密度梯度多层聚合（DGMP）：一种用于组织工程中构建多区室、可定制支架的新型技术

本实验的总体目标是构建一种多层细胞培养支架。本视频将演示如何制备一种二维细胞培养基质，通过在交替层中引入黏附肽RGDS，以分隔C2C12细胞的不同区域。该过程首先将RGDS肽固定到一种丙烯酰基团修饰的大分子上。

随后，将宏肽组合与LOR染料标记，以便观察多层凝胶中含有肽的各层。第二步是通过从硅胶片上切割制备模具，并将其夹在两块载玻片之间；接着进行各层组分的预混。将聚乙二醇二丙烯酸酯（peg di acrl）溶液与含有PEG-RGDS-Alexa 350的聚乙二醇二丙烯酸酯溶液交替层叠注入模具中。

通过紫外光照射使凝胶发生聚合。最后一步是在二维多层凝胶上接种C2C12细胞，以研究基质组成对细胞生长和附着的影响。最终，利用明场和荧光显微镜观察C2C12细胞在支架上的选择性生长情况。

与现有方法相比，该技术的主要优势在于它是一种简单且经济高效的方法，可用于构建多层二维和三维细胞培养基质。该方法无需依赖昂贵的仪器设备。同时，各层之间的界面连续且结构完整。

各层组分之间不会发生混合。该方法有助于回答一些关键科学问题，例如细胞如何响应模式化的生物化学和力学信号而迁移并建立极性。该方法可温和地揭示细胞迁移与分化过程，并可拓展应用于其他体系，例如引导神经干细胞的新生突起生长及突触形成。

开始此实验步骤时，在氩气环境中，将RGDS肽与AQUILO油基PEG琥珀酰羧甲酯以1:2:1的摩尔比溶于无水DMSO中。然后加入N,N-二异丙基乙胺（D-I-P-E-A），其摩尔比相对于AQUILO PEG SCM为2:1，以促进反应进行。使用基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF）确认AQUILO PEG-RGDS分子的偶联情况。具体操作为：分别取1微升AQUILO PEG RGDS反应溶液和1微升未反应的AQUILO PEG SCM，点样于MALDI靶板的不同位置。

让两者均干燥。然后在THF中制备饱和的通用霉菌基质溶液，涡旋震荡一分钟，取一微升加入相同的两个点位上。让两者均干燥。

接下来，加载样品。使用60赫兹激光，以约19%的功率进行霉变坚韧分析，采用SAVIS高斯平滑、top hat基线校正和OID峰检测算法。acro PEG RGDS的分子量应向右偏移，对应于共价结合肽所引起的质量变化。

下一步是通过向溶解于最小体积 DMSO 中的等摩尔量 LOR three 50 羧酸琥珀酰亚胺酯相对于 aquilo PEG SCM，加入至 aquilo PEG RGDS 反应溶液中，在氩气保护下室温孵育过夜，从而实现荧光素的偶联。然后通过在 4 摄氏度条件下使用 3,500 DA 分子量截留值透析盒对纯水透析，纯化 acro oil peg RGD S3 50。以 100:1 的体积比持续透析 48 小时，每天至少更换两次冷透析液。

通过0.22微米注射器滤器进行过滤除菌，对产物进一步纯化。最后，在无菌环境中，将无菌的纯化Acro Oil PEG RGD S3 50分装至预先称重的无菌微量离心管中。将开口的微量离心管在无菌透气管内密封。

将样品冷冻干燥，并用石蜡膜密封后于零下20摄氏度保存。用100%甲醇预清洗载玻片，并在80摄氏度烘箱中干燥至液体完全蒸发。然后将盛有玻璃载玻片的容器放入通风橱中，向每张载玻片加入250微升Sigma Coat溶液。

轻轻晃动载玻片30秒，以使整个表面均匀覆盖。随后，先用100%甲醇彻底冲洗已涂覆的载玻片，再依次用蒸馏水浸泡清洗，每次至少10毫升，每次五分钟，共洗两次。冲洗完毕后，将载玻片静置晾干。

通过将硅胶片修剪至与玻璃载片相同尺寸，制备厚度为0.8毫米的硅胶间隔片。然后使用活检打孔器，在硅胶上打出直径10毫米或8毫米的孔，用于容纳支架，并用剃刀片修整。在模具顶部制作约2毫米宽的通道，以便加入支架材料。

