Name: 可视化的神经细胞胞质分裂过程中 C。线虫胚胎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-12T18:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 了解秀丽隐杆线虫胚胎神经母细胞胞质分裂的活体成像方法。本研究利用转基因标记和RNAi技术，结合宽场或共聚焦显微镜，揭示细胞分裂基因在发育组织中的功能机制。

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作者谨此致谢，本工作得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）基金的资助。

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<li>Audhya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+containing+the+Sm+protein+CAR-1+and+the+RNA+helicase+CGH-1+is+required+for+embryonic+cytokinesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans.</a> J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).</li>
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<li>Dorn, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tube+formation+in+polar+body+cytokinesis+requires+Anillin+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans.</a> Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).</li>
<li>Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了利用多种显微镜技术对中期胚胎发育过程中细胞分裂进行成像的方法。特别地，本方案重点介绍了如何对神经母细胞（可能参与表皮形态发生的细胞）的分裂过程进行成像。在多细胞动物发育过程中，细胞间通讯对组织形成具有重要作用。 秀丽隐杆线虫 是研究组织形成的理想模型 体内一个能很好地体现组织间相互作用的事件是表皮形态发生，该过程通过一层上皮细胞覆盖胚胎。其中，腹侧封闭是指腹侧表皮细胞迁移以包覆胚胎腹面的过程，这一过程依赖于其下方的神经母细胞。神经母细胞提供化学或机械信号，若其位置发生改变，腹侧封闭将受到破坏。神经母细胞的数量（或极性）也可能对腹侧封闭的正常进行至关重要，因此理解调控其分裂的机制具有重要意义。本实验方案描述了如何在活体组织中对细胞分裂进行成像 秀丽隐杆线虫 共表达两种荧光探针的胚胎（mCherry:PH用于标记细胞质膜轮廓，HAM-1:GFP用于标记神经母细胞核）。 
成像活体样本的最关键步骤 秀丽隐杆线虫 表达荧光探针的胚胎：i) 使用健康且年轻的表达目标荧光标记的雌雄同体成虫（在20–25 °C条件下培养），ii) 利用突变体或RNAi研究基...

