研究清除大脑中星形胶质细胞和神经元之间的空间相互作用

2013年首次描述的清晰度技术是一种组织清除技术，可以对大量细胞，血管进行采样，因此即使是蛋白质，在厚厚的脑切片中也能以单细胞分辨率。该技术通过使整个大脑透明来研究完整的微观结构。该协议是用于组织清除的简单芯片和直接管道。

该技术可用于清除除脑组织外的其他系统中的组织。首先，使用石蜡膜密封管子和盖子，并在盖子上刺穿两个孔。然后使用内径为5毫米的柔性管和末端连接的19号针从罐中输送氮气。

通过将管道连接到管上并允许在室温下进行气体交换30分钟来开始脱气。拆下管道，立即用造型粘土密封孔。然后将脱气密封管转移到37摄氏度的浴中3 1/2小时以聚合水凝胶溶液。

将大脑从管中取出。使用实验室湿巾，去除大脑周围的聚合水凝胶，确保没有残留的凝胶附着在大脑表面。将大脑分成厚片，其中包含所有感兴趣的区域。

将切片放入第一个透明溶液中，并在37摄氏度下孵育，以70 RPM旋转24小时。同时，准备一个穿孔管来放置大脑。将穿孔管放入装有第二个清除溶液的烧杯中搅拌装置上。

然后将大脑放入烧杯中，并用铝箔密封以防止漂白。组织变得透明后，将大脑转移到PBST中，在37摄氏度下孵育，以70 RPM旋转24小时。用新鲜的PBST替换溶液，并继续孵育24小时。

然后将大脑在室温下转移到PBS中24小时。24小时后，从PBS中取出大脑并将其转移到屈光率匹配溶液中。将大脑在37摄氏度下孵育过夜。

首先，将样品放在载玻片的中间。使用热胶，在载玻片的边缘形成壁，几乎与组织一样高。确保在其中一个角落留出一个小间隙。

当热胶层接近脑切片的高度时，在样品上滴一到两滴折射率匹配溶液以润湿上表面并防止气泡形成。当热胶仍然是液体时，用盖玻片密封顶部，尽可能均匀地放置，然后用折射率匹配溶液填充腔室。用热胶合上缝合缝隙。

如果热胶壁延伸到幻灯片的边界之外，请切割延伸边缘。如果使用油浸物镜进行成像，则在盖玻片上方的壁上再添加两到三毫米的胶水，以保留浸没液。在此方案之后，脑组织将被清除。

使用该协议制备了清晰的脑切片，以可视化小鼠海马体CA1区域的星形胶质细胞和神经元群体。所有星形胶质细胞表达tdTomato和兴奋性神经元在其细胞核中表达H2B-GFP。为澄清组织准备的腔室最适合在双光子或共聚焦显微镜下成像。

使用双光子显微镜，在小鼠海马体CA1区域的清除部分观察到超过300个星形胶质细胞。红色和锥体细胞中的海马星形胶质细胞，绿色的体细胞是可见的，厚厚的透明组织代表了这两种细胞类型之间的空间接近。使用扫描激光共聚焦显微镜，在整个半球上追踪来自兴奋性神经元的轴突束。

绿色的束状物从背侧海马体向超级乳腺体延伸。红色束从乳腺体到它们在发泄海马体的起源。温度、浓度和孵育时间等因素影响了澄清度程序的结果。

因此，方案每一步的精确性对于成功实现透明组织至关重要。使用这种技术，我们测量几种大脑结构中神经元和星形胶质细胞之间的距离。该协议允许分析比以前的研究多两到三个数量级的细胞。