龙工程的程序

该程序的总体目标是在培养物中产生在形态和生理学上与天然肺组织相当的肺组织。这是通过首先从成年大鼠身上采集心脏和肺来实现的。下一步是插管肺动脉和气管，并将插管的肺连接到生物反应器进行脱细胞。

脱细胞和冲洗后，将肺转移到无菌培养生物反应器中，并准备就位。该程序的最后一步是用准备好的细胞群接种所需的肺室。最终，可以获得结果，显示通过免疫荧光显微镜检查，脱细胞的细胞外基质有效地重新填充了表达区域特异性肺标志物的细胞。

与现有的体外培养肺细胞方法相比，该技术的主要优点是细胞可以长时间保持分化的表型，因此可以在三维生物衍生底物中研究数周。对于脱细胞，肺通过血管套管连接到生物反应器盖，而盖连接到脱细胞装置。肺上方的玻璃瓶由环架和连接的夹子固定到位。

此时，可以去除细胞材料以产生细胞外基质支架，该支架可以重新填充细胞材料。用于工程肺组织接种和培养的生物反应器的组装如图所示。气管插管的诱饵锁连接器连接到气管储液器和主腔之间的呼吸环。

呼吸回路包括两个单向阀。使介质沿着不同的路径进出肺部。一个小储液器暂时掺入灌注管线中，用于接种内皮细胞。

脉动泵用于将细胞从储液器输送到肺的血管隔室。使用滚轮泵提供血管灌注。培养基通过连接的套管灌注到肺动脉中，流经肺血管系统，然后通过肺静脉直接进入主生物反应器，在那里吸入培养基进行灌注。

肺上皮通过注射固定在呼吸回路中。包含肺和气管储液器的主腔用于长期肺培养。当肺被拔出并且动脉和气管被正确插管时，新鲜提取的肺应该保持空气而不会泄漏。

这可以通过在浸没在液体中时用空气充气来验证。不应有任何气泡表明漏气。为了开始该方案，用含有硝基压制钠的 PBS 向肺部充气，直到肺部充满但不过度充气，立即盖上气管插管，使肺部保持充气。

接下来，用 PBS 和 SNP 灌注肺部，在 15 毫米汞柱中至少 15 分钟。之后，从气管插管上取下塞子，让肺放气。如有必要，继续用 PBS 和 SNP 灌注 15 至 30 分钟。

重新填充 PBS 和 SNP，以确保将大量压力保持在 10 至 15 毫米汞柱。为了开始长时间脱细胞的程序，将生物反应器盖连接到脱细胞装置。然后将肺连接到盖子上。

使用与 YS 形套管相连的诱饵锁连接，肺动脉套管应连接到灌注管，气管插管应自由漂浮。为了确保组织完全脱细胞，将空气排除在系统之外至关重要。动脉插管和气管插管中的单向阀通过启用管道中的逆流来帮助清除管道中的气泡。

因此，允许通过注射器去除气泡，确保所有管路都没有空气。用脱细胞溶液开始灌注。用脱细胞溶液灌注。

在 500 毫升溶液通过肺部灌注之前，最佳压力是小于 15 毫米汞柱。这通常需要 2.5 小时。流速最初通常非常缓慢，并在第二个小时内迅速增加到大约 1 mL/min 或更高。

在定期清除灌注期间，使用生物反应器中的脱细胞液，同时确保剩余足够的液体来支持肺和气管插管。当脱细胞液完全灌注后，将肺和生物反应器转移到组织培养罩中。要开始器官冲洗，请取出装有脱细胞液的 500 毫升罐，并将其更换为含有最多 1 升无菌 PBS 的无菌罐。

使用真空抽吸或注射器确保管路中没有空气，以相同的方式将 PBS 灌注通过 10 至 15 毫米汞柱的脉管系统。至于脱细胞，使用无菌技术定期从生物反应器中取出废 PBS，然后更换或重新填充 PBS 罐。使用新鲜的无菌 PBS 继续冲洗，直到至少 2.5 升无菌 PBS 灌注肺部。

