Name: 龙工程的程序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: 学习利用脱细胞肺细胞外基质和生物反应器生成功能性肺组织的方法。该技术可在体内移植后实现有效气体交换，为再生医学和肺部疾病研究提供新途径。

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感谢 Maegan B. Colehour 在生物反应器开发方面的帮助。本研究由耶鲁大学麻醉学系和美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 HL 098220（资助对象：L.E.N.）提供经费支持。T.H.P. 获 NIH T32 GM007171 奖学金支持。

1. 生物反应器组装
 分别在图1和图2中提供了用于脱细胞和培养的生物反应器设计与组装的详细示意图。所有组件在组装生物反应器之前必须进行灭菌。请注意以下具体事项：
连接：
<ol>
 <li>动脉插管由一个鲁尔锁接头通过一段短管连接至Y形分流器构成。鲁尔锁接头连接灌注管路，而Y形接头中未缝合至肺动脉的分支则连接一个单向阀。单向阀的方向设置为允许液体被吸入管路中（与灌注方向相反），而在器官灌注期间，所有培养基均流向肺脏。</li>
 <li>气管插管同样由一个鲁尔锁接头通过管路连接至Y形分流器构成。鲁尔锁接头连接气管储液罐与主腔室之间的呼吸回路。Y形接头中未缝合至气管的分支也连接一个单向阀，该单向阀的朝向与动脉插管中的单向阀相同。</li>
</ol>
功能：
<ol start="3">
 <li>通过动脉和气管插管中的单向阀，可使管路中的液体反向流动，从而清除管路中的气泡。</li>
 <li>“呼吸回路”包含两个单向阀，其位置设计使得灌注液进出肺部时沿不同路径流动。本实验室先前发表的一篇文章中对此功能有更详细的描述2。</li>
 <li>血管灌注采用滚压泵提供动力。灌注液通过连接的插管进入肺动脉，流经肺部血管系统，从肺静脉直接流出至主生物反应器，再由此处将液体抽出进行循环灌注。</li>
</ol>
2. 器官收获
<ol>
 <li>根据美国兽医医学协会（AVMA）制定的指南，通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（60 mg/kg）处死成年（3-6月龄）Fischer 344大鼠。注意：戊巴比妥钠溶液中含肝素（100单位/ml），用于抗凝。</li>
 <li>用70%乙醇喷洒或擦拭胸部和腹部。</li>
 <li>打开胸腔，暴露心脏和肺，注意避免损伤肺组织。小心地在膈肌上开一个小窗进入胸腔，使肺回缩，然后将切口水平扩大以暴露肺基底部。沿肋骨做两条垂直切口，并牵开胸廓以充分暴露心脏和肺。</li>
 <li>准备重力灌注系统，例如使用去掉活塞的注射器、三通旋塞和约20 cm长的导管，末端连接一根1.5英寸、21号针头。将注射器固定在铁架台上，使其位于动物体表上方约20 cm处。确保灌注管路中无任何气泡。</li>
 <li>剪开右心房以排出血液，防止血液回流至肺部。剪开左心房可能有助于肺内血液和灌注液的排出，但并非必需。</li>
 <li>将针头插入右心室底部，打开旋塞，通过PBS溶液灌注肺部，该溶液含肝素（50 U/ml）和硝普钠（1 μg/ml）。确认肺动脉被灌注液充满，且肺内血液已被清除。必要时，向灌注注射器中补充液体。通常仅需约10 ml。</li>
