密度梯度多层聚合（dGMP的）:创建多室的，可定制的一种新技术，组织工程支架

该程序的总体目标是创建多层细胞培养支架。本视频将演示如何制备 2D 细胞培养基质，将粘附肽 RGDS 掺入交替层中，以分离 C 两个 C 12 细胞的区域。这是通过首先将 RGDS 肽拴在 acro 忠诚宏上来实现的。

然后用 LOR 染料标记宏肽组合，以便观察含有多层凝胶的肽层。第二步是从硅片上切下模具，然后将它们夹在两个载玻片之间，混合每层的各个组件。peg di acrl 和 peg di acrl 与 PEG RGDS Alexa three 50 的溶液在模具内交替分层。

凝胶通过紫外线照射聚合。最后一步是将 C 两个 C 12 细胞接种在 2D 多层凝胶上，以检查基质组成如何影响细胞的生长和附着。最终，明场和荧光显微镜用于观察支架上 C 两个 C 12 细胞的选择性生长。

与现有方法相比，该技术的主要优点是，它是一种创建多层 2D 和 3D 细胞培养基质的简单且经济高效的方法。它不依赖于昂贵的仪器。而层之间的界面是连续的，并且在结构上是完整的。

各个层的成分之间没有混合。这种方法可以帮助回答关键问题，例如细胞如何响应模式化的生化和机械线索进行迁移和极化。这种方法可以提供对细胞迁移和分化的温和见解，并且可以应用于其他系统，例如指导神经元干细胞的新右生长和突触发生。

要开始此程序，请在 Argonne 下的干燥 DMSO 中以 1 比 2 比 1 的摩尔比混合 RGDS 肽和 acro 油钉琥珀酰卡博甲酯。然后以相对于 aquilo PEG SCM 的 2 比 1 摩尔比加入 NN 二、丙基甲胺或 D-I-P-E-A，以帮助促进反应，使用发霉的 TOF 质谱法确认 aquilo PEG RGDS 分子的偶联。为此，将 1 微升 AQUILO PEG RGDS 反应溶液和 1 微升未反应性 AQUILO PEG SCM 添加到发霉目标的不同位置。

让它们都晾干。然后在 THF 涡旋中制备通用发霉基质的饱和溶液 1 分钟，并在相同的两个位置添加 1 微升。让它们都晾干。

接下来，加载样本。使用 SAVIS gole 平滑平顶基线减法和 OID 峰值检测算法，使用 60 赫兹激光器以大约 19% 的功率执行发霉的韧性分析。acro PEG RGDS 的分子量应向右移动，对应于共价结合肽引起的质量变化。

下一步是通过加入等摩尔量的 LOR 来偶联 Fluor，相对于溶解在最小体积 DMSO 中的 aquilo PEG SCM 到 aquilo PEG RGDS 反应溶液中，溶解在最小体积的 DMSO 中，在氩气下孵育过夜。然后使用 3， 500 DAU 分子量截留透析盒在 4 摄氏度下对染料水透析，纯化 acro 油钉 RGD S3 50。使用 1001 体积比继续透析 48 小时，每天至少更换两次冷透析液。

该产品通过 0.22 微米针式过滤器通过过滤器灭菌进一步纯化。最后，在无菌环境中，将无菌纯化的 acro 油钉 RGD S3 50 分装到无菌预加重微量离心管中。将打开的微量离心管密封在无菌通气管内。

冻干样品，并在零下 20 摄氏度下用石蜡膜密封储存。在 100% 甲醇中预洗玻片，并在 80 摄氏度的烘箱中干燥，直到液体蒸发。然后将装有载玻片的培养皿放入通风橱中，并向每张载玻片中加入 250 微升 sigma 涂层。

轻轻摇动载玻片 30 秒，以覆盖整个表面。接下来，用 100% 甲醇彻底冲洗包被的载玻片，然后用洗涤和蒸馏水，在至少 10 毫升水中浸泡两次，每次 5 分钟。冲洗后，让载玻片风干。

通过将一块硅胶修剪成与载玻片相同的尺寸来准备 0.8 毫米厚的硅胶空间。然后使用活检打孔器，在硅胶上打 10 毫米或 8 毫米的孔，以使用剃须刀片固定支架。在模具顶部制作大约两个毫米的通道，以允许添加脚手架材料。

