可视化的神经细胞胞质分裂过程中 C。线虫胚胎

本协议描述了如何在图像秀丽隐杆线虫的胚胎组织中分裂的细胞。虽然一些协议描述了如何像细胞分裂在胚胎早期，这个协议描述了如何在图像中胚胎发育晚期一个发展中的组织内的细胞分裂。

以下实验的总体目标是观察 C 优雅胚胎发生过程中发育组织中的分裂细胞。为了研究控制细胞分裂的基因，这是通过创建或获得稳定表达标记目标细胞的转基因标记物的 C elgan 菌株来实现的。作为第二步，通过将 D-S-R-N-A 喂给 L 四只幼虫 24 至 48 小时，选择性地敲低目标基因。

图形雌雄同体中收集 RNAI 胚胎并转移到 aros 垫上进行实时成像。接下来，使用宽视野或共聚焦显微镜对胚胎进行成像以可视化细胞分裂表型。结果将揭示神经母细胞在海埃尔金胚胎发生过程中如何分裂，以及其分裂所需的基因的作用。

这种方法可以帮助揭示发育和细胞生物学领域的关键问题。例如，这种方法可以揭示在组织发育、细胞通讯、细胞迁移或细胞极性过程中参与调节有丝分裂的基因和机制。使用表达适当标记物的转基因蠕虫，在对照板或 RNAI 板上保留 24 至 48 小时。

挑选 4 到 6 个坟墓成虫，将它们转移到凹陷玻片中的 20 到 30 微升 M 9 缓冲液中 要释放胚胎，请使用无菌手术刀，切开精子或外阴两侧的蠕虫。接下来，使用拉动的毛细管收集胚胎，该毛细管连接到移液管球上，宽度足以通过胚胎。使用粘在牙签上的睫毛将胚胎转移到新鲜制备的 aros 垫上。

通过将胚胎彼此相邻地推来创建 5 到 10 个胚胎的组。用盖玻片盖住载玻片，如果需要，添加更多 M nine 缓冲液，然后用预热的液体 valla 密封盖玻片。使用包含自动滤光片的落射荧光宽视野显微镜。

物镜、高分辨率 CCD 相机和高度电动的载物台。全部由软件控制。虽然这个系统没有它们，但使用 LED 和 E-M-C-CD 将限制对低放大倍率胚胎的光毒性。

手动聚焦胚胎以对神经母细胞进行成像。增加放大倍数并选择在宽视场显微镜上进行背侧排列或/或腹侧闭合早期的胚胎。选择 GFP 和 Texas 红色滤光片，并确定宽场系统上的最佳 Z 平面。

使用更少的 Zacks 和更少的时间点将降低光毒性，也将孔径缩小到 30%，如果可能，降低光强度将进一步降低光毒性。或者，使用带有控制扫描激光物镜软件的实时扫描扫描场或转盘共聚焦显微镜、E-M-C-C-D 相机和高度电动的载物台。现在采集设置已经优化，在宽视场显微镜上对胚胎进行成像。

建议在 RNAI 胚胎之前先对对照胚胎进行薄膜处理。使用扫场系统。将 4 88 和 5 61 100 毫瓦激光器设置为 40% 功率，狭缝为 50，曝光时间为 300 毫秒。

请务必注意，其他显微镜的这些设置会有所不同。将载玻片放在显微镜载物台上，然后使用低倍率物镜找到胚胎。然后切换到 60 或 100 x 油浸物镜。

聚焦后，每两分钟收集 20 个 0.2 微米的 Z 堆栈，总共 10 分钟。曝光时间可能需要调整。当通过荧光显微镜关闭孔径，选择较少的 Zacks 或时间点对胚胎进行活体成像时，必须考虑光毒性。

如果可能，减少暴露时间可以限制光毒性。使用 SW 场或转盘共聚焦显微镜可以帮助改善这个问题。使用采集软件确定您感兴趣的时间、点和 Z 平面。

将所需图像导出为多个 tiff。在处理软件（如 Image J）中，为每个时间点和感兴趣的通道打开所需的 Z 平面，并创建堆栈神经母细胞通常仅跨越几个平面。堆叠每个时间点的 Z 平面并创建 Z 堆栈投影。

对其他通道重复此作。完成所需时间点的所有 Zack 投影后，打开投影以创建时间序列。分别对每个通道执行此作。

对于每个通道，根据需要调整亮度和对比度。如有必要，旋转图像。然后选择感兴趣的区域并裁剪图像。

现在使用合并通道功能制作合并图像。为每个通道选择不同的颜色。将合并的图像另存为 RGB 文件，以便更清晰地显示图像。

使用 16 位 TIFF 图像，并在 edit 下选择反转功能，为每个通道创建灰度缩放图像。要确定目标物体的微米大小，请画一条线并将其长度乘以像素的大小，该像素的大小由成像参数确定。现在，制作一个比例尺，表示计算长度的比例（以微米为单位）。

最后，将最终图像保存为 8 位 tiffs。如果需要，使用图像 J 表皮将 tiffs 转换为电影。C elegant 的形态发生是由于表皮细胞形状变化、迁移和粘附在潜在增殖性神经母细胞的帮助下发生的。

表皮细胞迁移到腹侧中线并形成单层细胞以研究神经母细胞分裂胚胎，在腹侧封闭期间以增加的放大倍率成像，稳定表达共促基因和用 GFP 标记的神经母细胞特异性标记物和用 m cherry 标记的母体驱动的膜标记物。可视化神经母细胞正在分裂，神经母细胞核以绿色显示，周围膜以红色显示 使用宽视场显微镜捕捉对照胚胎中用 mCherry 膜探针勾勒出的分裂神经母细胞的延时图像，以更好地可视化对照胚胎中分裂的神经母细胞。每个通道都保持灰度，并使用扫描场共聚焦显微镜对照胚胎倒置图像。

在具有分裂神经母细胞的区域对表达火腿 1 GFP 和 M 樱桃 pH 值进行成像。使用宽视野显微镜观察用 RNAI 处理以敲低病态表达的相同胚胎。与对照胚胎不同，许多神经母细胞在分裂过程中停滞或消退，并使用扫描视野显微镜变成多核。

同样明显的是，许多神经母细胞在分裂过程中停滞或退化并变成多核细胞。该技术还可用于在组织形成过程中对迁移的细胞进行成像。此外，如果您的 Zacks 用于实现更快的成像，则可以获得有关亚细胞动力学的更多信息。

此外，使用适当的设备，该技术可用于激活光调谐探针以进行光遗传学。此外，Fret或Fret等显微镜技术可用于研究蛋白质、蛋白质相互作用或蛋白质动力学。