Name: 密度梯度多层聚合（dGMP的）:创建多室的，可定制的一种新技术，组织工程支架 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: 了解密度梯度多层聚合技术，用于组织工程与细胞培养研究。该方法利用RGDS肽和UV聚合制备多层生物相容性支架，无需昂贵仪器即可调控C2C12细胞生长与附着行为。

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作者感谢美国国立卫生研究院（NIH）院长新创新者奖（1DP2 OD006499-01 资助 A.A.，1DP2 OD006460-01 资助 A.J.E.）以及沙特阿拉伯科学技术城（King Abdulaziz City for Science and Technology）对加州大学圣地亚哥分校纳米医学卓越中心的支持。我们感谢杰西卡·摩尔女士（Ms. Jessica Moore）对本文稿提出的宝贵意见。

1. 荧光标记丙烯酰基-PEG-RGDS的合成
<ol>
 <li>将RGDS肽与丙烯酰基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺羧甲酯（aPEG-SCM，PEG分子量：3400 g/mol）以及N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）按1.2:1:2的摩尔比在二甲基亚砜（DMSO）中混合，在氩气保护下室温反应过夜。</li>
 <li>通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）确认偶联结果。取1 μl aPEG-RGDS反应液点样于MALDI靶板样品位并干燥。用四氢呋喃（THF）配制通用MALDI基质的饱和溶液，涡旋1分钟，取约1 μl加至同一样品位。同时对aPEG-SCM进行相同操作作为对照。上机检测分析。aPEG-RGDS的分子量应大于aPEG-SCM（图2）。</li>
 <li>为偶联荧光染料，将等摩尔量的Alexa Fluor 350羧酸（琥珀酰亚胺酯）溶于最小体积的DMSO中，加入步骤1.1所得aPEG-RGDS反应液，在氩气保护下室温反应过夜。</li>
 <li>将aPEG-RGDS-350通过透析（截留分子量3500 Da）在4 °C下对去离子H2O进行纯化，体积比为1,000:1，透析液每天至少更换两次，持续48小时。</li>
 <li>将纯化后的aPEG-RGDS-350在Labconco Freezone Plus或同等冻干系统中冷冻干燥，并于-20 °C保存。</li>
</ol>
2. 制备二维模具及具有交替RGDS-350层的二维PEG凝胶的构建
<ol>
 <li>制备疏水性玻片。将洁净的玻片放入玻璃培养皿中，置于真空烘箱内，80 °C加热30分钟，以彻底干燥表面。将盛有玻片的培养皿置于通风橱中，每张玻片上加入250 μl Sigmacote，轻轻摇晃30秒，使溶液均匀覆盖整个表面。用100%甲醇彻底冲洗涂覆后的玻片，随后用蒸馏水洗涤，每次至少使用10 ml，浸泡两次，每次5分钟。 </li>
 <li>使用10 mm活检打孔器切割0.8 mm厚的硅胶垫片。 </li>
 <li>对硅胶间隔片和经Sigmacote处理的载玻片进行高压灭菌。 </li>
 <li>在单独的微量离心管中配制各相应层的溶液，将聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGda）前体（终浓度为15% w/v）与不同体积的碘克沙醇（碘克沙醇60%水溶液储备液）混合，以获得不同的终浓度（例如 40%、30%、20% 和 10%），用磷酸盐缓冲液（PBS）补足至终体积，以获得不同密度梯度的溶液。类似地，对于交替层结构，将 aPEG-RGDS-350（终浓度 8 mM）与碘克沙醇和 PBS 混合，得到不同浓度的溶液。例如 35%、25% 和 15% </li>
 <li>向各层溶液中加入光引发剂（2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮，333 mg/ml 储存液溶于N-乙烯基吡咯烷酮中）（每毫升各层溶液中加入10 μl 储存液）。光引发剂应在最后加入，以防止凝胶在模具中分层前发生聚合，因其对光敏感。 </li>
 <li>本方案的后续步骤将在生物安全柜中进行，以确保无菌环境。</li>
 <li>使用无菌1 ml注射器和0.2 μm滤器对每种溶液进行过滤除菌。将间隔片夹在两个经Sigmacore处理的玻璃载玻片之间，按图示方式用夹具固定，组装模具装置。 图1. </li>
 <li>通过加入密度最高的溶液来制备分层凝胶例如 PEGda 加入 40% 碘克沙醇）先加入，随后加入密度较低的溶液（例如 aPEG-RGDS-350 与 35% 碘克沙醇）。重复交替叠加，以获得如图所示的多个具有目标组分和密度的层 图1. </li>
 <li>使用便携式UVR-9000灯以365 nm光照照射模具3分钟。让聚合后的凝胶固化5分钟。取下夹具，然后轻轻抬起上层玻璃载片和模具；分层的DGMP凝胶将保留在载片上。用无菌刮勺小心地将凝胶转移至含有无菌PBS或培养基的50 ml离心管中进行洗涤。</li>
 <li>用 PBS 以 1,000:1 的体积比洗涤聚合后的凝胶，每天至少更换缓冲液两次，以去除密度调节剂、光引发剂和未反应的聚合物。或者，可用细胞培养基替代 PBS 进行更换。将 DGMP 凝胶保存在 PBS 或培养基中，用于第 3 步所述的细胞培养实验。</li>
 <li>为观察交替层结构，将DGMP凝胶（这些凝胶不可用于细胞培养）沿样品托盘中的标尺排列于VersaDoc凝胶成像系统的样品托盘上。在350 nm波长下曝光凝胶，曝光时间根据荧光染料浓度而定。DGMP水凝胶中交替出现的深色与蓝色条带表明已形成具有不同化学组成的离散层。图3). </li>
</ol>
3. 在 DGMP 凝胶上进行二维细胞培养
<ol>
 <li>对于含有RGDS肽的凝胶，应使用依赖黏附的细胞，例如C2C12成肌细胞。
 </li>
 <li>在生物安全柜中，使用无菌细胞刮棒小心地将保存在PBS中的DGMP凝胶插入48孔细胞培养板的孔中。
 </li>
 <li>将培养基（含10% v/v胎牛血清和1% v/v 100倍青霉素-链霉素溶液的Dulbecco改良Eagle培养基，即DMEM）和PBS置于37 °C水浴中预热。
 </li>
 <li>用PBS清洗一片60%融合度的C2C12细胞培养皿（直径10 mm）三次，吸除PBS后，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C孵育2分钟以收获细胞。将细胞重悬于生长培养基中并计数，随后在含有DGMP凝胶的细胞培养孔中接种C2C12成肌细胞（20,000个细胞/cm2）。将细胞置于37 °C、5%CO2/95%相对湿度条件下培养。4小时后轻柔更换培养基，注意避免移除尚未牢固贴壁的细胞。
 </li>
 <li>24小时后，可通过倒置荧光显微镜和相差显微镜（Zeiss Axiovert 200）观察确认C2C12成肌细胞在含RGDS的DGMP凝胶层上的贴附情况。
 </li>
</ol>

