密度梯度多层聚合（dGMP的）:创建多室的，可定制的一种新技术，组织工程支架
February 12th, 2013
在这里，我们描述了一种独特的战略，创建连续不同的层之间的接口为组织工程的生物相容性，多层矩阵。这种支架可以提供一个理想的可定制的环境来调节细胞行为的各种生物，化学或机械的线索
该程序的总体目标是创建多层细胞培养支架。本视频将演示如何制备 2D 细胞培养基质，将粘附肽 RGDS 掺入交替层中，以分离 C 两个 C 12 细胞的区域。这是通过首先将 RGDS 肽拴在 acro 忠诚宏上来实现的。
然后用 LOR 染料标记宏肽组合，以便观察含有多层凝胶的肽层。第二步是从硅片上切下模具，然后将它们夹在两个载玻片之间，混合每层的各个组件。peg di acrl 和 peg di acrl 与 PEG RGDS Alexa three 50 的溶液在模具内交替分层。
凝胶通过紫外线照射聚合。最后一步是将 C 两个 C 12 细胞接种在 2D 多层凝胶上，以检查基质组成如何影响细胞的生长和附着。最终，明场和荧光显微镜用于观察支架上 C 两个 C 12 细胞的选择性生长。
与现有方法相比，该技术的主要优点是，它是一种创建多层 2D 和 3D 细胞培养基质的简单且经济高效的方法。它不依赖于昂贵的仪器。而层之间的界面是连续的，并且在结构上是完整的。
各个层的成分之间没有混合。这种方法可以帮助回答关键问题，例如细胞如何响应模式化的生化和机械线索进行迁移和极化。这种方法可以提供对细胞迁移和分化的温和见解，并且可以应用于其他系统，例如指导神经元干细胞的新右生长和突触发生。
要开始此程序，请在 Argonne 下的干燥 DMSO 中以 1 比 2 比 1 的摩尔比混合 RGDS 肽和 acro 油钉琥珀酰卡博甲酯。然后以相对于 aquilo PEG SCM 的 2 比 1 摩尔比加入 NN 二、丙基甲胺或 D-I-P-E-A，以帮助促进反应，使用发霉的 TOF 质谱法确认 aquilo PEG RGDS 分子的偶联。为此，将 1 微升 AQUILO PEG RGDS 反应溶液和 1 微升未反应性 AQUILO PEG SCM 添加到发霉目标的不同位置。
让它们都晾干。然后在 THF 涡旋中制备通用发霉基质的饱和溶液 1 分钟，并在相同的两个位置添加 1 微升。让它们都晾干。
接下来，加载样本。使用 SAVIS gole 平滑平顶基线减法和 OID 峰值检测算法，使用 60 赫兹激光器以大约 19% 的功率执行发霉的韧性分析。acro PEG RGDS 的分子量应向右移动，对应于共价结合肽引起的质量变化。
下一步是通过加入等摩尔量的 LOR 来偶联 Fluor，相对于溶解在最小体积 DMSO 中的 aquilo PEG SCM 到 aquilo PEG RGDS 反应溶液中，溶解在最小体积的 DMSO 中，在氩气下孵育过夜。然后使用 3， 500 DAU 分子量截留透析盒在 4 摄氏度下对染料水透析，纯化 acro 油钉 RGD S3 50。使用 1001 体积比继续透析 48 小时，每天至少更换两次冷透析液。
该产品通过 0.22 微米针式过滤器通过过滤器灭菌进一步纯化。最后，在无菌环境中，将无菌纯化的 acro 油钉 RGD S3 50 分装到无菌预加重微量离心管中。将打开的微量离心管密封在无菌通气管内。
冻干样品，并在零下 20 摄氏度下用石蜡膜密封储存。在 100% 甲醇中预洗玻片，并在 80 摄氏度的烘箱中干燥，直到液体蒸发。然后将装有载玻片的培养皿放入通风橱中，并向每张载玻片中加入 250 微升 sigma 涂层。
轻轻摇动载玻片 30 秒，以覆盖整个表面。接下来，用 100% 甲醇彻底冲洗包被的载玻片，然后用洗涤和蒸馏水，在至少 10 毫升水中浸泡两次，每次 5 分钟。冲洗后，让载玻片风干。
通过将一块硅胶修剪成与载玻片相同的尺寸来准备 0.8 毫米厚的硅胶空间。然后使用活检打孔器，在硅胶上打 10 毫米或 8 毫米的孔，以使用剃须刀片固定支架。在模具顶部制作大约两个毫米的通道，以允许添加脚手架材料。
然后对硅胶空间和 sigma 涂层处理的载玻片进行高压灭菌。还要对用于灌注凝胶的其他材料进行消毒，例如嵌管和镊子。在组织培养通风橱过滤器中，使用无菌的 1 毫升注射器和 0.2 微米过滤器对 Peg di aquil 的储备溶液进行消毒。
首先，通过将 50%PEG D acrl 与不同量的无菌 60%IO DAL 储备溶液 PBS 和光引发剂混合，为单个琥珀色微型垃圾管中的每一层配制 15% 重量体积比的 PEG 预聚物溶液，以产生不同最终浓度的 10%20%、30% 和 40%I oal，充分混合溶液以制备荧光标记的 15%PEG 预聚物溶液， 将终浓度为 8 毫摩尔的 50%PEG di aquil 和 aquilo PEG RGD S3 50 与 IO Dal 储备溶液 PBS 和琥珀色显微管中的光引发剂混合，得到浓度为 15%、25% 和 35%IO IAL 的溶液，充分混合溶液。接下来，通过在两个 sigma co 处理的载玻片之间放置预切垫片来组装模具，并用夹子固定。组装模具后，先加入 10 微升 40% 溶液，然后加入 10 微升荧光标记的 35% 溶液，形成分层凝胶。
重复交替分层以获得多个图层。接下来，用 365 纳米光照射模具三分钟。使用便携式 UVR 9， 000 灯，让聚合水凝胶固化 5 分钟。
然后取下夹具，轻轻提起顶部载玻片和模具。分层密度梯度。多层聚合或 DG MP 凝胶将保留在载玻片上。
使用无菌刮刀，小心地从模具中取出凝胶，并将其放入含有无菌 DMEM 的 50 毫升试管中。使用 1000：1 体积比的 DMEM 洗涤聚合凝胶 48 小时，每天更换两次缓冲液。这将去除任何密度、改性剂、光引发剂和 react 预聚合物。