然后对硅胶空间和 sigma 涂层处理的载玻片进行高压灭菌。还要对用于灌注凝胶的其他材料进行消毒，例如嵌管和镊子。在组织培养通风橱过滤器中，使用无菌的 1 毫升注射器和 0.2 微米过滤器对 Peg di aquil 的储备溶液进行消毒。

首先，通过将 50%PEG D acrl 与不同量的无菌 60%IO DAL 储备溶液 PBS 和光引发剂混合，为单个琥珀色微型垃圾管中的每一层配制 15% 重量体积比的 PEG 预聚物溶液，以产生不同最终浓度的 10%20%、30% 和 40%I oal，充分混合溶液以制备荧光标记的 15%PEG 预聚物溶液， 将终浓度为 8 毫摩尔的 50%PEG di aquil 和 aquilo PEG RGD S3 50 与 IO Dal 储备溶液 PBS 和琥珀色显微管中的光引发剂混合，得到浓度为 15%、25% 和 35%IO IAL 的溶液，充分混合溶液。接下来，通过在两个 sigma co 处理的载玻片之间放置预切垫片来组装模具，并用夹子固定。组装模具后，先加入 10 微升 40% 溶液，然后加入 10 微升荧光标记的 35% 溶液，形成分层凝胶。

重复交替分层以获得多个图层。接下来，用 365 纳米光照射模具三分钟。使用便携式 UVR 9， 000 灯，让聚合水凝胶固化 5 分钟。

然后取下夹具，轻轻提起顶部载玻片和模具。分层密度梯度。多层聚合或 DG MP 凝胶将保留在载玻片上。

使用无菌刮刀，小心地从模具中取出凝胶，并将其放入含有无菌 DMEM 的 50 毫升试管中。使用 1000：1 体积比的 DMEM 洗涤聚合凝胶 48 小时，每天更换两次缓冲液。这将去除任何密度、改性剂、光引发剂和 react 预聚合物。

然后将 DGMP 凝胶储存在补充有 1% 青霉素链霉素的 DMEM 中。为了观察交替层，请沿着凝胶成像装置样品盘上的尺子排列 DGMP 凝胶。然后使用 Alexa 对凝胶进行曝光和成像，DGMP 水凝胶中的三个 50 条交替的深色和蓝色条带展示了不同化学成分的离散层的形成。

要制备用于细胞培养的 DGMP 凝胶，请将其轻轻插入 48 孔细胞培养板的孔中。使用无菌细胞刮刀并在细胞培养基中冲洗 3 次。接下来，当 C 12 细胞培养板达到 60% 汇合时，从 100 毫米细胞培养板中收获两个 C 12 成肌细胞。

为此，请用预热的 PBS 冲洗板 3 次。然后加入 1 毫升 0.25% 的 EDTA 溶液，并在 37 摄氏度下孵育板 2 分钟。细胞分离后，加入 1 mL 预热培养基，将细胞转移到 50 mL 锥形管中进行离心。

沉淀后，将 Reeses 细胞沉淀后，将它们置于生长培养基中，并通过添加 triam blue 并使用 TC 10 细胞计数器对活细胞进行计数。然后用 C 两个 C 12 成肌细胞接种 DG MP 支架，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育 24 小时。使用落射荧光和相差显微镜确认 C 两个 C 12 成肌细胞附着在含有 DGMP 凝胶层的 RGDS 上。

DGMP 凝胶的交替层可能含有各种肽，例如右图所示的 RGDS，它支持细胞附着和生长。然而，左侧的层不包含任何细胞附着肽，细胞无法在该区域存活。IO 二醇会影响凝胶的硬度。

在这里，使用原子力显微镜测量弹性模量。在该凝胶配方中使用 60% IAL 时，刚度增加了 30%，IAL 对凝胶刚度的影响可能因所使用的材料而异在尝试此程序时，重要的是要记住层的顺序。包含最高 IEX null 值的图层将位于底部，而 IEX null 值最少的图层将位于顶部。

永远记住在最后添加光引发剂，以防止环境光聚合。我们与合作者一起，正在采用这种技术来组织 3D 神经突生长。这将允许比较来自健康个体和神经发育障碍患者的神经祖细胞。

不要忘记，在紫外线下工作可能很危险。进行交联步骤时佩戴紫外线防护眼镜。