向迁移的活体支架36,37此外，生长锥通过感知胶质引导细胞发出的吸引性和排斥性信号来调整自身方向，而所谓的“先驱”轴突则通过沿预先形成的胶质支架延伸，从而到达正确的靶目标。35,38,39因此，胶质细胞对于引导先驱性轴突至关重要，这些先驱性轴突随后作为基于轴突的“活体支架”，引导“追随者”轴突的投射。此外，已有研究表明，胶质细胞介导的生长机制在出生后仍然持续存在，神经母细胞沿吻侧迁移流（RMS）从侧脑室下区（SVZ）——成年大脑中为数不多的神经发生区域之一——迁移至嗅球（OB）。40。这些神经母细胞在放射状胶质细胞形成的管道内沿RMS迁移（图1A-1，由纵向排列的星形胶质细胞突起通过直接的细胞间黏附和局部可溶性因子组成37,41最后，哺乳动物中枢神经系统损伤会导致星形胶质细胞突起排列紊乱，形成胶质瘢痕，从而在物理上阻碍轴突再生17，许多非哺乳类生物系统缺乏有害胶质瘢痕的形成。相反，非哺乳类物种的胶质细胞保持更有序、排列更整齐的结构，作为穿越损伤区域的引导通路17,42,43例如，在非哺乳动物的SCI模型中，轴突被发现与跨越损伤区域的胶质桥紧密相关，表明有序的胶质支架作为促进轴突再生和功能恢复的基质具有重要作用（图1A-2)42,44,45上述神经解剖学特征及发育/再生机制的重现，可能催生一类新型的工程化胶质细胞支架，这类支架能够在原本不具备支持性的环境中，同时促进未成熟神经元的迁移和轴突导向，从而有望减轻中枢神经系统损伤和疾病相关的神经元及轴突束退行性变化。
我们的研究团队先前已分别通过微组织工程神经网络（micro-TENNs）和组织工程神经移植物（TENGs），为中枢神经系统和周围神经系统（PNS）内轴突束的重建与再生设计了多种类型的活体支架。27,46,47,48两种策略本质上均基于仿生学原理。微神经组织（Micro-TENNs）是受解剖结构启发的装置，旨在结构和功能上替代连接脑内不同神经元群体的轴突束。神经束引导导管（TENGs）则利用轴突促进轴突再生的发育机制，即“追随”轴突沿“先驱”轴突生长，从而实现宿主轴突的靶向再生。35,46,48我们近期利用了活体支架技术的多功能性，采用与微组织工程神经网络（micro-TENNs）相似的包封策略，并借鉴了发育过程中普遍存在的胶质细胞相关机制。在此，我们开发出一种构建体，由沿水凝胶微柱胶原腔内排列的星形胶质细胞束组成。49这些星形胶质细胞活体支架的制备首先是在毛细管-针灸针组件中填充液态琼脂糖，以形成具有外径（OD）和内径（ID）的中空圆柱形水凝胶，其外径和内径分别对应于毛细管和针灸针的直径。琼脂糖凝胶化后，将水凝胶微柱从毛细管中取出，随后在其中空内表面涂覆I型胶原蛋白，以提供利于星形胶质细胞黏附及定向束状结构形成的微环境。图1B-1）。随后，将出生后幼鼠大脑皮层星形胶质细胞接种至管腔内。图1B-2）。与依赖电场、微图案沟槽和细胞外基质（ECM）蛋白图案化的二维（2D）排列技术不同，活体支架技术中星形胶质细胞的排列依赖于可控变量（如基底曲率（柱ID）、细胞密度和胶原蛋白浓度）引导的自组装过程50,51,52星形胶质细胞收缩并重塑胶原，呈现出双极、纵向排列的形态，类似于所观察到的天然支架结构 体内 (图1B-3）。事实上，我们正在积极探索将这些电缆状结构用作物理基质，以引导未成熟神经元的定向迁移，并促进轴突在受损中枢神经系统不利环境中的再生，特别是哺乳动物的胶质瘢痕环境。图1C）。本文将详细介绍星形胶质细胞微柱的制备方法、预期细胞结构的相差显微图像与免疫荧光图像，并对该技术目前的局限性及未来发展方向进行系统性讨论。
<img alt="神经生物学启发示意图：胶质桥通过微柱结构引导轴突再生。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55848/55848fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：有序星形胶质细胞网络的灵感来源、制备方案及预期应用。 (A) 神经生物学启发：(1) 来源于生神经的室管膜下区（SVZ）的神经前体细胞利用吻侧迁移流（RMS）中纵向排列的胶质管进行定向迁移，最终到达嗅球（OB）；(2) 两栖类和鱼类等非哺乳动物在神经组织损伤后能够持续再生，部分原因在于形成了连接损伤两端的胶质桥例如 横断的脊髓）并作为引导再生轴突的支架。 (B) 制备流程概述：（1）构建微米级中空水凝胶微柱，其内腔表面包被细胞外基质（ECM）；（2）接种从新生大鼠幼崽分离的原代皮层星形胶质细胞；（3）在培养过程中形成纵向取向的束状结构并实现自组装；（4）将束状结构从生物材料包埋结构中取出，用于后续的移植研究。C) 体内 应用：（1）这些活体支架可作为工程化胶质导管，引导神经元从神经发生中心定向迁移，以重建神经元缺失区域；（2）重现发育过程中先驱轴突导向的机制以及非哺乳动物中胶质桥介导的再生机制，可能赋予这些星形胶质细胞支架以引导轴突穿越哺乳动物非允许性胶质瘢痕环境的能力。 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55848/55848fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>针灸针（300 &amp;micro;m 直径）</td><td>Lhasa Medical</td><td>HS.30x40</td><td>可根据所需微柱管腔尺寸调整直径。</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher</td><td>08772B</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Invitrogen</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯一次性血清移液管</td><td>Fisher</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>微升玻璃毛细管（701 &amp;micro;m）</td><td>Fisher</td><td>21-170J</td><td>可根据所需微柱外壳尺寸调整直径。</td></tr><tr><td>微毛细管吸头吹气球</td><td>Fisher</td><td>21-170J</td><td>吹气球随微毛细管配套提供。</td></tr><tr><td>加热板</td><td>Fisher</td><td>SP88857200</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td>Fisher</td><td>1451352</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Sigma</td><td>Z683884-1EA</td><td></td></tr><tr><td>25 mm 规格针头</td><td>Fisher</td><td>14-826-49</td><td></td></tr><tr><td>微型手术刀</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6270</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14081-09</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>热珠灭菌器</td><td>Sigma</td><td>Z378550-1EA</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>微型刮勺</td><td>Fisher</td><td>S50821</td><td></td></tr><tr><td>大鼠尾型 I 型胶原蛋白</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>保持在 4 &amp;ordm;C，仅在需要时取出。使用时用冰保持其温度。