Name: 研究清除大脑中星形胶质细胞和神经元之间的空间相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: 了解CLARITY组织透明化技术在小鼠海马体中的应用，通过病毒载体转导揭示星形胶质细胞与神经元之间的空间关系。该方法使厚脑切片实现单细胞分辨率成像，有助于深入理解神经组织结构与细胞相互作用机制。

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该项目获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助协议号803589）、以色列科学基金会（ISF，资助号1815/18）以及加拿大-以色列联合资助项目（CIHR-ISF，资助号2591/18）的资助。我们感谢Nechama Novick对全文稿件提出的修改意见。

实验方案已获希伯来大学动物护理与使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》的规定。
1. 病毒载体转导
注意：病毒载体转导用于在脑内表达荧光蛋白。
<ol>
	<li>使用图谱（例如 Allen 脑图谱）定位目标区域的相关坐标。 
	注意：可在网络上找到三维图谱（例如，&#160;http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer）。</li>
	<li>通过立体定位手术，将病毒载体注射至相应的脑结构中。详细方案参见9。</li>
	<li>等待 3–6 周以实现荧光蛋白表达。 
	注意：如果仅需标记细胞体，则较短时间即可；但如果研究问题涉及轴突投射，则需要更长时间，因为荧光蛋白在轴突中的表达所需时间更长，而轴突可长达数毫米。</li>
	<li>预先验证荧光蛋白表达的特异性和穿透性（包括病毒表达和转基因动物）（图 1A）。在进行 CLARITY 操作前，至少预留一个脑组织用于制备薄切片，并确保荧光蛋白表达在目标细胞特征上既强且特异。</li>
</ol>
2. CLARITY
注意：该方法可在 2 至 6 周内使脑组织透明化。
<ol>
	<li>使用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）经颅灌注动物，随后用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS灌注。取出脑组织，置于50 mL离心管或其他类似容器中，加入PFA溶液，4 °C条件下固定过夜。 
	注意：在进行经颅灌注之前，必须使动物处于深度麻醉状态。在本方案所展示的示例中，所有动物均使用氯胺酮和赛拉嗪（分别为90%和10%）进行麻醉。</li>
	<li>用水凝胶溶液（HS；参见 表14 °C 下孵育 48 小时。 
	注意：在此阶段，切勿使材料温度超过冷藏温度（4–8 °C），否则水凝胶将发生聚合。本方案所用的 HS 含有 2% 丙烯酰胺，与先前建议使用 4% 的方案不同22 或 1%172% 的优势详见讨论部分。制备 HS 时，需在冰冻的表面上操作。储存于 -20 °C。</li>
	<li>脱气 
	注意：此步骤的目的是去除组织中所有游离的氧气，因为氧气2 干扰聚合过程。任何非O2 气体可被使用（例如，N2，CO2)；N2 建议。
	<ol>
		<li>转移 N2 从水箱中 通过 一根内径为5 mm的软管，末端连接19 G针头（图1B).</li>
		<li>在管盖上制作两个小孔（针尖粗细）：一个用于通入气体，另一个用于排出管内空气图1C).</li>
		<li>将氮气管连接到 N2 向试管中通入气体，并在室温（RT）下置换气体约30分钟。</li>
		<li>移除管道，并立即用油泥将每根管子上的孔洞密封图1D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将脱气后的密封管转移至37 °C水浴中，反应3.5 h以使HS聚合形成凝胶。注意勿摇动试管。图1E).</li>
	<li>从管中取出脑组织，用实验室擦拭纸轻轻去除周围聚合的凝胶。确保组织表面无残留凝胶，否则其可能与后续步骤中的溶液发生反应，从而抑制组织透明化过程图1F). 
	注意：由于凝胶中含有PFA，提取操作应在通风橱中进行。</li>
	<li>如果研究问题仅涉及脑部的特定区域，则可将脑切开。将其切成两半或切成包含所有目标区域的较厚脑片（图1G).</li>
	<li>将切片置于第一透明溶液（CS1，参见 表2在新容器中以37 °C、70 rpm的转速振荡24小时。</li>
	<li>按照以下步骤将大脑从CS1转移至第二清除溶液（CS2，参见 表2).
	<ol>
		<li>提前准备好用于脑组织的带孔试管（图1H).</li>
		<li>将二硫化碳（CS2）在足够容纳试管的烧杯中预热至40–45 °C，使用带搅拌器的加热板进行加热。确保温度不超过55 °C，以防止表达蛋白发生漂白。</li>