<ol><li>Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+in+biomaterials+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Complexity in biomaterials for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).</li>
<li>Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein+and+cell+adhesivity+using+PEO-terminated+triblock+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers.</a> J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).</li>
<li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+zonal+organization+into+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage.</a> Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).</li>
<li>Hahn, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+patterning+of+polyethylene+glycol+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels.</a> Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).</li>
<li>Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+formation+of+covalently+bonded+hydrogel+multilayers+through+surface+initiated+photopolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization.</a> Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).</li>
<li>Harley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+multiphase+osteochondral+scaffold.+II.+Fabrication+of+a+mineralized+collagen-glycosaminoglycan+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).</li>
<li>Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+microfluidic+PEGDA+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Multilayer microfluidic PEGDA hydrogels.</a> Biomaterials. 31, 5491-5497 (2010).</li>
<li>Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+protein+concentration+gradients+mediated+by+density+differences+of+poly%28ethylene+glycol%29+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres.</a> Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).</li>
<li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+properties+of+laminated+alginate+gels+for+tissue+engineering+of+layered+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).</li>
<li>Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+gradient+multilayer+polymerization+for+creating+complex+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue.</a> Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).</li>
<li>Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+attachment+activity+of+fibronectin+can+be+duplicated+by+small+synthetic+fragments+of+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule.</a> Nature. 309, 30-33 (1984).</li>
<li>Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+Situ+Mechanical+Analysis+of+Myofibrillar+Perturbation+and+Aging+on+Soft%2C+Bilayered+Drosophila+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)"> In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium.</a> Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