</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Fisher</td><td>02-681-256</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Fisher</td><td>SS2661</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Fisher</td><td>SA48-1</td><td></td></tr><tr><td>石蕊试纸</td><td>Fisher</td><td>09-876-18</td><td></td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Invitrogen</td><td>14170112</td><td>储存于 4 &amp;ordm;C。</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>储存于 -20 &amp;ordm;C，使用前在 37 &amp;ordm;C 预热。</td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶（DNase）I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>储存于 -20 &amp;ordm;C，使用前在 37 &amp;ordm;C 预热。</td></tr><tr><td>含 Ham's F-12 营养混合物的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>储存于 4 &amp;ordm;C。</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11195</td><td>储存于 -20&amp;ordm;C。</td></tr><tr><td>出生后第 0 天或第 1 天的 Sprague Dawley 大鼠幼崽</td><td>Charles River</td><td>Strain 001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 胚胎神经元基础培养基</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td>储存于 4&amp;ordm;C，使用前在 37 &amp;ordm;C 预热。</td></tr><tr><td>B-27 无血清添加剂</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>储存于 -20 &amp;ordm;C，使用前在 37 &amp;ordm;C 预热。</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>储存于 -20 &amp;ordm;C，使用前在 37 &amp;ordm;C 预热。</td></tr><tr><td>G5 星形胶质细胞添加剂</td><td>Invitrogen</td><td>17503012</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley 胚胎第 18 天大鼠</td><td>Charles River</td><td>Strain 001</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>Fisher</td><td>22-042816</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>EMESCO</td><td>1194-352099</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Fisher</td><td>05-413-115</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Fisher</td><td>13 998 076</td><td></td></tr><tr><td>40% 甲醛</td><td>Fisher</td><td>F77P-4</td><td>甲醛是一种已知的致癌性有毒化合物，必须单独容器收集处理。</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Fisher</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>指甲油</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromont 封片介质</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>正常马血清</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）一抗</td><td>Millipore</td><td>AB5804</td><td>储存于 -20&amp;ordm;C。</td></tr><tr><td>鼠抗 β-微管蛋白 III 一抗</td><td>Sigma</td><td>T8578</td><td>储存于 -20&amp;ordm;C。</td></tr><tr><td>兔抗 I 型胶原蛋白一抗</td><td>Abcam</td><td>ab34710</td><td>储存于 -20&amp;ordm;C。</td></tr><tr><td>兔抗波形蛋白</td><td>Millipore</td><td>AB3400</td><td>储存于 -20&amp;ordm;C。</td></tr><tr><td>鼠抗巢蛋白</td><td>Millipore</td><td>AB5326</td><td>储存于 -20&amp;ordm;C。</td></tr><tr><td>驴抗鼠 568 二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td>储存于 4&amp;ordm;C。</td></tr><tr><td>驴抗兔 568 二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>储存于 4&amp;ordm;C。</td></tr><tr><td>驴抗兔 488 二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>储存于 4&amp;ordm;C。</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 三盐酸盐</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>储存于 4&amp;ordm;C。Hoechst 是一种已知的致突变剂，应视为致癌物处理，因此必须单独容器收集处理。</td></tr><tr><td>钙黄绿素 AM</td><td>Sigma</td><td>C1359</td><td>溶于无水 DMSO，浓度为 4 mM</td></tr><tr><td>碘化乙啶同聚物-1</td><td>Life Technologies</td><td>E1169</td><td>溶于 DMSO/H2O（1:4, v/v），浓度为 2 mM</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>A1RSI 激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>用于获取免疫标记结构的共聚焦重建图像。</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-S 显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>用于获取相差图像。配备 QiClick 相机，并通过 Nikon Elements Basic Research 软件（4.10.01 版）进行数字图像采集。</td></tr></tbody></table>