		<li>将装有 CS2 的烧杯和带孔试管放置在搅拌装置上（使用 2 L 烧杯） 图1I设定适度的搅拌速度，使液体流动但不损伤组织。 
		注意：2至6周内，组织将逐渐变得透明（该过程从周边开始，向中枢脑结构内部推进）。组织何时达到透明状态的判断依据为 &#34;足够清晰&#34; 取决于个人判断。脑组织应足够透明，以便在显微镜下成像时无干扰。图1J 不够清晰； 图1K 足够透明即可。超过组织足够透明的点可能导致组织刚性丧失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从CS2转移至PBST（含0.5% Triton X-100的PBS，参见 表2在37 °C、轻柔振荡（70 rpm）条件下，在新容器中孵育24小时。 
	注意：在 PBST 中，组织会变为白色图1L）。当浸入折射率匹配液（RIMS，见步骤2.14）时，透明度将恢复（并提高）。</li>
	<li>用新的 PBST 替换原有的 PBST，在相同条件下（37 °C，轻微振荡）继续孵育 24 小时。</li>
	<li>再次用新的PBST替换，室温下放置24小时。</li>
	<li>室温下转移至PBS中孵育24小时。</li>
	<li>更换 PBS，室温继续孵育 24 小时。</li>
	<li>将脑组织从PBS中取出，转移至37 °C的RIMS中过夜。 
	注意：最初，RIMS 中的涟漪可能环绕大脑。本方案使用两种特定的商用 RIMS 设计并验证（参见 表3）。然而，使用其他RIMS（商业或自制）时，该方案不应有所不同。</li>
	<li>将组织在室温下继续放置 24 小时，或直至溶液达到完全平衡状态，即组织变得透明，且溶液中不再有可见的波纹现象（图1M).</li>
	<li>如果组织呈透明状态，则继续进行腔室制备。如果此时组织变为白色而非透明（由于残留的SDS分子聚集所致），则需重复步骤2.9和2.10再次清洗样本，并将组织转移至CS2（步骤2.8）中数天，随后重复执行所有步骤直至步骤2.15。</li>
</ol>
3. 小室的制备
注意：每个样本都需要一个带有成像腔室的载玻片，样本将被放置在该腔室内。
<ol>
	<li>将样品置于载玻片中央。</li>
	<li>使用热熔胶枪在载玻片边缘构建围壁，高度接近组织厚度。确保在其中一个角落留出一个小缝隙（约 5 mm）（图 2A、B）。</li>
	<li>在样品上滴加 1–2 滴 RIMS，以保持组织上表面湿润，并防止盖玻片与组织之间产生气泡。</li>
	<li>滴加 RIMS 后立即在围壁上再添加一层热熔胶，使其达到脑组织/切片的高度，并紧接着（趁热熔胶仍处于液态时）进行步骤 3.5。</li>
	<li>用盖玻片封顶，尽可能平整地将其放置在仍温热的热熔胶层上方（图 2C）。</li>
	<li>通过热熔胶围壁预留的缝隙向腔室内注入 RIMS（图 2D、E）。</li>
	<li>用热熔胶封闭缝隙，确保内部无残留空气（图 2F）。</li>
	<li>若热熔胶围壁超出载玻片边缘，需剪除多余部分（图 2G）。</li>
	<li>若成像所用物镜为浸液物镜，则在盖玻片上方的围壁再增加 2–3 mm 高的胶层，以延长浸液的持续时间（图 2H）。</li>
</ol>
4. 成像（共聚焦或双光子）
<ol>
	<li>检查载物台是否能够承载成像室，因为成像室的厚度可能达到数毫米。 
	注意：例如，本方案中使用的共聚焦显微镜（参见材料表）配备有多种载物台（如圆形、矩形）。只要载物台参数与成像室尺寸匹配，选择何种载物台均可。</li>
	<li>使用具有足够工作距离的物镜进行操作，即最小工作距离应≥3 mm，因为感兴趣脑区的深度可能达数毫米，且盖玻片因手动放置可能并非完全平整。 
	注意：作为示例，图1、视频1和视频2中展示的结果是在双光子显微镜下获得的，使用的是16倍水浸物镜，工作距离为3 mm，放大倍数为2.4，从而获得652 × 483 µm的视野范围，以及层间间距为0.937 µm的z轴堆栈图像。</li>
	<li>进行多区域成像，该过程可能持续数小时甚至数天。确保计算机具有充足的可用存储空间，因为每幅图像的大小可能高达数十吉比特。 
	注意：CLARITY成像可能在深度方向产生显著更多的图像切片。因此，用于捕捉表达信号的成像强度应相对较低，以避免在图像叠加过程中出现信号过饱和。</li>
	<li>对于浸液物镜，在成像过程中应定期检查液体情况，并根据需要补充液体。 
	注意：在获取视频3所示数据的成像过程中，每6–8小时向成像室表面添加一次水，以补偿蒸发损失。</li>
	<li>图像采集完成后，使用多种不同的软件包进行查看和分析。 
	注意：推荐使用的软件包括Imaris和SyGlass，二者均适用于可视化与分析。此前已有文献详细描述了使用Imaris软件优化星形胶质细胞重建的具体流程9。简而言之，本研究中使用的Imaris功能包括“Filaments”模块用于完整重建细胞结构，以及“Spots”模块用于提取所有胞体在空间中的位置信息。</li>
</ol>