DGMP 是一种制备多层凝胶的简单策略，无需依赖昂贵的仪器。该方案可适用于其他生物相容性材料（如胶原蛋白和透明质酸）来构建支架。生物活性小分子（例如促进细胞黏附的 RGDS 肽）可共价连接至聚合物基质中，以防止不同层之间的信号分子混合。蛋白质可在不同层中被包埋，且无需化学偶联，因为根据基质网孔尺寸的不同，蛋白质较不易在水凝胶中扩散10。本文中我们使用了碘克沙醇（Nycoprep），这是一种惰性的密度调节剂，此前已被用于活细胞相关应用。其他密度调节剂（如蔗糖和右旋糖）也可使用。通过调节沉降时间（ts），可精确调控两层之间的界面，以按需形成平滑或陡峭的过渡（较长的沉降时间产生更平滑的过渡）10。例如，DGMP 凝胶层之间的平滑过渡可用于构建生物信号的连续梯度，以研究细胞趋化性等细胞过程。
密度调节剂对凝胶刚度的影响如图5所示，该数据基于15% aPEGda凝胶；目前我们正在进一步评估凝胶刚度和孔隙率随PEGda和碘克沙醇浓度变化的更完整表征。尽管本示例中的PEGda浓度相对较高，但我们观察到，与不含碘克沙醇的凝胶相比，含30%碘克沙醇的凝胶其弹性模量高出60%。通过调节大分子单体浓度或交联密度，可对凝胶刚度的变化进行调控。
我们还应用了 DGMP 技术，利用聚丙烯酰胺和聚乙二醇前体来制备三维多层凝胶10。通过改变预聚物的浓度或交联程度，可实现支架结构的多样化，从而用于研究细胞在三维环境中的极性生长和迁移等行为。
总之，数字光处理微立体光刻（DGMP）是一种可灵活应用的技术，可用于多种生物相容性材料，制备适用于广泛生物医学及基础研究领域的二维和三维支架。

<table><tbody><tr><td>聚乙二醇琥珀酰亚胺羧甲基（a-PEG-SCM）</td><td>Laysan</td><td>120-64</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGda）</td><td>Dajac Labs</td><td>9359</td><td></td></tr><tr><td>精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸（RGDS）</td><td>American Peptide</td><td>49-01-4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-二异丙基乙胺（DIPEA）</td><td>Sigma</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N-&lt;/em&gt;二甲基甲酰胺（DMF）</td><td>Fisher</td><td>D119-4</td><td></td></tr><tr><td>四氢呋喃（THF）</td><td>Fisher</td><td>T397</td><td></td></tr><tr><td>透析夹（3500 Da）</td><td>Thermo Scientific</td><td>66330</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350 羧酸琥珀酰亚胺酯</td><td>Life Technologies</td><td>A-10168</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>硅胶垫片</td><td>Grainger</td><td>1MWA4</td><td></td></tr><tr><td>活检打孔器</td><td>Acuderm</td><td>P1025 (10 mm)&lt;br/&gt; P850 (8 mm)</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Hyclone</td><td>SH30028</td><td></td></tr><tr><td>碘克沙醇（NycoPrep）</td><td>Fisher</td><td>NC9388846</td><td></td></tr><tr><td>2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮</td><td>Sigma</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Life Technologies</td><td>11054</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>C2C12 成肌细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>MALDI</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>UVR-9000</td><td>Bayco</td><td>UVR-9000</td><td></td></tr><tr><td>VersaDoc</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