 <li>持续灌注直至肺组织无血，然后停止灌注。</li>
 <li>游离气管，尽可能向上分离至颈部。确保气管与食管完全分离。彻底切断心脏、肺和气管的所有残留连接，整块取出组织。</li>
 <li>使用手术刀或锐利剪刀切除心尖部分，暴露右心室和左心室。</li>
 <li>通过右心室插管至肺动脉干，并缝合固定。去除多余的左心室组织。</li>
 <li>对气管进行插管并缝合固定。确保气管和肺动脉插管的位置不会对气管、肺或大血管造成扭转应力（图1）。</li>
 <li>确保动脉插管内无气泡，因为系统中滞留的气泡可能阻碍器官内的稳定灌注流。在某些情况下，一个气泡即可完全阻断液体流动。为此，可将心肺组织块放入盛有PBS的容器中，使用带针头的注射器向心脏插管内注入少量PBS，以排出所有气泡。</li>
 <li>用PBS冲洗气道4-5次，尽可能清除肺内的空气。</li>
 <li>完成冲洗后，用含硝普钠（SNP，1 μg/ml）的PBS溶液充盈肺部。在气管插管上安装塞子，使溶液保留在肺内。让肺在该溶液通过肺动脉持续灌注的情况下孵育最多30分钟，以实现血管舒张。</li>
 <li>使用鲁尔锁接头将心肺组织连接至生物反应器盖，该接头连接前述“生物反应器组装”部分所述的Y型插管（图1）。</li>
</ol>
3. 器官脱细胞
<ol>
 <li>将连接有肺组织的帽状接头与脱细胞装置相连（见图1）。肺动脉套管应连接至灌注管路，气管套管则应保持悬空状态。确保所有管路中无气泡残留。如上所述，管路中的空气可能导致脱细胞液流动受阻，从而影响脱细胞效果。系统中残留的气泡还可能持续存在于后续培养阶段，对细胞存活产生不利影响3。</li>
 <li>用PBS/SNP溶液充盈肺组织，直至肺完全膨胀但不过度充气。立即封闭气管套管，以维持肺的膨胀状态。</li>
 <li>在约15 mmHg（20 cm H2O压力）条件下，用PBS/SNP持续灌注至少15分钟。15分钟或更长时间后，移除气管套管上的塞子，使肺组织自然放气。</li>
 <li>继续使用PBS/SNP灌注30分钟。如有需要，补充PBS/SNP以确保灌注压力维持在10–15 mmHg。</li>
 <li>开始使用脱细胞溶液（含8 mM CHAPS、1 M NaCl、25 mM EDTA的1×PBS溶液）进行灌注。务必确保所有管路中无气泡。可使用真空系统辅助提供吸力。</li>
</ol>
灌注脱细胞溶液，直至肺组织中已通过500 ml溶液。最佳压力为 &lt;15 mmHg（约20 cm H₂O）2O）。此过程通常需要2.5小时。初始流速通常非常缓慢（0.2–0.5 ml/分钟），在第二小时期间迅速增加至约1 ml/分钟或更高。定期从生物反应器中移除已使用的脱细胞液体，同时确保保留足够的液体以支撑肺和气管插管。
 4. 器官冲洗与灭菌
<ol>
 <li>将肺脏和生物反应器转移至组织培养超净台中。通过移除装有脱细胞液的500 ml广口瓶，并替换为一个含有最多1 L无菌PBS的无菌广口瓶，开始用无菌PBS冲洗。使用真空抽吸确保管路中无空气残留。</li>
 <li>以与脱细胞过程相同的方式，通过血管系统以10–15 mmHg的压力灌注PBS。定期从生物反应器中移除废液PBS，并更换或补充新鲜无菌PBS。建议采用无菌操作技术。</li>
 <li>持续冲洗，直至至少有2.5 L的无菌PBS流经肺脏。</li>