三维组织工程化定向星形胶质细胞网络以模拟发育机制并促进神经系统再生

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

神经创伤和神经退行性疾病常常导致持久的神经功能缺损，这是由于中枢神经系统（CNS）在替代丢失的神经元和再生轴突通路方面能力有限。然而，在神经系统发育过程中，神经元迁移和轴突延伸通常沿着由其他细胞形成的通路进行，这些通路被称为 &#34;活体支架&#34;旨在模拟这些机制并设计一种可规避中枢神经系统抑制性环境的策略，本文提供了一种用于构建组织工程星形胶质细胞支架的实验方案 &#34;活体支架&#34;采用一种新型生物材料包封方案构建这些结构，以诱导星形胶质细胞自组装形成致密的三维双极结构，其胞体与突起呈纵向排列。首先组装中空水凝胶微柱，并在其内腔表面包被胶原细胞外基质。随后将解离的大脑皮层星形胶质细胞导入圆柱形微柱的内腔，在特定内径条件下 &#60;350 µm，自发地自我对齐并收缩，形成由致密的星形胶质细胞突起和胶原原纤维束组成的长纤维状电缆结构，其直径为 &#60;直径150 µm但长度可达数厘米。这些人工构建的活体支架表现出 &#62;97% 的细胞存活率，并几乎完全由表达中间丝蛋白胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、波形蛋白（vimentin）和巢蛋白（nestin）的星形胶质细胞组成。这些定向排列的星形胶质细胞网络可为神经元黏附及定向神经突延伸提供有利的基质。此外，这些结构在从水凝胶包埋中取出后仍能保持完整性和定向排列，适用于中枢神经系统植入。这些预先构建的结构在形态上模拟了天然胶质细胞介导的细胞架构中的关键要素 &#34;活体支架&#34; 体内因此，这些人工构建的活体支架可作为研究神经发育机制的实验平台 体外 或通过引导神经元迁移和/或轴突导向来促进中枢神经系统退变后的神经再生 体内.