密度梯度多层聚合（dgmp）：一种用于组织工程中构建多区室、可定制支架的新型技术

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

复杂的组织培养基质中，生物刺激的类型和浓度（例如生长因子、抑制剂或小分子）或基质结构（例如基质的成分、浓度或刚度）在空间上存在变化，这将能够支持大量关于这些变量如何影响细胞分化、迁移及其他现象的研究。构建分层基质的主要挑战在于，在防止各层中单个组分扩散的同时，维持层间界面的结构完整性1。目前实现这一目标的方法包括光图案化2-3、光刻技术4、逐层功能化5、冷冻干燥6、微流控技术7或离心法8，其中许多方法需要复杂的仪器设备和技术操作能力。另一些方法依赖于各层的依次附着，但可能导致层间脱层9。
DGMP 通过使用惰性密度调节剂（如碘克沙醇）形成不同密度的分层结构，从而克服了上述问题10。由于密度调节剂可与任何预聚物或生物活性分子混合，DGMP 允许对每个支架层进行定制化设计。仅通过调节密度调节剂的浓度，即可在保持各层均为水相的同时防止相邻层之间的混合。随后通过一步聚合反应，形成结构连续的多层支架，其中每一层都具有独特的化学和力学特性。通过充分冲洗即可轻松去除密度调节剂，且不会干扰各层结构及其组分。因此，该技术非常适用于制备各种尺寸、形状和材料的水凝胶。
以下概述了一种制备二维聚乙二醇（PEG）凝胶的方案，其中交替层含有RGDS-350。我们使用PEG是因为其具有生物相容性和惰性。RGDS是一种细胞黏附肽11，用于展示生物信号的空间限制性；而荧光染料（Alexa Fluor 350）的偶联使我们能够直观区分不同层次。该方法可适用于其他材料（例如 胶原蛋白、透明质酸等），并可通过一些修改扩展用于制备三维凝胶10。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）分析证实了RGDS肽与丙烯酰基-PEG的成功偶联（图2）。凝胶成像显示，在光聚合后形成了交替分布的RGDS-350（蓝色）层（图3A）。如图3A所示，二维数字光加工微图案（DGMP）凝胶的尺寸可根据硅胶模具的直径进行调节（左侧为10 mm，右侧为8 mm），因此可灵活定制以适用于多种检测——本例中可适配48孔细胞培养板（图3B）。在DGMP凝胶上培养的C2C12成肌细胞经落射荧光与相差显微镜观察，显示细胞选择性地附着于含有RGDS-350的PEG层区域（图4），表明细胞黏附肽（RGDS）实现了空间区室化分布。
<img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1.jpg" alt="基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图，aPEG-SCM 与 aPEG-RGDS 的强度对比分子量。" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）分析分子量，比较RGDS肽偶联后获得的 aPEG-SCM 与 aPEG-RGDS。 
<img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2.jpg" alt="溶剂密度梯度示意图、二维多层组织基质、碘克沙醇、光子装置。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 密度梯度微图案（DGMP）凝胶制备的示意图。 在梯度层叠加后，可静置不同时间（ts）以形成渐变界面，随后进行光聚合。分层的DGMP凝胶可轻松从模具中取出，用于后续实验。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50018/50018fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig3.jpg" alt="微流控图案分析示意图；用于细胞培养测试的多孔板实验。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. A) 光聚合后通过 VersaDoc 凝胶成像系统在 350 nm 和白光通道下获得的 2D 多层凝胶图像。灰度图像显示含有 RGDS 的层呈白色，交替分布。 B) 将 DGMP 凝胶插入 48 孔细胞培养板中。
<img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig4.jpg" alt="成纤维细胞的显微镜图像；在50 μm尺度下进行细胞形态学研究；生物医学研究。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 在DGMP凝胶上培养的C2C12成肌细胞的相衬与落射荧光合并图像（比例尺：50 μm）。
<img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig5.jpg" alt="弹性模量与碘克沙醇浓度关系图；星号表示统计学显著性。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 碘克沙醇对凝胶表面弹性的影响。 采用已有方法，通过原子力显微镜测量交联 PEG 基质的静态样品，触发力为 2 nN12。*p&lt; 0.05，**p&lt;0.01。

本文介绍了一种用于构建生物相容性多层基质的独特策略，该基质具有不同层之间的连续界面，适用于组织工程。此类支架可通过多种生物、化学或力学信号，为调控细胞行为提供理想的可定制环境