 <li>将肺脏转移至一个新的无菌生物反应器系统中，该系统内含有新鲜PBS。确保整个灌注回路和全部气道管路均充满液体。后续所有步骤均使用脉动泵以5 ml/min的流速对肺脏进行灌注。</li>
 <li>对支架进行灭菌处理，可选择以下两种方法之一：使用含10% FBS和10%青霉素-链霉素溶液的PBS持续灌注过夜，或使用含0.1%过氧乙酸的PBS灌注3小时。若采用后者，需在数小时内用250 ml PBS更换三次以彻底清除残留酸液。每次冲洗时，应同时对肺脏进行通气和灌注，以确保组织各部分均被充分冲洗。</li>
 <li>将肺脏转移至37°C培养箱中，并用含10% FBS和10%青霉素/链霉素的PBS灌注约1小时，或直至温度达到平衡，为后续苯并核酸酶（benzonase）处理做准备。</li>
 <li>使用苯并核酸酶处理肺脏以去除残留DNA：
 <ol>
 <li>将苯并核酸酶缓冲液（见试剂表）预热至37°C。</li>
 <li>每个肺脏准备一支10 ml注射器装满苯并核酸酶缓冲液，另准备一支10 ml注射器装入含90 U/ml苯并核酸酶的缓冲液。</li>
 <li>停止肺脏灌注。</li>
 <li>用苯并核酸酶缓冲液充气扩张气道。</li>
 <li>让肺脏自然回缩约1分钟，然后用苯并核酸酶溶液再次充气扩张。在使用苯并核酸酶缓冲液和苯并核酸酶溶液进行充气时，应尽量避免向肺内注入空气。</li>
 <li>充气后，在37°C条件下静置肺脏1小时，期间不进行灌注或通气。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>恢复使用生物反应器中已有的含10% FBS和10%青霉素/链霉素的PBS进行灌注，并持续过夜。次日，肺脏可选择在4°C下保存（最长3个月），或进入细胞接种准备阶段。</li>
 <li>为进行细胞重植，将PBS/FBS/苯并核酸酶溶液替换为约250 ml培养基。在接种细胞前至少灌注1小时，并在细胞接种前直接更换为新鲜培养基。</li>
</ol>
5. 再细胞化
用于器官重接种的细胞来源由研究者自行选择。可选用多种细胞来源，包括商业化的细胞群体、 freshly isolated neonatal or fetal pulmonary cells、胚胎干细胞或商业化的细胞来源。这些细胞群体的具体分离方案可参见其他文献4,5,6。本文将提供如何接种内皮细胞和上皮细胞群体的操作说明。
 内皮细胞接种：
<ol>
 <li>用适当的培养基制备所需内皮细胞群体的悬浮液。通过40 µm细胞筛过滤细胞悬液，以去除细胞团块。在本实验室中，典型的内皮细胞接种通常使用约3000万个人鼠肺微血管内皮细胞悬浮于60 mL培养基中。</li>
 <li>将细胞悬液加入生物反应器灌注回路中临时连接的小型储液器中（图2）。确保从此储液器引出的管路及整个灌注回路中无气泡存在。</li>
 <li>使用滚压泵以3 mL/min的速度将细胞经肺动脉注入。</li>
 <li>细胞注入后，继续从生物反应器主系统以设定速率循环培养基进行灌注。</li>
 <li>每日检查灌注管路，确保无气泡残留。</li>
 <li>应定期更换新鲜培养基，通常每3–4天更换一次。</li>
</ol>
上皮细胞接种：
<ol>
 <li>制备所需上皮细胞群体的细胞悬液。在本实验室中，通常使用约5000万至1亿个新生大鼠肺细胞。将细胞悬液通过40 µm细胞筛过滤，并悬浮于15 ml培养基中，装入注射器。向气道储液器中加入80 ml培养基。</li>