然后将 DGMP 凝胶储存在补充有 1% 青霉素链霉素的 DMEM 中。为了观察交替层，请沿着凝胶成像装置样品盘上的尺子排列 DGMP 凝胶。然后使用 Alexa 对凝胶进行曝光和成像，DGMP 水凝胶中的三个 50 条交替的深色和蓝色条带展示了不同化学成分的离散层的形成。
要制备用于细胞培养的 DGMP 凝胶，请将其轻轻插入 48 孔细胞培养板的孔中。使用无菌细胞刮刀并在细胞培养基中冲洗 3 次。接下来，当 C 12 细胞培养板达到 60% 汇合时，从 100 毫米细胞培养板中收获两个 C 12 成肌细胞。
为此，请用预热的 PBS 冲洗板 3 次。然后加入 1 毫升 0.25% 的 EDTA 溶液，并在 37 摄氏度下孵育板 2 分钟。细胞分离后，加入 1 mL 预热培养基，将细胞转移到 50 mL 锥形管中进行离心。
细胞沉淀后，将 Reeses 细胞沉淀后，将它们置于生长培养基中，并通过添加 triam blue 并使用 TC 10 细胞计数器对活细胞进行计数。然后用 C 两个 C 12 成肌细胞接种 DG MP 支架，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育 24 小时。使用落射荧光和相差显微镜确认 C 两个 C 12 成肌细胞附着在含有 DGMP 凝胶层的 RGDS 上。
DGMP 凝胶的交替层可能含有各种肽，例如右图所示的 RGDS，它支持细胞附着和生长。然而，左侧的层不包含任何细胞附着肽，细胞无法在该区域存活。IO 二醇会影响凝胶的硬度。
在这里，使用原子力显微镜测量弹性模量。在该凝胶配方中使用 60% IAL 时，刚度增加了 30%，IAL 对凝胶刚度的影响可能因所使用的材料而异在尝试此程序时，重要的是要记住层的顺序。包含最高 IEX null 值的图层将位于底部，而 IEX null 值最少的图层将位于顶部。
永远记住在最后添加光引发剂，以防止环境光聚合。我们与合作者一起，正在采用这种技术来组织 3D 神经突生长。这将允许比较来自健康个体和神经发育障碍患者的神经祖细胞。
不要忘记，在紫外线下工作可能很危险。进行交联步骤时佩戴紫外线防护眼镜。
概述
本文介绍了一种通过各种信号调控细胞行为的生物相容性多层细胞培养基质的制备方法。该技术允许生产2D和3D基质，而无需昂贵的仪器设备。
关键研究组成部分
科学领域
- 组织工程
- 细胞培养
- 生物材料
背景
- 多层基质对于研究细胞行为至关重要。
- 现有方法通常需要昂贵的设备。
- 生物相容性对于组织工程应用至关重要。
- 了解细胞迁移和分化是推进再生医学的关键。
研究目的
- 开发一种经济有效的方法来制造分层细胞培养基质。
- 研究基质组成如何影响细胞生长和附着。
- 提供对细胞对生物信号反应的行为洞察。
使用的方法
- RGDS肽和聚合物溶液的制备。
- 使用UV聚合进行凝胶分层。
- 在基质上播种C2C12细胞。
- 使用显微技术观察细胞生长。
主要结果
- 该方法成功创建了具有不同界面的多层基质。
- 细胞生长和附着受到基质组成的影响。
- 荧光显微镜确认了基质上的选择性细胞生长。
结论
- 这种技术为基质制作提供了一种简单有效的方法。
- 它可应用于各种生物学研究，包括神经干细胞研究。
- 该方法增强了对细胞在工程环境中行为的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
DGMP enables the rapid fabrication of multi-compartment, customizable scaffolds with spatially distinct biochemical and mechanical properties, addressing a key challenge in tissue engineering and advanced cell model development. This technique supports predictive confidence in cell behavior studies by maintaining structural integrity at layer interfaces and allowing precise control over matrix cues. Its operational simplicity and adaptability position DGMP as a reusable platform for early discovery and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell response to spatially patterned biological and mechanical cues.
- Supports functional validation of adhesion peptides and matrix components in controlled environments.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating effects of specific scaffold variables on cell fate.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible matrices for quantitative assessment of cell attachment and growth.