密度梯度多层聚合（DGMP）：一种用于组织工程中构建多区室、可定制支架的新型技术

复杂的组织培养基质，其中生物刺激物的种类和浓度（如生长因子、抑制剂或小分子）或基质……

本实验的总体目标是构建一种多层细胞培养支架。本视频将演示如何制备一种二维细胞培养基质，通过在交替层中引入黏附肽RGDS，以分隔C2C12细胞的不同区域。该过程首先将RGDS肽固定到一种丙烯酰基团修饰的大分子上。随后，将宏肽组合与LOR染料标记，以便观察多层凝胶中含有肽的各层。第二步是通过从硅胶片上切割制备模具，并将其夹在两块载玻片之间；接着进行各层组分的预混。将聚乙二醇二丙烯酸酯（peg di acrl）溶液与含有PEG-RGDS-Alexa 350的聚乙二醇二丙烯酸酯溶液交替层叠注入模具中。通过紫外光照射使凝胶发生聚合。最后一步是在二维多层凝胶上接种C2C12细胞，以研究基质组成对细胞生长和附着的影响。最终，利用明场和荧光显微镜观察C2C12细胞在支架上的选择性生长情况。与现有方法相比，该技术的主要优势在于它是一种简单且经济高效的方法，可用于构建多层二维和三维细胞培养基质。该方法无需依赖昂贵的仪器设备。同时，各层之间的界面连续且结构完整。各层组分之间不会发生混合。该方法有助于回答一些关键科学问题，例如细胞如何响应模式化的生物化学和力学信号而迁移并建立极性。该方法可温和地揭示细胞迁移与分化过程，并可拓展应用于其他体系，例如引导神经干细胞的新生突起生长及突触形成。开始此实验步骤时，在氩气环境中，将RGDS肽与AQUILO油基PEG琥珀酰羧甲酯以1:2:1的摩尔比溶于无水DMSO中。然后加入N,N-二异丙基乙胺（D-I-P-E-A），其摩尔比相对于AQUILO PEG SCM为2:1，以促进反应进行。使用基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF）确认AQUILO PEG-RGDS分子的偶联情况。具体操作为：分别取1微升AQUILO PEG RGDS反应溶液和1微升未反应的AQUILO PEG SCM，点样于MALDI靶板的不同位置。让两者均干燥。然后在THF中制备饱和的通用霉菌基质溶液，涡旋震荡一分钟，取一微升加入相同的两个点位上。让两者均干燥。接下来，加载样品。使用60赫兹激光，以约19%的功率进行霉变坚韧分析，采用SAVIS高斯平滑、top hat基线校正和OID峰检测算法。acro PEG RGDS的分子量应向右偏移，对应于共价结合肽所引起的质量变化。下一步是通过向溶解于最小体积 DMSO 中的等摩尔量 LOR three 50 羧酸琥珀酰亚胺酯相对于 aquilo PEG SCM，加入至 aquilo PEG RGDS 反应溶液中，在氩气保护下室温孵育过夜，从而实现荧光素的偶联。然后通过在 4 摄氏度条件下使用 3,500 DA 分子量截留值透析盒对纯水透析，纯化 acro oil peg RGD S3 50。以 100:1 的体积比持续透析 48 小时，每天至少更换两次冷透析液。通过0.22微米注射器滤器进行过滤除菌，对产物进一步纯化。最后，在无菌环境中，将无菌的纯化Acro Oil PEG RGD S3 50分装至预先称重的无菌微量离心管中。将开口的微量离心管在无菌透气管内密封。将样品冷冻干燥，并用石蜡膜密封后于零下20摄氏度保存。用100%甲醇预清洗载玻片，并在80摄氏度烘箱中干燥至液体完全蒸发。然后将盛有玻璃载玻片的容器放入通风橱中，向每张载玻片加入250微升Sigma Coat溶液。轻轻晃动载玻片30秒，以使整个表面均匀覆盖。随后，先用100%甲醇彻底冲洗已涂覆的载玻片，再依次用蒸馏水浸泡清洗，每次至少10毫升，每次五分钟，共洗两次。冲洗完毕后，将载玻片静置晾干。通过将硅胶片修剪至与玻璃载片相同尺寸，制备厚度为0.8毫米的硅胶间隔片。然后使用活检打孔器，在硅胶上打出直径10毫米或8毫米的孔，用于容纳支架，并用剃刀片修整。在模具顶部制作约2毫米宽的通道，以便加入支架材料。