尽管已有描述如何对早期细胞分裂进行成像的实验方案 秀丽隐杆线虫 胚胎，本方案描述了在胚胎发育中期对组织内细胞分裂进行成像的方法。在发育过程中对生物体进行成像的主要挑战之一是其对光毒性的敏感性。然而，随着转盘共聚焦显微镜和扫描场显微镜的普及，成像技术的应用范围得以进一步扩大。这两种系统均采用固态激光器和散射光，从而限制了生物体所暴露的紫外光水平。不过，宽场显微镜仍可用于成像 体内，特别是当它们配备了高灵敏度相机时（例如 EMCCD）、光圈控制和光照控制（例如 LED 或可调节的汞灯）。本实验方案介绍了如何使用共聚焦显微成像系统或宽场显微成像系统，对发育过程中细胞分裂进行成像 秀丽隐杆线虫 胚胎。例如，我们描述了如何对神经母细胞分裂进行成像。神经母细胞可通过向其上方的表皮细胞提供化学或机械信号，促进表皮形态发生，是细胞间通讯在组织形成中具有重要作用的典型范例。
Caenorhabditis elegans 因其透明性和简单的组织结构，是基于显微镜研究的理想模式生物1。此外，C. elegans 适用于遗传学方法和RNA干扰技术，且其许多基因具有人类同源基因，因此可用于鉴定组织形成的保守机制2-5。在 C. elegans 中，表皮的形成发生在胚胎发育中期，此时胚胎具有 &#62;300 个细胞。表皮形态发生包括多个主要阶段，在此期间，胚胎被一层表皮细胞包裹，这些细胞通过收缩和延伸，将胚胎从卵圆形转变为细长的蠕虫形态6。腹侧封闭（ventral enclosure）是其中一种形态发生事件，指腹侧表皮细胞向腹侧中线迁移，覆盖胚胎的腹面（图1）。首先，两对位于前部的 Leading edge 细胞向腹侧中线迁移，并与对侧相邻细胞黏附并融合6。随后，位于后部的 pocket 细胞迁移，形成楔形结构，产生一个腹侧口袋6-7。目前对关闭该口袋的机制尚不完全清楚。一种可能的机制是，一种超细胞的肌动蛋白-肌球蛋白收缩结构以类似“束带”的方式将 pocket 细胞连接在一起，类似于伤口愈合过程8。有趣的是，部分 pocket 细胞的迁移由其下方特定亚群的成神经细胞（neuroblasts）介导9（位于表皮下方的神经前体细胞；图1B）。
先前的研究表明，成神经细胞可调控腹侧表皮细胞的迁移和腹侧闭合过程。&#160;VAB-1（Ephrin受体）和VAB-2（Ephrin配体）在成神经细胞中高表达，有助于前部与后部成神经细胞之间的相互分离；vab-1或vab-2基因发生突变会导致腹侧闭合表型10-13。然而，启动子拯救实验表明，vab-1在覆盖其上的腹侧表皮细胞中同样必需，且腹侧表皮细胞还表达其他由成神经细胞分泌的导向信号的受体9。尽管这些受体中的任何一个发生突变均会引起腹侧闭合表型，但尚不明确缺陷的产生是源于成神经细胞定位异常，还是腹侧表皮细胞对导向信号响应失败所致14。在不影响成神经细胞分泌导向信号能力的前提下改变其分裂过程，可能有助于阐明成神经细胞在表皮形态发生过程中提供机械输入的作用。最近研究发现，一个细胞分裂相关基因ani-1（anillin）在成神经细胞中高表达（图2A），其表达缺失会导致成神经细胞分裂缺陷。有趣的是，这些胚胎表现出腹侧闭合表型（Fotopoulos, Wernike 和 Piekny，未发表观察结果）。
Anillin 对细胞分裂至关重要，尤其在胞质分裂过程中发挥关键作用，后者指母细胞物理分裂为两个子细胞的过程。胞质分裂由肌动蛋白-肌球蛋白收缩环的形成所驱动，该收缩环在时空上必须受到严格调控，以确保其与姐妹染色单体的分离过程精确偶联。在后生动物中，胞质分裂的主要调控因子是 RhoA（在秀丽隐杆线虫中称为 RHO-1）。 秀丽隐杆线虫），一种小GTP酶，其与GTP结合时具有活性。鸟嘌呤核苷酸交换因子Ect2/ECT-2激活RhoA后，RhoA-GTP与下游效应分子相互作用，形成收缩环并介导其向内收缩15Anillin 是一种多结构域蛋白，其C端与RhoA结合，N端与肌动蛋白和肌球蛋白结合。在哺乳动物或果蝇S2细胞中，Anillin对于稳定收缩环的位置是必需的。16Anillin 耗竭导致收缩环发生侧向振荡，最终细胞分裂失败，形成多核细胞17-19有趣的是，尽管 秀丽隐杆线虫 ani-1 在早期胚胎中协调肌动球蛋白收缩性，但它对胞质分裂并非必需。然而，如上所述， ani-1 在胚胎发育中期，神经母细胞的胞质分裂需要该因子（Fotopoulos, Wernike 和 Piekny，未发表观察结果）。胞质分裂失败会改变神经母细胞的数量和位置，可能影响化学导向信号分子的分布，或改变组织的力学特性。这两个模型均强调了神经母细胞在腹侧包裹过程中的非自主性作用，以及胚胎发育过程中组织间通讯的重要性。
本实验方案描述了如何对细胞分裂过程进行成像 秀丽隐杆线虫 利用荧光显微镜观察中期胚胎发育。大多数关于细胞分裂机制的研究均在培养皿中的单个细胞内进行（例如HeLa 或 S2 细胞）或细胞数量有限的早期胚胎中（例如 秀丽隐杆线虫 单细胞胚胎， 非洲爪蟾,&#160;或棘皮动物胚胎）。然而，研究组织内的细胞分裂同样重要，因为外部信号可能影响分裂面的时间和位置。此外，细胞可能提供化学或机械信号来影响邻近组织的发育，理解细胞间通讯如何促进组织在发育过程中形成具有重要意义。