 <li>将生物反应器置于37°C组织培养孵育箱中，并连接用于通气的注射泵。确保所有通气管路中无气泡。
 <ol>
 <li>通过向气管插管内一次性注入15 ml细胞悬液，将细胞接种至肺组织中。</li>
 <li>立即使用注射泵开始一次缓慢的单次呼吸过程。该呼吸过程以3 ml/分钟的速度从主生物反应器中抽出60 ml空气，持续约20分钟。在注入细胞悬液后、开始缓慢呼吸前，应立即封闭主生物反应器上的空气滤器。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>让肺组织静态静置约18小时，然后开始缓慢的血管灌注（约0.5 ml/min）。</li>
</ol>
6. 器官培养
尽管灌注和通气的细节会因实验设计而异，但需注意以下几点：
<ol>
 <li>在内皮细胞培养过程中，通常使用蠕动泵以 1-3 ml/min 的流速进行灌注。在上皮细胞培养过程中，通常使用注射泵以每分钟 1 次呼吸的恒定速率提供通气。通常需要从主生物反应器中抽出 5-10 ml 空气，以实现肺组织在正常潮气量下的通气。由于在通气期间需保持生物反应器密闭，应每日暂停通气一次，并更换主腔室内的空气。系统中所有空气均为室空气，其氧分压约为 21%。从生物反应器中抽出 5-10 ml 空气（可诱导肺组织吸入等体积的培养基）的设定，取决于肺的大小以及正在进行培养的肺叶数量（部分肺叶可结扎用于分析，其余肺叶继续培养）。注射泵抽取空气的体积应选择为接近培养肺组织的“潮气量”。</li>
 <li>在培养期间，培养基应大约每 3-4 天更换一次。</li>
 <li>在上皮与内皮共培养过程中，本实验室的实验通常首先接种上皮细胞并培养 4-8 天，在此期间对工程化组织进行通气。随后通过灌注方式接种内皮细胞，之后组织同时进行灌注和通气。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
脱细胞化
当操作正确时，新提取的肺组织应能保持空气而不发生泄漏。可通过在液体中将其充气来检测这一特性——不应观察到表明漏气的气泡。随后的脱细胞过程应在37°C条件下持续2.5至3小时，使约500 ml脱细胞液流经肺组织，最终在冲洗结束时，在约15 mm Hg的静水压力下，磷酸盐缓冲液（PBS）应能以约10 ml/min的速度流经肺组织。经0.1%过氧乙酸和苯并酸酶处理后，肺组织可在4°C下保存长达3个月，仍适用于再细胞化。
最终的脱细胞化细胞外基质应完全去除细胞成分，并保留天然肺组织的大体、显微及超微结构特征。脱细胞化或冲洗不充分可能导致残留DNA“粘附”在支架上，可通过标准苏木精-伊红染色观察到（参见图3进行对比）。
脱细胞基质的再细胞化与肺组织培养
若细胞系自出生7天的新生大鼠幼崽中 freshly isolated，具体方法如Petersen及其同事所发表研究的在线补充材料所述4每窝10只幼崽可获得约1.2亿至1.5亿个细胞（每只新生幼崽略多于1000万个细胞）。
在生物反应器中进行肺组织细胞接种及后续培养的最佳条件应使细胞均匀分布于肺的全部5个肺叶内，并实现对约70%细胞外基质支架的覆盖（图3）。培养后的细胞群体应表达关键的呼吸系统细胞标志物，按相对丰度排序依次为前分泌性表面活性蛋白C（SPC）、克拉拉细胞分泌蛋白（CCSP）和水通道蛋白5（AQP）（图4）。