然后将硅胶间隔片和经sigma涂层处理的玻片进行高压灭菌以实现消毒。同时对用于凝胶浇铸的其他材料（如离心管和镊子）进行灭菌。在组织培养超净台中，使用无菌的1毫升注射器和0.2微米滤器对PEG二丙烯酸酯的储存液进行过滤除菌。

首先，在各个独立的棕色微量离心管中，通过将50% PEG二丙烯酸酯与不同体积的无菌60% IO DAL储备溶液、PBS缓冲液以及光引发剂混合，配制每层所需浓度为15%（重量/体积比）的PEG预聚物溶液，最终分别获得含10%、20%、30%和40% IO DAL的溶液。充分混匀各溶液。为制备荧光标记的15% PEG预聚物溶液，将50% PEG二丙烯酸酯与Aquiol PEG-RGD-S3（终浓度为8毫摩尔）以及IO DAL储备溶液、PBS缓冲液和光引发剂在棕色Microview管中混合，最终获得含15%、25%和35% IO DAL的溶液，充分混匀各溶液。接下来，组装模具：将预先裁剪好的间隔片置于两片经sigma co处理的载玻片之间，并用夹具固定。模具组装完成后，开始浇铸分层凝胶：先加入10微升40%的溶液，随后加入10微升荧光标记的35%溶液。

重复交替层叠以形成多层结构。接着，用365纳米的光照射模具3分钟。使用便携式UVR 9,000灯，使聚合的水凝胶固化5分钟。

然后移除夹子，轻轻抬起顶部的玻璃载片和模具。分层密度梯度。多层聚合或密度梯度聚合物（DG MP）凝胶将保留在载片上。

使用无菌刮勺小心地将凝胶从模具中取出，并放入含有无菌 DMEM 的 50 毫升离心管中。用 DMEM 以 1000:1 的体积比洗涤聚合后的凝胶，每天更换缓冲液两次，持续 48 小时。此步骤将去除任何密度剂、修饰剂、光引发剂以及未反应的预聚物。

然后将 DGMP 凝胶储存于添加了 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 中。为观察交替层结构，将 DGMP 凝胶沿尺子排列在凝胶成像仪的样品托盘上。随后使用 Alexa 350 进行曝光和成像；DGMP 水凝胶中交替出现的暗色与蓝色条带表明形成了具有不同化学成分的独立层。

为准备用于细胞培养的 DGMP 凝胶，将其轻轻插入 48 孔细胞培养板的孔中。使用无菌细胞刮刀，并用细胞培养基冲洗三次。接下来，当 C2C12 成肌细胞在 100 毫米细胞培养皿中达到 60% 汇合度时，收集细胞。

为此，用预热的 PBS 清洗培养板三次。然后加入 1 毫升含 EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶溶液，于 37 摄氏度孵育 2 分钟。待细胞脱落后，加入 1 毫升预热的培养基，将细胞转移至 50 毫升锥形管中进行离心。

细胞经离心沉淀后，用生长培养基重悬，加入台盼蓝并使用TC 10细胞计数仪计数活细胞。随后将C2C12成肌细胞接种于DGMP支架上，在37°C、5% CO₂条件下培养24小时。通过落射荧光显微镜和相差显微镜观察RGDS修饰的DGMP凝胶层上C2C12成肌细胞的黏附情况。

DGMP 凝胶的交替层可能含有多种肽，例如右侧所示的 RGDS，该肽可支持细胞附着和生长。然而，左侧的层不含任何细胞附着肽，因此细胞在该区域无法存活。IO 二醇可影响凝胶的刚性。

此处采用原子力显微镜测量了弹性模量。当该凝胶配方中使用30% IAL时，刚度提高了60%。IAL对凝胶刚度的影响可能因所用材料的不同而有所变化。在进行该操作时，需注意各层的顺序：含有最多IEX null的层位于底部，而含有最少IEX null的层则位于顶部。

务必始终在最后添加光引发剂，以防止环境光引发聚合反应。我们正与合作者共同改进该技术，以实现三维环境中神经突起生长的有序排列。这将有助于比较来自健康个体和神经发育障碍患者的神经前体细胞。

请注意，使用紫外线可能有危险。进行交联步骤时，请佩戴防紫外线护目镜。