<ol><li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+astrocytes+process+and+control+synaptic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li>
<li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li>
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<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

组织透明化技术为脑科学研究提供了一种革命性工具，使得人们能够提出以往无法探究的问题。CLARITY技术如今能够利用特异性的荧光染料，对全细胞群体或长距离连接特征进行靶向研究，而不再局限于少数细胞、单个细胞甚至单个突触的特性分析。
荧光蛋白表达与CLARITY技术联用的结果并非非此即彼；多种因素可能干扰该过程，导致结果不理想。首先，必须预先验证荧光蛋白的表达情况。由于CLARITY过程会造成部分信息丢失，因此足够的荧光蛋白表达量对于CLARITY流程结束时图像的有效性至关重要。其次，经颅灌注操作必须谨慎进行，确保血液完全从脑组织中清除，因为血液的自发荧光会在厚切片中产生不可靠的数据。第三，方案中讨论的所有参数必须在透明化过程的每一步中精确控制，例如聚合前水凝胶溶液中的残余O2或各阶段温度控制不准确，均会阻碍活性物质之间的化学反应发生。
既往方案17,22建议在HS中使用不同浓度的丙烯酰胺。丙...

近年来，关于星形胶质细胞功能及其与神经元回路相互作用的认识显著增加。星形胶质细胞能够影响可塑性1,2，协助神经元损伤后的恢复3,4，甚至诱导 从头合成 神经元的长时程增强，近期研究揭示了星形胶质细胞在记忆获取和奖赏行为中的重要作用，这些功能此前被认为仅由神经元介导5,6,7星形胶质细胞研究中一个特别值得关注的特征是细胞的空间排布，这些细胞在海马体及其他脑结构中维持着独特的空间组织形式8,9,10与在细胞胞体之间相互交织的神经元树突不同，海马星形胶质细胞占据视觉上可区分的区域，其突起之间仅有轻微重叠，形成明确的结构域8,11,12,13支持星形胶质细胞参与神经环路的证据，并不能弥补对这些细胞群体及其所在区域神经元缺乏详细解剖学描述的不足14.
病毒载体转导技术以及转基因动物（TG）已被广泛用作研究脑结构、功能及细胞间相互作用的工具集15,16。利用不同的启动子可根据细胞的遗传特性、激活水平17,18或投射靶区实现对特定细胞的靶向标记。不同病毒可在不同细胞群体中表达不同颜色的荧光蛋白。病毒可与转基因动物内源性表达的荧光蛋白联合使用，也可单独使用转基因动物而无需病毒。这些技术被广泛应用于神经元标记，一些实验室已开始对其进行改良，以特异性靶向其他细胞类型，例如星形胶质细胞5,9,19。
CLARITY 技术于 2013 年首次被描述20,21，该技术通过使整个大脑组织透明化，同时保持其微观结构的完整性，从而实现对厚脑切片的研究。通过结合病毒载体转导和组织透明化这两种方法，现在可以研究不同细胞群体之间的空间相互作用。大多数星形胶质细胞-神经元相互作用的研究是在薄脑切片上进行的，由于星形胶质细胞具有较大的结构域，所获得的图像往往不完整，从而极大地限制了可分析细胞的数量。应用 CLARITY 技术可在大尺度体积内同时实现对细胞群体的单细胞分辨率表征。在透明化大脑中对荧光标记的细胞群体进行成像虽无法达到突触分辨率，但能够全面表征星形胶质细胞与多种神经元细胞类型之间的空间相互作用。
基于这一原因，我们利用这些先进的技术研究了背侧CA1区星形胶质细胞的特性，对所有细胞层（辐射层、锥体细胞层和深丛层）进行了成像。我们测量了数以万计的星形胶质细胞（病毒转导效率&#62;96%5），从而分析了CA1区整个星形胶质细胞群体的信息。由于神经元标记物具有高效的标记效率，我们能够记录CA1区全部星形胶质细胞群体与四类神经元细胞之间的相互作用——即小清蛋白（PV）阳性神经元、生长抑素（SST）阳性神经元、VIP抑制性神经元以及兴奋性锥体细胞9。
使用TG动物的荧光与不同颜色的病毒载体（均为抑制性细胞）组合进行了多项实验，而其他实验（兴奋性细胞）则利用了两种在不同启动子下表达不同荧光蛋白的病毒载体9。本文提供了一项详细的操作方案，包括在脑内标记目标细胞、采用改良的CLARITY方法使脑组织透明化，以及利用多种方法和软件对完整脑结构进行成像与分析。