<img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig1.jpg" alt="肺灌注系统；示意图；心肺装置；血管插管；液体循环方法。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 插管位置与脱细胞生物反应器

<img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig2.jpg" alt="带有注射泵和呼吸循环装置的肺上皮血管灌注系统示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 用于工程化肺组织接种与培养的生物反应器

<img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig3.jpg" alt="组织学示意图；肺组织分析，染色切片A-D；细胞结构比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 天然肺、脱细胞肺及再细胞化肺的组织学

<img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig4.jpg" alt="使用CCSP、SP-C、AQP标记物对天然与再细胞化肺组织进行荧光显微镜比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 关键肺部标志物的免疫荧光染色

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</ol>

L.E.N. 持有再生医学公司 Humacyte 的股份。Humacyte 未资助本研究，也未影响所描述的任何实验或方法的设计、解释或报告。作者（L.E.N.、T.H.P.、E.A.C.）及耶鲁大学已就肺组织工程相关技术提交了专利申请。

本系统最关键的方面包括维持无菌状态，以及在整个支架制备、细胞接种和再细胞化肺培养过程中，对施加于血管床的压力进行密切监测。为最大限度维持无菌，建议在使用前对所有材料进行高压灭菌，并在肺脏离体后尽快将其安装至封闭系统中，避免此后破坏该屏障。脱细胞基质经充分冲洗并转移至无菌生物反应器进行培养后，不应扰动或拆除硅胶帽及其他密封件和连接部件。为控制压力，尽可能优先采用重力驱动的液体流动。当需要使用泵进行液体循环（从PBS冲洗后开始并持续至培养阶段）时，建议使用压力传感器直接测量液体进入肺动脉前的压力，施加压力的幅度不得超过15 mm Hg。
再细胞化的肺脏可培养不同时间，通常为4天至最长3周。内皮细胞培养期间，血管灌注通常以1-3 ml/min的流速进行，而上皮细胞培养期间通气通常以每分钟1次呼吸的频率进行。在联合培养期间，可同时进行通气和灌注。通气可使用液体培养基或空气进行。
在过去的几十年中，多个研究团队在组织工程领域开展了重要工作，证明了肺上皮分化的可行性 体外 以及复制肺部微解剖结构的多个方面7,8,9,10。然而，直到最近，4,5 这些肺组织工程的尝试均未成功制造出可植入的器官，该器官需能够维持血液与气道腔室之间的分离，并参与气体交换。因此，尽管文中所述方法仅是实现生成功能性肺组织这一长期目标的初步步骤，但这项工作为增加可用于移植的肺组织数量带来了令人鼓舞的进展。此外，本研究进一步拓展了Ott先前的研究工作。 等 和 Uygun 及其同事11,12，证明了脱细胞细胞外基质作为组织工程中构建复杂三维结构支架的有效性，并可支持多种类型细胞的生长与存活。该研究对于呼吸系统细胞与分子生物学领域的研究工具库亦具有重要意义。通过提供一种独特的三维环境，不仅能够施加适当的机械刺激，而且避免了在实验室中采用传统方法培养啮齿类上皮细胞时常见的快速去分化风险。13科学家可利用我们的系统，深入理解在细胞分化和功能中起作用的细胞间及细胞-基质相互作用。若将这一知识作为引导多种干细胞群体命运的杠杆，其潜力可能尤为显著，正如Cortiella团队在初步研究中所证实的那样。14.

<table><tbody><tr><td colspan="4">安乐死</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>硝普钠</td><td>Fluka</td><td>71778</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol 安乐死溶液</td><td>Virbac Animal Health</td><td>710101</td><td>390 mg/ml 戊巴比妥钠储备液应适当稀释后用于腹腔注射</td></tr><tr><td colspan="4">脱细胞溶液</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>JT Baker</td><td>3722-01</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">生物反应器组件</td></tr><tr><td>480 ml 玻璃瓶</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-3460560</td><td></td></tr><tr><td>硅胶塞，14号</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06298-26</td><td></td></tr><tr><td>Y型连接器</td><td>Cole-Parmer</td><td>ED-30614-08</td><td>用于动脉和气管插管</td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>Masterflex (Cole Palmer)</td><td>96420-14; 16</td><td>L/S 14; 16</td></tr><tr><td>压力传感器</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>PX-212</td><td></td></tr><tr><td>单向阀</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-98553-20</td><td>单向阀</td></tr><tr><td>四通旋塞阀</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>594WSC</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Cole-Parmer</td><td>2915-08</td><td>PTFE，0.2&amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td colspan="4">脱细胞及冲洗装置（生物反应器附加组件）</td></tr><tr><td>500 和 1000 ml 玻璃瓶</td><td>Corning</td><td>1395-500; -1L</td><td>用于重力驱动的脱细胞和冲洗过程</td></tr><tr><td colspan="4">苯并核酸酶处理</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB14043</td><td>1M，pH 8.0</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>JT Baker</td><td>2444-01</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>苯并核酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>内切核酸酶，用于去除基质中残留的DNA</td></tr></tbody></table>

