三维组织工程化排列的星形胶质细胞网络, 以概括发展机制和促进神经系统再生

该协议旨在指导在微米级水凝胶微柱内制造纵向排列的星形胶质细胞胞体和过程的自组装三维束，用作体外神经生物学模型或神经再生疗法。创伤和神经退行性疾病对患者尤其有害，因为抑制环境中的神经源性能力受到限制，从而限制了中枢神经系统的再生。工程化星形胶质细胞束通过尝试复制关键神经解剖学特征和神经胶质细胞介导的发育机制来促进靶向细胞迁移和轴突寻路，从而解决了当前治疗策略的局限性。

这些星形胶质细胞支架的结构主要受到喙部迁移流神经胶质管中对齐的星形胶质细胞过程的启发。首先在无菌烧杯中制备每体积重量为 3% 的琼脂糖溶液和 DPBS。保持加热和搅拌，以防止溶液过早凝固。

将针灸针插入球形分配器的底部开口。将毛细管放在外露的针头上，并通过将其的一部分插入球形分配器圆筒的橡胶部分来固定两者。盖上圆柱体以完成组装。

将 1 毫升液体琼脂糖转移到空培养皿的表面。在捏住球形分配器的橡胶帽的同时，将毛细管的一端插入琼脂糖，释放盖子上的压力，将琼脂糖吸入管中。将球、管、针组件放在培养皿上，让琼脂糖在毛细管内凝固 5 分钟。

然后，将针头从毛细管中拉出，使微柱仍然围绕针头。使用前叶的尖端将微柱推到针头的末端，然后将针头放在打开的含有 DPBS 的培养皿上，并将微柱推入 DPBS。为了制造微柱舟，以便于以后处理这些构建体，首先制备每体积重量为 4% 的琼脂糖溶液，并保持溶液加热和搅拌。

使用镊子将微柱移动到空培养皿中。然后，在立体镜下工作时，使用微型手术刀将微柱修剪成所需的长度，并将末端切割成 45 度角。再修剪三根微柱后，将四根柱平行排列。

在移液管中加入 50 微升 4% 琼脂糖溶液，并在微柱阵列上分配一行液体，以连接并将构建体捆绑到一艘船中。冷却 1 至 2 分钟，使 4% 琼脂糖凝胶化。然后用细镊子通过连接的琼脂糖桥拾取微柱船。

并将其移至含有 DPBS 的培养皿中。将微柱舟转移到生物安全柜中，并在紫外线下消毒 30 分钟。在生物安全柜内，在共培养基中制备每毫升 1 毫克的大鼠尾 1 型胶原蛋白溶液。

然后将其放在冰上。根据需要用酸或碱调节 ECM 溶液的 pH 值，直到 pH 值稳定在 7.2 至 7.4 范围内。用镊子将微柱舟转移到 35 或 60 mL 培养皿中。

使用立体镜作为引导，将微量移液器的 10 mL 尖端放在每个微量柱的一端并抽吸以排空 DPBS 和气泡的腔。用胶原蛋白溶液填充 P10 微量移液器。将 10 mL 吸头靠在每个微柱的一端，并输送足够的溶液以填充管腔。

然后在微柱的两端移液 ECM 储液器。填充所有色谱柱后，将共培养培养基移液到培养皿周围的环中，以防止色谱柱变干。在添加细胞之前，将含有微柱的培养皿在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育至少 1 小时，以促进胶原蛋白的聚合。

然后，将 P10 微量移液器的尖端放在微量柱的一端，并将大约 5 mL 的细胞溶液转移到管腔中以填充它。将所有微柱放在船上后，将其在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 1 小时，以促进星形胶质细胞与 ECM 的结合。孵育期后，小心地用 3 或 6 mL 的共培养培养基填充包含静置微柱的培养皿，分别用于 35 或 60 mL 培养皿。

将铺板的微柱和培养物保持在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中，以促进星形胶质细胞束对齐的自组装，其应在 6 到 10 小时后形成成束的电缆状结构。铺板后 1 小时，星形胶质细胞呈球形并分散在整个构建体中。铺板后 5 小时，星形胶质细胞开始过程延长和收缩。

接种后 8 小时，星形胶质细胞对齐并收缩。到铺板后 24 小时，在这个例子中形成了一束致密的星形胶质细胞突。这个完全形成的星形胶质细胞束，在电镀后 24 小时，显示出拉链效应，其中电缆的末端连接到管腔壁的不同末端。

该视频展示了电镀后 3 到 10 小时的捆扎作。星形胶质细胞支架的免疫标记表明星形胶质细胞过程的纵向对齐。在这个星形胶质细胞束的共聚焦图像中，读取星形胶质细胞标志物 GFAP。

细胞核是蓝色的。束的这种较高放大倍数允许观察微柱内星形胶质细胞的细胞结构。观看此视频后，您应该能够在生物材料外壳内制造由纵向排列的星形胶质细胞束组成的活支架，这些支架具有生物启发的细胞结构。

在此程序之后，可以设计移植策略，将带或不带生物材料包裹的星形胶质细胞束递送到受伤的脑组织，以促进细胞从神经源性区域的定向迁移，并引导至限制性的 CNS 微环境。此外，该技术可以扩展为生物友好建模平台神经胶质细胞介导的神经生物学现象，受益于天然三维环境的模拟和体外系统的固有实验控制。