发育中的神经上皮内细胞行为的高分辨率活体成像

本实验的总体目标是对胚胎神经管内的细胞行为进行长时间、高分辨率的成像。首先通过表达某种荧光蛋白的构建体对早期神经管进行横切，以标记单个细胞；随后制备早期胚胎的切片，并将其置于玻璃底培养皿中进行观察。

在培养箱中恢复后，胚胎切片需在宽场显微镜下定期成像。最终，该技术可用于长时间、高空间和时间分辨率地研究发育中神经上皮内的细胞行为。与现有的活体组织成像方法相比，该技术的主要优势在于能够以高空间和时间分辨率长时间观察单个细胞的行为。

该方法可帮助您解决发育神经生物学领域中的关键问题，例如有丝分裂纺锤体方向在硫酸盐选择中的作用，或信号动态如何调控细胞行为，这些研究均在将质粒电转染入神经管之前进行。在解剖显微镜下使用微量毛细管拉制仪制备玻璃针。用精细镊子将针尖折断。

针头末端应足够锋利，能够刺入神经管，但又不能过于细窄以免阻碍DNA溶液的注射。本实验的X已在37摄氏度下孵育约36小时，达到汉堡-汉密尔顿第10期。

开始此操作时，打开卵窗并将电极放置在胚胎两侧，电极间距为五毫米，在神经管内注射含有少量快绿染料以供观察的DNA。施加12至17伏电压，脉冲时长50毫秒，共施加三次，每次间隔950毫秒。

使用低浓度的 DNA 和低电穿孔电压以实现嵌合表达，从而能够追踪单个细胞。最后，用封口膜封住蛋壳上的窗口，确保密封。将胚胎在 37 摄氏度下恢复培养三至四小时，或过夜培养。

应在切片胚胎前约一小时准备好胶原混合液和脑片培养基。制备胶原混合液时，将100 µL 0.1%乙酸溶液加入300 µL I型胶原中，充分涡旋混匀；然后加入100 µL 5倍浓度的L-15培养基，再次充分涡旋混匀。此时溶液应变为黄色。

接着加入 15 至 20 微升 7.5% 碳酸氢钠溶液，充分涡旋混匀。溶液应略呈粉红色。置于冰上保存。

该胶原混合液应每次新鲜配制。将以下成分加入10毫升神经基础培养基中以配制切片培养基：B27添加剂、GlutaMAX和庆大霉素溶液，然后将培养基置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中。容器盖子应留松，使其与二氧化碳充分平衡，至少一小时。

开始此操作时，使用一把小剪刀将胚胎剪出。用镊子将胚胎从卵中取出，并用 L-15 培养基清洗。将胚胎放入底部铺有一层 Sylgard 的组织培养皿中。

通过周围的胚外膜将胚胎固定，使膜被拉紧。使用显微刀尽可能笔直地在目标区域切开胚胎。对于脊髓切片，应切取一到两个体节厚度的切片，并保留与胚胎侧部组织相连，以防止在处理其他胚胎时丢失切片。

需要使用定制的微型移液吸头将脊髓切片转移至玻璃底培养皿中。制备方法如下：将一个200微升的吸头连接到P2或P10移液器上，并从吸头末端切掉约一毫米。用之前配制的胶原混合液取一微升，对吸头内部进行胶原包被。

静置一到两分钟，然后用 L-15 培养基冲洗。这将防止组织粘附在枪头内部。现在使用显微刀从胚胎上分离一片组织，并用装有 200 微升枪头的 P2 或 P10 移液器将组织片从培养皿中移出。

尽量吸取少量培养基。将胶原混合液涡旋混匀，然后用移液器吸取5到8微升，滴加到以多聚赖氨酸包被的玻璃底培养皿中（盖玻片作为基底），立即将胚胎切片放入胶原中，并用精细镊子调整其位置。活体成像细胞（LICs）应放置成待成像的一侧与盖玻片表面齐平。

组织应黏附在盖玻片的聚赖氨酸涂层上。重复此步骤，直至盖玻片上贴有多个切片。通常一个培养皿上放置六至九个切片。

当所有切片就位后，向最早放置的胶原中加入两到三微升 L-15 培养基，并覆盖培养皿。让胶原凝固 20 分钟。待胶原凝固后，小心加入两毫升已置于 5% 二氧化碳、37 摄氏度环境中至少平衡一小时的切片培养基。

操作时需注意避免将胶原从盖玻片上移位，将样本置于37°C、5% CO₂的培养箱中，使组织切片恢复至少三小时后再进行成像。在长时间内以高时间和空间分辨率观察组织内细胞行为具有挑战性。获得良好结果的关键在于优化培养条件，并结合使用明场显微镜技术。

使用配备气象站环境培养箱的Delta Vision Core宽场显微镜对切片进行成像。培养箱内温度持续维持在37摄氏度，并通过二氧化碳灌注装置保持显微镜载物台环境为5%二氧化碳和95%空气。通常使用40倍、1.30数值孔径的油浸物镜进行成像，图像由Core Snap HQ2型CCD相机采集。在45微米厚的组织层面上，每隔1.5微米采集一个Z轴层面。曝光时间应尽可能缩短，例如5至50毫秒。

对于每个所述区域，每隔七分钟采集一次图像。使用Delta Vision系统最多可访问九个切片。此处展示的精确定点访问功能是一个延时成像序列示例，其中脊髓前体细胞转染了表达GFP标记α-微管蛋白的质粒，成像始于一个两天龄HH 12期胚胎的脊髓切片。

在此早期阶段，神经前体细胞主要进行前体-前体模式分裂，即细胞分裂产生两个继续增殖的前体细胞。该图展示了刚刚显示的延时序列中的部分帧。在2小时20分钟时，细胞以垂直于顶面的分裂面进行分裂，产生两个子细胞。

这两个细胞分别在24小时23分钟和25小时54分钟时再次分裂。下一个延时成像序列显示的是转染了标记细胞膜的G-F-P-G-P-I的细胞。该细胞经历了一次分裂，期间基底突起在白色箭头所示位置一分为二，并被子细胞均等继承。

该延时序列中选取的帧显示，细胞分裂发生在零小时 49 分钟。观看本视频后，您应已了解如何制备和成像脊髓切片。请记住，如果您是初次接触该技术，起初可能会遇到困难，因为该技术包含多个具有挑战性的操作步骤，所有步骤均需准确配合才能成功。