<table><tbody><tr><td>琼脂</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#AGR001.1</td><td>用于制备 &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; NGM 培养基和 RNAi 培养板</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#9002-18-0</td><td>用于制备细菌 LB 琼脂平板</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Alexa Fluor 488 抗体</td><td>Life Technologies Corporation (Invitrogen)</td><td>#A11029</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠抗 GFP 抗体</td><td>Roche Applied Science</td><td>#11814460001</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 Alexa Fluor 568 抗体</td><td>Life Technologies Corporation (Invitrogen)</td><td>#A11011</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#AMP201.5</td><td>粉末储存于 4 &amp;deg;C，溶解后的氨苄青霉素储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Bactopetone&amp;nbsp;（蛋白胨-A）</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#G213</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（氯化钙）</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#C302.1</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#CHL380.25</td><td>溶于乙醇</td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D9542</td><td>用于核酸（DNA）染色</td></tr><tr><td>甘油</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#GLY001.1</td><td></td></tr><tr><td>IPTG（异丙基硫代-&amp;beta;-半乳糖苷）</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#367-93-1</td><td>粉末及溶解后的 IPTG 储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（磷酸二氢钾）</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#PPM666.1</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（磷酸氢二钾）</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#PPD303.1</td><td></td></tr><tr><td>L4440&amp;nbsp;（饲喂载体）</td><td>Addgene</td><td>#1654</td><td>以甘油菌形式保存于 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;（硫酸镁）</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#MAG511.500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl（氯化钠）</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（磷酸氢二钠）</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清（NDS）</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>#035-110</td><td></td></tr><tr><td>n-丙基-3,4,5-三羟基苯甲酸酯（没食子酸丙酯）</td><td>Alfa Aesar</td><td>#A10877</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8920</td><td>为获得最佳效果，需对显微镜载玻片进行三次包被&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>链霉素</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#STP101.50</td><td>粉末储存于 4 &amp;deg;C，溶解后的链霉素储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>四环素</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#TET701.10</td><td>粉末储存于 4 &amp;deg;C，溶解后的四环素储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>CAS#9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#TRP402.500</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#8013-01-2</td><td></td></tr></tbody></table>

可视化神经母细胞胞质分裂过程 秀丽隐杆线虫 胚胎发生

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

本方案描述了利用荧光显微镜对发育过程中分裂细胞进行成像的方法 秀丽隐杆线虫 胚胎。特别是，本方案重点介绍如何对位于表皮细胞下方的分裂期神经母细胞进行成像，这些神经母细胞可能在表皮形态发生过程中发挥重要作用。组织形成对于多细胞动物的发育至关重要。&#160;并依赖邻近组织提供的外部信号。 秀丽隐杆线虫 是研究组织形态发生的理想模式生物 体内 由于其透明性以及结构简单，使得其组织易于通过显微镜进行研究。腹侧封闭是指胚胎腹侧表面被单层上皮细胞覆盖的过程。这一过程被认为由下方的成神经细胞所促进，这些细胞提供化学引导信号，介导上方上皮细胞的迁移。然而，成神经细胞具有高度增殖性，也可能作为腹侧表皮细胞迁移的机械基质。利用本实验方案的研究可揭示细胞间通讯在组织形成过程中的重要性，并可用于阐明参与发育组织中细胞分裂的相关基因的功能。