最初，采用相差显微镜观察星形胶质细胞黏附、束状结构形成及其细胞架构整体稳定性随时间的变化情况。接种1小时后，可见星形胶质细胞分布于微柱腔内，呈球形形态。图 2A）。在5小时时，星形胶质细胞开始伸出突起并发生收缩，到8小时时，细胞呈现出完整的具有突起的形态，并沿微柱的长轴方向形成类似电缆的结构。图 2A）。值得注意的是，与细胞最初在微柱间分散分布的状态相比，星形胶质细胞似乎收缩并沿内部形成致密束状网络 (图2B）。初始细胞排列完成后，星形胶质细胞网络常沿纵轴方向相互牵拉，形似拉链闭合，于微柱中心形成致密的束状结构。图 2C）。这种束状结构的形成源于自组装过程，部分由微柱内径（ID）和细胞密度的选择所决定。当星形胶质细胞接种于内径小于 350 µm (图3B</st...

我们展示了在一种新型生物材料包被中，自组装形成的三维结构，其中星形胶质细胞的胞体及其突起沿纵向整齐排列成束。这些工程化的&#34;活体支架&#34;具有微米级直径，却可延伸至厘米级长度，可作为研究神经发育机制的实验平台，或通过引导神经元迁移和/或轴突导向来促进神经再生。