- Allows for rapid prototyping of assay-ready scaffolds with tunable properties.
- Supports scalability and platform reuse across multiple cell types and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Enables modeling of disease-relevant tissue interfaces and gradients for preclinical studies.
- Facilitates alignment of in vitro findings with in vivo tissue complexity.
- Supports risk-adjusted advancement of biomaterial candidates for regenerative medicine.
Pipeline & Workflow Integration
DGMP fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of matrix effects on cell behavior and supporting downstream assay development and translational modeling.
- Discovery Biology: Permits controlled hypothesis testing of cell-matrix interactions and pathway responses.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts of cell attachment and viability across scaffold layers.
- Analytics: Supports fluorescence and phase contrast microscopy for comparative analysis of scaffold performance.
- Translational Research: Bridges in vitro and in vivo relevance by enabling complex, multi-layered tissue models.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable scaffold fabrication platform for diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell-based assays and reduces mechanistic ambiguity in matrix-driven studies.
- Operational Value: Simplifies scaffold fabrication, enhances reproducibility, and minimizes need for specialized instrumentation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling robust, scalable model systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of biomaterial and cell therapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polymer chemistry and cell culture techniques.
- Needs access to UV polymerization equipment and fluorescence microscopy.
- Demands cross-team standardization of scaffold composition and layer sequencing.
- Adaptable to various biomaterials and cell types with protocol modifications.
- Layer order and density modifier concentration must be carefully controlled to ensure reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:17
Synthesis of Fluorescently Labeled Acryloyl-PEG-RGDS
5:14
Fabrication of 2-D Molds
6:39
Fabrication of PEG Gel with Alternating RGDS-Alexa 350 Layer
9:47
2-D Cell Culture of C2C12 Myoblasts on DGMP Gels
11:15
Results: DGMP Gels can Vary Properties to Analyze Cellular Attachment and Growth
12:02
Conclusion