肺组织工程操作步骤

Procedure for Lung Engineering

肺组织相关疾病，包括肺癌和慢性阻塞性肺疾病等慢性肺部疾病，每年累计导致约28万人死亡；其中慢性阻塞性肺疾病目前是美国第四大死因1导致这种高死亡率的原因之一在于，肺部通常无法在微观细胞水平以上进行修复或再生。因此，因退行性病变或感染而受损的肺组织，以及经手术切除的肺组织，均无法实现功能性的替代。 体内探索肺组织是否能够被生成 体外我们采用一种去除细胞成分的方法处理成年大鼠的肺组织，制备出无细胞的肺细胞外基质支架。该支架保留了支气管和血管系统的分级分支结构，以及基本完整的基底膜，后者主要由IV型胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白组成。将该支架安装于一种生物反应器中，该反应器可模拟肺生理的关键特征，如负压通气和脉动性血管灌注。通过在生物反应器支撑的支架内培养肺上皮细胞和血管内皮细胞，我们能够生成在表型上与天然肺组织相似的肺组织，并可在短时间内（45–120分钟）实现气体交换。这些结果令人鼓舞，表明肺基质再细胞化是肺再生的一种可行策略。这一可能性不仅为增加可用于移植的肺组织供应提供了新途径，也为呼吸系统细胞与分子生物学的研究创造了条件 体外 比以往更长的时间段内，以更精确的微环境条件进行研究。

我们开发了一种去细胞化肺细胞外基质以及新型仿生生物反应器，可用于生成具有功能的肺组织。通过将细胞接种至基质中并在生物反应器中进行培养，所生成的组织在体内移植后短期内即表现出有效的气体交换功能。