<table><tbody><tr><td>AAV1-GFAP::TdTomato</td><td>ELSC 载体核心设施 (EVCF)</td><td></td><td>用于检测星形胶质细胞的病毒载体</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::eGFP</td><td>ELSC 载体核心设施 (EVCF)</td><td></td><td>用于检测神经元的病毒载体</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td><td>ELSC 载体核心设施 (EVCF)</td><td></td><td>用于检测神经元细胞核的病毒载体</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td><td>ELSC 载体核心设施 (EVCF)</td><td></td><td>用于检测神经元的病毒载体</td></tr><tr><td>丙烯酰胺 (40%)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0140</td><td></td></tr><tr><td>双丙烯酰胺 (2%)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0142</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma</td><td>#B7901</td><td>分子量 - 61.83 g/mol</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜，扫描型，FV1000</td><td>Olympus</td><td></td><td>4x 物镜 (UPlanSApo, 0.16 NA)</td></tr><tr><td>Imaris 软件</td><td>Bitplane, 英国</td><td></td><td>一种可用于图像三维分析的软件</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>#S5881</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>EMS</td><td>#15710</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear</td><td>SunJin 实验室</td><td>#RC147002</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear CS</td><td>SunJin 实验室</td><td>#RCCS002</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>#L3771</td><td></td></tr><tr><td>SyGlass 软件</td><td></td><td></td><td>一种可通过虚拟现实技术进行图像三维分析的软件</td></tr><tr><td>Tris 碱 1 M</td><td>Bio-rad</td><td>#002009239100</td><td>分子量 - 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>ChemCruz</td><td>#sc-29112A</td><td></td></tr><tr><td>双光子显微镜</td><td>Neurolabware</td><td></td><td>钛宝石激光器 (Chameleon Discovery TPC, Coherent)，GaAsP 光电倍增管 (Hamamatsu, H10770-40)，带通滤光片 (Semrock)，水浸 16x 物镜 (Nikon, 0.8 NA)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VA-044 引发剂</td><td>Wako</td><td>#011-19365</td><td></td></tr></tbody></table>

透明化大脑中星形胶质细胞与神经元空间相互作用的研究

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

将病毒载体转导与基于CLARITY方法的组织透明化技术相结合，可实现对多种脑细胞类型及其相互作用的同步研究。病毒载体转导能够在同一组织内以不同的荧光颜色标记多种细胞类型，从而根据基因表达、细胞活动或投射特征对细胞进行鉴定。通过改进的CLARITY实验方案，星形胶质细胞和神经元的潜在样本量已扩大了2至3个数量级。应用CLARITY技术可实现对完整星形胶质细胞的成像，这类细胞体积过大，无法在组织切片中完整呈现，而该技术使得细胞体及其全部突起均可被观察。此外，该方法还提供了研究星形胶质细胞与不同神经元细胞类型之间空间相互作用的机会，例如每个星形胶质细胞功能域内的锥体神经元数量，或星形胶质细胞与特定抑制性神经元群体之间的空间邻近关系。本文详细描述了这些方法的具体应用步骤。