神经创伤和神经退行性疾病常因中枢神经系统（CNS）再生能力有限而导致持久的神经功能缺损

本方案旨在指导在微米级水凝胶微柱内构建自组装、三维结构的星形胶质细胞胞体及突起纵向排列束，可用于体外神经生物学模型或神经再生治疗。由于中枢神经系统内存在抑制性环境，神经再生能力受限，因此创伤和神经退行性疾病对患者尤为有害。工程化的星形胶质细胞束通过模拟关键的神经解剖学特征以及胶质细胞介导的发育机制，克服了当前治疗策略的局限性，促进靶向性细胞迁移和轴突导向。这些星形胶质细胞支架的结构主要受到吻侧迁移流中胶质管内排列整齐的星形胶质细胞突起的启发。首先，在无菌烧杯中配制3%（重量/体积）的琼脂糖溶液和DPBS。持续加热并搅拌，以防止溶液过早凝固。将一根针灸针插入球形分配器底部的开口中。将毛细管套在暴露的针头上，并将部分毛细管插入球形分配器筒体的橡胶部分以固定两者。盖上筒体盖子，完成组装。将1毫升液态琼脂糖转移至空培养皿表面。捏住移液球的橡胶帽，将毛细管的一端插入琼脂糖中，松开橡胶帽上的压力，使琼脂糖吸入毛细管内。将移液球、毛细管和针头组件置于培养皿上，静置5分钟，使琼脂糖在毛细管内凝固。然后将针头从毛细管中抽出，使微柱仍套在针头上。用镊子尖端将微柱轻推至针头末端，随后将针头悬于盛有DPBS的开放培养皿上方，将微柱推入DPBS中。为制备便于后续操作这些结构的微柱载具，首先配制质量体积比为4%的琼脂糖溶液，并持续加热搅拌。使用镊子将微柱转移至一个空的培养皿中。然后在体视显微镜下，用微型手术刀将微柱修剪至所需长度，末端切成45度角。修剪完另外三根微柱后，将四根微柱平行排列。用移液器吸取50微升4%琼脂糖溶液，将液体沿微柱阵列上方排出，形成一条连接线，将微柱结构连接并捆集成“小船”状。静置冷却1至2分钟，使4%琼脂糖凝固。然后使用精细镊子夹住连接用的琼脂糖桥，提起微柱小船。将其转移至含有 DPBS 的培养皿中。将微型柱状载具转移至生物安全柜中，并用紫外光照射 30 分钟进行消毒。在生物安全柜内，用共培养基配制浓度为 1 毫克/毫升的大鼠尾部 I 型胶原溶液。然后将其置于冰上。根据需要使用酸或碱调节细胞外基质（ECM）溶液的pH值，直至pH稳定在7.2至7.4范围内。用镊子将微型柱船转移至35或60 mL的培养皿中。在体视显微镜引导下，将移液器的10 mL吸头置于每个微柱的一端，吸出腔内的DPBS溶液和气泡。用P10移液器吸取胶原溶液，将10 mL吸头紧贴每个微柱的一端，注入足够溶液以充满管腔。然后在微柱的两端分别用移液器加入基底膜基质（ECM）。所有微柱填充完毕后，用移液器将共培养基质以环形方式加入培养皿周围，以防止微柱干燥。将含有微柱的培养皿置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育至少1小时，以促进胶原蛋白聚合，然后再加入细胞。随后，将 P10 移液器的吸头置于微柱的一端，转移约 5 mL 细胞悬液至微柱腔内以充满其内部。将所有微柱安放至载具后，于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 1 小时，以促进星形胶质细胞与细胞外基质（ECM）的贴附。孵育结束后，小心地向含有已贴附微柱的培养皿中加入共培养培养基，35 mm 或 60 mm 培养皿分别加入 3 mL 或 6 mL。将接种的微柱结构置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养，以促进星形胶质细胞束的自组装，通常在接种后6至10小时内形成束状、电缆样结构。接种后1小时，星形胶质细胞呈球形，并分散于整个结构中。接种后5小时，星形胶质细胞开始伸出突起并发生收缩。铺板后 8 小时，星形胶质细胞已发生排列和收缩。铺板后 24 小时，在此示例中已形成致密的星形胶质细胞突起束。铺板后 24 小时完全形成的星形胶质细胞束显示出拉链效应，即束的末端连接到管腔壁的两个不同末端。本视频展示了铺板后 3 到 10 小时的束状结构形成过程。星形胶质细胞支架的免疫标记显示星形胶质细胞突起呈纵向排列。在此星形胶质细胞束的共聚焦图像中，检测到星形胶质细胞标记物 GFAP。细胞核呈蓝色。该束状结构的更高倍放大图像可清晰显示微柱内星形胶质细胞的细胞架构。观看本视频后，您应能够制备出由纵向排列的星形胶质细胞束构成的活体支架，其细胞架构仿生设计，并被包裹于生物材料外壳之中。通过该操作步骤，可设计一种移植策略，将星形胶质细胞束（无论是否包裹生物材料）递送至受损脑组织，以促进神经发生区域的定向细胞迁移，并引导细胞克服中枢神经系统微环境的限制作用。此外，该技术还可拓展为一种高保真胶质细胞介导的神经生物学现象研究平台，其优势在于能够模拟天然的三维环境，同时保留体外系统固有的实验可控性。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

三维组织工程化排列的星形胶质细胞网络, 以概括发展机制和促进神经系统再生

本视频演示了一种共培养星形胶质细胞与神经元以形成三维球体的方法。这些三维球体为研究突触形成和神经网络整合提供了独特的平台，因而可作为发育神经科学、神经退行性疾病以及神经药理学干预研究的潜在模型。...