本实验方案描述了如何对细胞分裂进行成像 秀丽隐杆线虫 胚胎发育中期的胚胎。特别是，本文描述了如何对神经母细胞进行成像，这些神经母细胞可能促进表皮形态发生。表皮形态发生是由于表皮细胞形状改变、迁移和黏附共同作用的结果，但也依赖于下方神经母细胞提供的化学或机械信号。图1B神经母细胞分泌引导信号，由腹侧表皮细胞表面的受体接收，从而调控这些细胞的迁移10,14,25此外，神经母细胞具有高度增殖性，这种增殖可能产生机械力，从而促进腹侧表皮细胞的迁移。26该方案可用于研究中期胚胎发育过程中的神经母细胞分裂。首先，构建共表达标记物的胚胎，以观察正在进行胞质分裂的神经母细胞（HAM-1:GFP 和 mCherry:PH）。HAM-1:GFP 表达一种绿色荧光蛋白（GFP）标记的蛋白，该蛋白定位于神经母细胞的细胞核27，且在胚胎发育中期存在许多其他细胞类型，因此必须使用&gt;300 个细胞； 图3）。由于DNA在有丝分裂期间会凝缩成染色体，因此这一特征也可作为细胞分裂的良好标记。mCherry:PH是一...

本方案描述了如何在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胚胎的组织内对分裂中的细胞进行成像。尽管已有多种方案描述了早期胚胎中细胞分裂的成像方法，但本方案重点介绍在胚胎发育中期至晚期阶段，对正在发育的组织内部细胞分裂过程的成像技术。

本方案描述了利用荧光显微镜对发育中的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胚胎内分裂细胞进行成像的方法。特别是，该方法……