然后将硅胶间隔片和经sigma涂层处理的玻片进行高压灭菌以实现消毒。同时对用于凝胶浇铸的其他材料（如离心管和镊子）进行灭菌。在组织培养超净台中，使用无菌的1毫升注射器和0.2微米滤器对PEG二丙烯酸酯的储存液进行过滤除菌。首先，在各个独立的棕色微量离心管中，通过将50% PEG二丙烯酸酯与不同体积的无菌60% IO DAL储备溶液、PBS缓冲液以及光引发剂混合，配制每层所需浓度为15%（重量/体积比）的PEG预聚物溶液，最终分别获得含10%、20%、30%和40% IO DAL的溶液。充分混匀各溶液。为制备荧光标记的15% PEG预聚物溶液，将50% PEG二丙烯酸酯与Aquiol PEG-RGD-S3（终浓度为8毫摩尔）以及IO DAL储备溶液、PBS缓冲液和光引发剂在棕色Microview管中混合，最终获得含15%、25%和35% IO DAL的溶液，充分混匀各溶液。接下来，组装模具：将预先裁剪好的间隔片置于两片经sigma co处理的载玻片之间，并用夹具固定。模具组装完成后，开始浇铸分层凝胶：先加入10微升40%的溶液，随后加入10微升荧光标记的35%溶液。重复交替层叠以形成多层结构。接着，用365纳米的光照射模具3分钟。使用便携式UVR 9,000灯，使聚合的水凝胶固化5分钟。然后移除夹子，轻轻抬起顶部的玻璃载片和模具。分层密度梯度。多层聚合或密度梯度聚合物（DG MP）凝胶将保留在载片上。使用无菌刮勺小心地将凝胶从模具中取出，并放入含有无菌 DMEM 的 50 毫升离心管中。用 DMEM 以 1000:1 的体积比洗涤聚合后的凝胶，每天更换缓冲液两次，持续 48 小时。此步骤将去除任何密度剂、修饰剂、光引发剂以及未反应的预聚物。然后将 DGMP 凝胶储存于添加了 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 中。为观察交替层结构，将 DGMP 凝胶沿尺子排列在凝胶成像仪的样品托盘上。随后使用 Alexa 350 进行曝光和成像；DGMP 水凝胶中交替出现的暗色与蓝色条带表明形成了具有不同化学成分的独立层。为准备用于细胞培养的 DGMP 凝胶，将其轻轻插入 48 孔细胞培养板的孔中。使用无菌细胞刮刀，并用细胞培养基冲洗三次。接下来，当 C2C12 成肌细胞在 100 毫米细胞培养皿中达到 60% 汇合度时，收集细胞。为此，用预热的 PBS 清洗培养板三次。然后加入 1 毫升含 EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶溶液，于 37 摄氏度孵育 2 分钟。待细胞脱落后，加入 1 毫升预热的培养基，将细胞转移至 50 毫升锥形管中进行离心。细胞经离心沉淀后，用生长培养基重悬，加入台盼蓝并使用TC 10细胞计数仪计数活细胞。随后将C2C12成肌细胞接种于DGMP支架上，在37°C、5% CO₂条件下培养24小时。通过落射荧光显微镜和相差显微镜观察RGDS修饰的DGMP凝胶层上C2C12成肌细胞的黏附情况。DGMP 凝胶的交替层可能含有多种肽，例如右侧所示的 RGDS，该肽可支持细胞附着和生长。然而，左侧的层不含任何细胞附着肽，因此细胞在该区域无法存活。IO 二醇可影响凝胶的刚性。此处采用原子力显微镜测量了弹性模量。当该凝胶配方中使用30% IAL时，刚度提高了60%。IAL对凝胶刚度的影响可能因所用材料的不同而有所变化。在进行该操作时，需注意各层的顺序：含有最多IEX null的层位于底部，而含有最少IEX null的层则位于顶部。务必始终在最后添加光引发剂，以防止环境光引发聚合反应。我们正与合作者共同改进该技术，以实现三维环境中神经突起生长的有序排列。这将有助于比较来自健康个体和神经发育障碍患者的神经前体细胞。请注意，使用紫外线可能有危险。进行交联步骤时，请佩戴防紫外线护目镜。

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