脱细胞过程开始，冲洗完成后，通常需要两天时间。将肺转移到包含新鲜 PBS 加 10% FBS 和 10% Pen 链球菌的新型无菌生物反应器系统中，确保整个灌注回路和整个气道管路都充满液体。从这里开始，将使用脉动泵以每分钟 5 毫米的速度灌注肺部。

通过用含有 10% FBS 和 10% 青霉素链霉素的 PBS 灌注过夜来消毒肺细胞外基质支架。完成此步骤后，将肺转移到 37 摄氏度的培养箱中 1 小时或直到温度达到平衡。为了准备使用 Ben Nase 治疗，下一步是用 Ben Nase 治疗肺部。

要去除每个肺的残留 DNA，首先将一个 10 毫升注射器仅填充 Prewarm Ben Nase 缓冲液，并用一个 10 毫升注射器填充每毫升 90 单位。在 Ben Nase 缓冲液中稀释的 Ben Nase。停止肺部灌注。

然后用 Ben Nase 缓冲液给气道充气，同时避免将空气注入肺部。让肺放气一分钟。然后用 Ben Nase 溶液给肺充气。

同样，小心不要在用 Ben Nase 充气后将空气引入肺部。让肺部在 37 摄氏度下静置一小时，无需灌注或通气。在一小时结束时，恢复用 PBS 加 10% FBS、10% 青霉素链霉素灌注（已在生物反应器中），并在第二天继续灌注过夜。

冲洗和灭菌后，可以制备长细胞外基质支架用于细胞重新繁殖。用 250 毫升培养物替换 P-B-S-F-B-S 苯并 A 溶液。在引入细胞之前，将培养基灌注至少一小时，并在接种细胞之前直接更换为新鲜培养基。

许多细胞来源可用于器官退缩。在这里，将演示具有上皮细胞群的座位。首先，准备一个注射器，其中包含 15 毫升所需上皮细胞群的细胞悬液。

接下来，用 80 毫升培养基填充气道储液器，并确保所有通风管线都没有空气。然后将生物反应器置于 37 摄氏度的组织培养箱中，并连接注射泵进行通气。通过将 15 毫升细胞悬液注射到气管插管中，使用单次快速推注将细胞接种到肺部。

确保主生物反应器上的空气过滤器已盖上。然后立即开始一次缓慢呼吸，使用注射泵以每分钟 3 毫升的速度从主生物反应器中抽出 60 毫升空气。这将持续大约 20 分钟。

A 之后让肺静置约 18 小时。以大约 0.5 mL/min 的速度开始缓慢的血管灌注。在器官培养过程中，通常以每分钟 1 至 3 毫升的速度进行灌注。

在上皮培养过程中使用滚轮泵，通常以每分钟 1 次呼吸的连续频率和 5 至 10 毫升的潮气量提供通气。使用注射泵，空气被循环抽出并注入生物反应器，通过在主腔内的负压和大气压之间交替来影响呼吸。由于通风时需要保持生物反应器的气密性，因此应每天暂停通风，并应交换主室中的空气。

此外，培养基应大约每 3 到 4 天更换一次。在培养过程中，每次应通过培养肺上皮和血管内皮来交换大约一半的总体积。在安装在生物反应器上的支架内，我们能够产生能够在短时间内参与气体交换的肺组织。

此处显示了天然大鼠肺的标准血红蛋白、toin 和 eoin 染色，以便与脱细胞大鼠肺的 H 和 e 染色进行比较。最终脱细胞的细胞外基质应完全不含细胞物质，并保留天然肺的大体、微观和超微结构特征。h 和 e 染色剂将能够可视化任何残留的 DNA，这些 DNA 由于脱细胞不充分或冲洗细胞接种和随后的肺培养的最佳条件

生物反应器应在肺的所有五个肺叶内产生分布均匀的细胞，并应覆盖大约 70% 的细胞外基质支架。这些图像比较了免疫荧光染色的天然肺和重新填充的肺。对于关键的肺标志物，培养的细胞群对 Clara 细胞分泌蛋白 pro 分泌蛋白 C 和水通道蛋白 5 呈阳性。

在所有检测组合中，感兴趣的标记物以红色显示，DAPI 染色的细胞核以蓝色显示。一旦掌握了从脱细胞到消退的这个程序，如果执行得当，可以在 4 到 5 天内完成。