成功透明化较厚的脑组织切片后，可提出一系列新问题，这些问题涉及大群细胞的特性，而非单个细胞或邻近小群细胞的特性。为获得理想结果，应严格遵循CLARITY实验方案，因为需要考虑多种参数以减少样本间的差异（例如透明度百分比、荧光信号信息、组织膨胀程度参数）。
图1 描述了从荧光蛋白表达验证到透明化方法各个阶段的完整透明化流程。图2 描述了如何为透明化组织准备成像腔室，适用于双光子或共聚焦显微镜成像。本方案所需的材料与其他腔室制备方案相比极为廉价。
图3展示了视频1中描述的立方体区域，其中显示了小鼠海马CA1区透明化脑组织切片中超过300个星形胶质细胞。图4展示了视频2中描述的立方体区域，其中在较厚的透明化组织中同时显示了星形胶质...

结合病毒载体转导与基于CLARITY方法的脑组织透明化技术，可实现对大量神经元和星形胶质细胞的同时观察与研究。

结合病毒载体转导与CLARITY方法的组织透明化技术，可实现对多种类型的脑组织进行同时研究……

2013年首次描述的透明化技术是一种组织透明化技术，可实现对厚脑切片中大量细胞、血管乃至蛋白质进行单细胞分辨率的取样。该技术通过使整个脑组织透明，从而实现对完整微观结构的研究。本方案提供了一种简单芯片和直接的组织透明化操作流程。该技术除可用于脑组织透明化外，还可用于其他系统的组织透明化。首先，用封口膜密封管子和管盖，并在管盖上打两个孔。然后，使用一端连接有内径为5毫米、19号针头的软管，将氮气从气罐中导入。开始脱气：将管道连接到试管上，在室温下进行气体交换30分钟。断开管道连接，并立即用橡皮泥密封孔洞。然后将已密封的脱气试管转移至37°C水浴中，孵育3.5小时，使水凝胶溶液聚合。将脑组织从管中取出。使用实验室擦拭纸，清除脑组织周围的聚合水凝胶，确保脑表面无残留凝胶。将脑组织切成较厚的切片，确保包含所有感兴趣的区域。将切片放入第一种透明化溶液中，在37摄氏度、70转/分钟旋转条件下孵育24小时。在此期间，准备一个带孔的离心管用于放置脑组织，将该离心管放入盛有第二种透明化溶液的烧杯中，并置于搅拌装置上。然后将脑组织放入烧杯中，并用铝箔密封，以防止褪色。待组织变为透明后，将脑组织转移至PBST中，在37°C下以70转/分钟的速度旋转孵育24小时。更换新鲜的PBST溶液，继续孵育24小时。然后将脑组织转移至室温的磷酸盐缓冲液（PBS）中，孵育24小时。24小时后，将脑组织从PBS中取出，并转移至折射率匹配溶液中。在37摄氏度下避光孵育过夜。首先，将样本放置在载玻片中央。使用热熔胶在载玻片边缘构建围壁，高度接近组织样本，但需确保其中一个角落留有小缝隙。当热熔胶层接近脑切片高度时，在样品上滴加一至两滴折射率匹配溶液，以润湿上表面并防止气泡产生。在热熔胶仍处于液态时，用盖玻片密封顶部，尽可能均匀地放置盖玻片，然后用折射率匹配溶液充满腔室。最后用热熔胶封闭缝隙。如果热熔胶壁超出载玻片的边界，则剪去延伸的部分。如果使用油浸物镜进行成像，需在盖玻片上方的胶壁再添加两到三毫米的胶，以保留浸油溶液。完成本方案后，脑组织将被透明化。采用本方案制备透明化脑切片，以观察小鼠海马CA1区的星形胶质细胞和神经元群体。所有星形胶质细胞均表达tdTomato，兴奋性神经元则在其细胞核中表达H2B-GFP。为透明化组织制备的成像腔室适用于双光子或共聚焦显微镜下的成像。利用双光子显微镜，观察了小鼠海马体CA1区透明组织切片中超过300个星形胶质细胞。红色显示海马体星形胶质细胞，绿色显示锥体细胞胞体，组织厚实且透明，呈现出这两类细胞之间的空间邻近关系。利用扫描激光共聚焦显微镜，追踪了兴奋性神经元的轴突束穿过整个半脑的过程。绿色束状结构从背侧海马体向丘脑上体延伸。红色束状结构从乳头体向其起始处的腹侧海马体延伸。温度、浓度和孵育时间等因素影响了透明化处理的结果。因此，该方案每一步操作的精确性对于获得清晰组织至关重要。利用此技术，我们测量了多种脑结构中神经元与星形胶质细胞之间的距离。该方案使得可分析的细胞数量比以往研究多出两个到三个数量级。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