生成星形胶质细胞与神经元的三维共培养球体以诱导突触形成

本视频展示了一种在水凝胶微柱内生成三维星形胶质细胞支架的方法。微柱内部涂有胶原蛋白，将星形胶质细胞引入后，细胞会黏附于胶原蛋白上，并在进一步培养过程中自组装形成三维支架。...

一种在水凝胶微柱内体外生成星形胶质细胞支架的方法

该视频展示了利用悬浮于生物墨水溶液中的星形胶质细胞构建三维生物打印结构的过程。生物打印结构在交联后可促进星形胶质细胞的黏附与铺展，形成类似神经组织的结构。...

一种用于3D生物打印小鼠皮层星形胶质细胞的方法

来源：Struzyna, L. A. et. al.，基于解剖学启发的三维微组织工程化神经网络用于神经系统重建、调控与建模。J. Vis. Exp.

利用基于水凝胶的微柱开发微组织工程化神经网络

深入了解大脑复杂的活动需要先进的研究工具。在此，我们展示了一种基于丝素-胶原蛋白的新型三维神经组织工程模型，其结构类似于大脑组织。该模型可用于研究神经元网络的组装、轴突导向、细胞间相互作用以及电活动。...

基于丝素蛋白-胶原的极化神经组织工程化三维模型

本研究介绍了一种新颖的实验模型，该模型将三维神经元培养物与平面微电极阵列（MEAs）相结合。三维神经网络通过在由玻璃微珠构成的支架上接种神经元而构建，神经元在支架上生长并形成相互连接的三维结构。...

将三维工程化神经元培养物与微电极阵列连接：一种创新方法 体外 实验模型

本文详细描述了微组织工程神经网络的构建方法：这是一种三维微米级结构，由长而有序的轴突束组成，连接被包裹在管状水凝胶内的聚集性神经元群体。这些活体支架可作为功能性中继装置，用于重建或调节神经回路，也可作为高度仿生的实验平台，模拟大脑灰质-白质的神经解剖结构。...

受解剖结构启发的三维微组织工程神经网络用于神经系统重建、调控与建模

本文介绍了一种大鼠脑源性胶质细胞（包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞）的三维培养方案。我们展示了原代细胞培养、甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）水凝胶的合成、HAMA光聚合与细胞包封，以及用于共聚焦显微镜和扫描电子显微镜成像的样品处理方法。...

改进的原代胶质细胞三维水凝胶培养方法 体外 神经炎症建模

在本实验方案中，我们旨在描述一种可重复的方法，用于将解离的人多能干细胞来源的神经元与星形胶质细胞共同组合形成三维球状共培养体系，在悬浮条件下维持这些细胞球的生长，并随后通过免疫分析和多电极阵列记录来检测细胞球中突触环路的活性。...

利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型

本文报道了一种3D生物打印小鼠皮层星形胶质细胞的方法，用于构建类神经组织，以研究星形胶质细胞在中枢神经系统中的功能，以及胶质细胞在神经系统疾病及其治疗机制中的作用。...

利用小鼠皮层星形胶质细胞进行类神经组织工程的3D生物打印

本文介绍了一种利用诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元和星形胶质细胞进行三维生物打印共培养的实验方案。该共培养模型在96孔或384孔板中的水凝胶支架内构建，打印后细胞存活率高，7天内可见明显的神经突生长，并表达两种细胞类型的成熟标志物。...

利用人iPSC来源的神经元-星形胶质细胞共培养体系进行三维生物打印以用于筛选应用

学习利用水凝胶微柱自组装三维星形胶质细胞束的方法，用于神经再生治疗。该技术通过模拟天然神经解剖结构，促进神经元迁移和轴突导向，为中枢神经系统损伤修复提供新型体外模型。

三维组织工程化定向星形胶质细胞网络以模拟发育机制并促进神经系统再生

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