以下实验的总体目标是在秀丽隐杆线虫胚胎发育过程中，观察正在分裂的细胞。为了研究控制细胞分裂的基因，首先需要构建或获取一种稳定表达转基因标记的秀丽隐杆线虫品系，该标记可用于标识目标细胞。第二步是通过将双链RNA喂给L4幼虫，持续24至48小时，以特异性敲低目标基因。从图形雌雄同体中收集RNAi胚胎，并将其转移至aros垫上进行活体成像。接着，利用宽场或共聚焦显微镜对胚胎进行成像，以观察细胞分裂表型。实验结果将展示神经母细胞在海胆胚胎发育过程中的分裂方式，以及相关基因在细胞分裂中所起的作用。该方法有助于揭示发育生物学和细胞生物学领域中的关键问题。例如，该方法可揭示在组织发育、细胞间通讯、细胞迁移或细胞极性过程中参与调控有丝分裂的基因和机制。使用表达适当标记物的转基因线虫，在对照或RNAi平板上培养24至48小时。选取四到六条成年线虫，转移至凹面载玻片中20至30微升M9缓冲液内。为释放胚胎，使用无菌解剖刀在精囊或阴门两侧切开虫体。接着，用连接在吸头球上的拉制毛细管收集胚胎，该毛细管口径需足够大以允许胚胎通过。最后，使用粘附在牙签上的睫毛将胚胎转移至新制备的琼脂垫上。将胚胎推挤至彼此相邻，形成每组五到十个胚胎的群体。用盖玻片覆盖载玻片，必要时添加更多M九缓冲液，然后用预热的液体封片剂密封盖玻片。使用配备自动滤光片的落射荧光宽场显微镜进行观察。目标是配备高分辨率CCD相机和高度自动化的载物台，所有组件均由软件控制。尽管该系统未采用LED光源，但使用E-M-C-C-D可在低倍率下显著降低对胚胎的光毒性。手动调整焦距以观察胚胎中的神经母细胞。在宽场显微镜下增加放大倍数，选择正在进行背侧间充质融合或早期腹侧闭合的胚胎。选用GFP和德克萨斯红滤光片，并在宽场系统上确定最佳的Z平面。减少Zacks数量和时间点可降低光毒性，同时将孔径关闭至30%，如果可能，进一步降低光照强度也可减少光毒性。 alternatively，使用由软件控制扫描激光物镜、E-M-C-C-D相机和高度电机化载物台的实时扫描扫场或转盘共聚焦显微镜。现在采集参数已优化，可在宽场显微镜下对胚胎进行成像。建议先对对照组胚胎进行成像，再对RNAi胚胎进行成像。使用扫场系统时，将488 nm和561 nm的100毫瓦激光器功率设为40%，狭缝宽度设为50，曝光时间为300毫秒。需要注意的是，其他显微镜的设置可能有所不同。将玻片放置在显微镜载物台上，先使用低倍物镜找到胚胎，然后切换至60或100倍油镜。聚焦后，每2分钟采集一次Z轴图像序列，每次以0.2微米的步长采集20组Z栈，共持续10分钟。曝光时间可能需要调整。通过荧光显微镜对活体胚胎进行成像时，必须考虑光毒性，可通过缩小光圈、减少Z栈层数或时间点数量来减轻。 如果可能，缩短曝光时间可限制光毒性。使用宽场（SW field）或转盘共聚焦显微镜有助于改善此问题。使用采集软件确定您感兴趣的时间点、位点和Z平面。将所需图像导出为多个 TIFF 文件。在 Image J 等处理软件中打开每个时间点和感兴趣通道对应的 Z 平面，创建堆栈，因为神经母细胞通常仅跨越少数几个平面。对每个时间点的 Z 平面进行堆栈处理，并生成 Z 堆栈投影。对其他通道重复此步骤。完成所有所需时间点的Zack投影后，打开投影以创建时间序列。对每个通道分别进行此操作。针对每个通道，根据需要调整亮度和对比度。如有必要，旋转图像。然后选择感兴趣区域并对图像进行裁剪。现在使用合并通道功能创建一幅合并图像，并为每个通道选择不同的颜色。将合并后的图像保存为RGB文件，以便更清晰地观察图像。使用16位TIFF图像，在编辑菜单下选择反相功能，为每个通道创建灰度图像。为了将感兴趣物体的尺寸换算为微米，绘制一条线并将其长度乘以像素尺寸，像素尺寸由成像参数确定。然后，制作一个代表计算出的微米长度比例的标尺。最后，将最终图像保存为8位TIFF格式。如有需要，可使用ImageJ将TIFF文件转换为视频。秀丽隐杆线虫（C. elegans）的表皮形态发生是由于表皮细胞形状改变、迁移和黏附共同作用的结果，这一过程在下方增殖性神经母细胞的协助下完成。表皮细胞迁移至腹侧中线并形成单层细胞，用于研究神经母细胞分裂的胚胎。在腹侧闭合过程中，使用更高倍数的显微镜观察稳定共表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的神经母细胞特异性标记物和母源驱动的mCherry标记的膜标记物的胚胎。神经母细胞被可视化，显示其正在进行分裂：神经母细胞核呈绿色，周围膜结构呈红色。在对照胚胎中，利用延时成像技术，通过mCherry膜探针标记的分裂中神经母细胞轮廓，使用宽场显微镜采集图像，以更清晰地观察对照胚胎中正在分裂的神经母细胞。每个荧光通道均保持灰度显示，并使用扫描场共聚焦显微镜对图像进行反相处理。在具有分裂神经母细胞的区域，对共表达GFP和M cherry pH的果蝇胚胎进行了成像。经RNAi处理以敲低an ill表达的相同胚胎，使用宽场显微镜进行观察。与对照组胚胎不同，许多神经母细胞在分裂过程中停滞或退化，并通过扫描场显微镜观察到出现多核现象。此外，许多神经母细胞在分裂过程中停滞或退化，形成多核细胞。该技术还可用于成像组织形成过程中迁移的细胞。同时，如果使用Zacks以实现更快的成像，则可以获得有关亚细胞动态的更多信息。此外，在配备适当设备的情况下，该技术还可用于激活光可调探针以进行光遗传学实验。同时，也可应用 fret 或 fret 等显微成像技术来研究蛋白质、蛋白质相互作用或蛋白质动态。

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C. elegans 胚胎是研究细胞生物学和发育过程的有力体系。本文介绍一种利用常见的落射荧光显微镜和开源软件，通过微分干涉差（DIC）光学或荧光技术对 C. elegans...

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Caenorhabditis elegans早期胚胎发育的延时显微成像

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可视化神经母细胞胞质分裂过程秀丽隐杆线虫胚胎发生

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