研究清除大脑中星形胶质细胞和神经元之间的空间相互作用

本研究描述了一种新型神经元轴突与（星形）胶质细胞共培养平台的建立步骤。在此共培养系统中，可实现对单个轴突（及单个胶质细胞）之间直接相互作用的操控，从而能够对神经元与胶质细胞之间的相互信号传导机制进行分析。...

基于微流控培养平台（MCP）的神经元轴突与胶质细胞共培养系统中神经元-胶质细胞相互作用的成像分析

本视频展示了一种采用区室化方法建立间接神经元-星形胶质细胞共培养的技术。在此体系中，神经元与星形胶质细胞在空间上相互分离，但共享一种条件培养基。星形胶质细胞释放的神经营养因子可促进神经元分化及突触连接的形成，提示存在神经元-胶质细胞间的相互作用。...

一种用于研究神经元-胶质细胞相互作用的间接神经元-星形胶质细胞共培养技术

来源： Refaeli, R., 等，星形胶质细胞与神经元在透明化脑组织中空间相互作用的研究。 J. Vis. Exp. (2022)...

透明化小鼠海马组织中星形胶质细胞与兴奋性神经元的双光子显微成像

中枢神经系统中的星形胶质细胞在受到有害刺激时会改变其功能和结构特性。本报告介绍了一种在疾病状态或治疗干预后评估星形胶质细胞三维形态的实验方案。...

星形胶质细胞三维共聚焦形态计量分析方案

本方案描述了用于区室化分析神经元-胶质细胞相互作用的间接神经元-星形胶质细胞共培养方法。...

间接神经元-星形胶质细胞共培养实验：一种 体外 神经元-胶质细胞相互作用精细研究的实验装置

我们展示了在一种新型生物材料包被中，自组装形成的三维结构，其中星形胶质细胞的胞体及其突起沿纵向整齐排列成束。这些工程化的"活体支架"具有微米级直径，却可延伸至厘米级长度，可作为研究神经发育机制的实验平台，或通过引导神经元迁移和/或轴突导向来促进神经再生。...

三维组织工程化定向星形胶质细胞网络以模拟发育机制并促进神经系统再生

本文介绍了一种评估星形胶质细胞网络结构的实验方案。该方法可最大限度地减少偏差，提供对这些网络的描述性测量指标，如细胞数量、大小、面积以及在核团内的位置。各向异性通过矢量分析进行评估。...

分析耦合星形胶质细胞网络的大小、形状和方向性

所述流程旨在对大于千兆字节的电子显微镜数据集进行分割，以提取完整细胞的形态。一旦细胞在三维空间中完成重建，即可使用根据特定需求定制的软件直接在三维空间中进行定性和定量分析，也可借助虚拟现实技术克服视野遮挡问题。...

一种用于胶质细胞与神经元细胞三维重建及虚拟现实分析的方法

本文介绍了一种体外活体成像方法，用于可视化小鼠星形胶质细胞中细胞器的细胞内运输以及质膜蛋白的转运过程。该方案还提供了一种图像分析方法，用于确定货物运输的路径和动力学特征。...

可视化与分析星形胶质细胞内细胞器及其他货物的胞内运输

本方案描述了对小鼠脑组织游离切片进行切片、染色和成像的方法，随后详细介绍了星形胶质细胞区域体积以及星形胶质细胞区域重叠或拼接的分析方法。...

星形胶质细胞区域体积与拼接在厚切游离组织切片中的分析

了解CLARITY组织透明化技术在小鼠海马体中的应用，通过病毒载体转导揭示星形胶质细胞与神经元之间的空间关系。该方法使厚脑切片实现单细胞分辨率成像，有助于深入理解神经组织结构与细胞相互作用机制。

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