肺组织，包括肺癌和慢性阻塞性肺疾病等慢性肺部疾病，累计导致约28万人死亡……

本实验的总体目标是体外培养出在形态学和生理学特性上均与天然肺组织相似的肺组织。首先从成年大鼠体内取出心脏和肺组织，然后对肺动脉和气管进行插管，并将插管后的肺连接至生物反应器以进行脱细胞处理。脱细胞并冲洗后，将肺组织转移至无菌培养生物反应器中，并准备进行细胞接种。该操作的最后一步是将已准备好的细胞群体接种至肺组织的特定区域。最终可通过免疫荧光显微镜观察结果，显示脱细胞后的细胞外基质被高效地重新定植，且细胞表达出具有区域特异性的肺部标志物。与现有的体外培养肺细胞方法相比，该技术的主要优势在于细胞能够在三维生物来源的基质中长时间维持其分化表型，因此可对其进行长达数周的研究。进行脱细胞处理时，通过血管插管将肺连接至生物反应器盖，再将盖子连接至脱细胞装置。肺上方的玻璃瓶由铁架台及所连接的夹具固定位置。此时，可去除细胞成分以制备细胞外基质支架，该支架可重新接种细胞材料。本图展示了用于工程化肺组织接种与培养的生物反应器组装示意图。气管插管的鲁尔锁接头连接于气管储液槽与主腔室之间的呼吸回路。呼吸回路包含两个单向阀，其位置设计使得培养基进出肺部时沿不同路径流动。在灌注管路中临时加入一个小的储液器，用于内皮细胞的接种。使用脉动泵将细胞从储液器输送至肺部的血管腔室。血管灌注采用滚压泵实现。培养基通过连接的插管灌注进入肺动脉，流经肺部血管系统，再从肺静脉直接流入主生物反应器，随后培养基由此被抽出进行循环灌注。通过在呼吸回路中注射使肺上皮就位。主腔室包含肺和气管储液器，用于肺的长期培养。当肺组织被取出且动脉和气管正确插管后，新鲜提取的肺应能保持空气而不泄漏。可通过将肺组织浸没在液体中并充气来验证其完整性，不应出现表明漏气的气泡。开始实验方案时，用含有硝普钠的 PBS 缓冲液对肺组织进行灌注，直至肺完全膨胀但未过度膨胀，立即封闭气管插管，使肺保持膨胀状态。接下来，用 PBS 和 SNP 在 15 毫米汞柱压力下灌注肺脏至少 15 分钟。随后，取下气管插管上的塞子，使肺脏自然萎陷。如有必要，继续用 PBS 和 SNP 灌注 15 至 30 分钟。补充 PBS 和 SNP，以确保灌注压力维持在 10 至 15 毫米汞柱。开始长时间脱细胞操作时，将生物反应器盖连接至脱细胞装置，然后将肺连接到盖子上。利用与Y形套管相连的诱捕锁扣，肺动脉套管应连接至灌注管路，而气管套管应保持悬空。为确保组织完全脱细胞，关键是要防止空气进入系统。动脉和气管套管中的单向阀可通过允许管路内液体反向流动，帮助清除管路中的气泡。因此，通过注射器排出气泡，确保所有管路中无残留空气。开始灌注脱细胞溶液。使用脱细胞溶液进行灌注。当灌注通过肺部的溶液体积达到 500 毫升时，理想压力应低于 15 毫米汞柱。此过程通常需要 2.5 小时。流速在最初通常非常缓慢，并在第二小时内迅速增加至约 1 毫升/分钟或更高。在灌注过程中，需定期取出生物反应器中的脱细胞液，同时确保留有足够的液体以支撑肺和气管插管。当脱细胞液灌注完成后，将肺和生物反应器转移至组织培养超净台。开始器官冲洗时，取下装有脱细胞液的500毫升广口瓶，更换为一个无菌的、最多可盛装一升无菌PBS的无菌广口瓶。使用真空抽吸或注射器确保管路中无气泡，以10至15毫米汞柱的压力通过血管系统灌注PBS。在脱细胞过程中，采用无菌技术定期从生物反应器中移除废弃的PBS，并更换或重新加满PBS瓶。使用新鲜且无菌的PBS持续冲洗，直至至少有2.5升无菌PBS流经肺组织。从脱细胞过程开始到冲洗完成，通常需要两天时间。将肺组织转移至新的无菌生物反应器系统中，该系统内含有新鲜的PBS，添加10% FBS和10%青霉素-链霉素，确保整个灌注回路和整个气道管路均充满液体。此后，将使用脉动泵以每分钟5毫米的速度对肺组织进行灌注。通过含有10% FBS和10%青霉素-链霉素的PBS对肺细胞外基质支架进行过夜灌注灭菌。完成此步骤后，将肺组织转移至37摄氏度的培养箱中孵育一小时，或直至温度达到平衡。为准备使用Ben Nase处理，下一步是对肺组织进行Ben Nase处理。为了去除每只肺中的残留 DNA，首先准备一支 10 毫升注射器，仅吸入预热的 Ben Nase 缓冲液，另准备一支 10 毫升注射器，吸入用 Ben Nase 缓冲液稀释的 Ben Nase（90 单位/毫升）。停止肺灌注。然后用 Ben Nase 缓冲液充盈气道，注意避免将空气注入肺部。让肺部自然萎陷一分钟。随后用 Ben Nase 溶液充盈肺部。再次注意，在用 Ben Nase 充气后避免将空气引入肺部。在 37 摄氏度下，使肺组织在无灌注或通气的条件下静置一小时。一小时结束后，使用生物反应器中已有的含 10% FBS 和 10% 青霉素-链霉素的 PBS 溶液恢复灌注，并在次日继续过夜灌注。清洗并灭菌后，可对长段细胞外基质支架进行细胞重植前的准备。将P-B-S-F-B-S苯甲酸溶液替换为250毫升培养基，细胞接种前至少灌注培养基一小时，并在接种细胞前立即更换为新鲜培养基。可用于器官脱细胞的细胞来源有多种。本文将演示使用上皮细胞群体的方法。首先，准备一支含有15毫升所需上皮细胞群体细胞悬液的注射器。接下来，向气道储液器中加入 80 毫升培养基，并确保所有通气管路中无气泡。然后将生物反应器放入 37 摄氏度的组织培养孵育箱中，并连接用于通气的注射泵。通过将 15 毫升细胞悬液快速注入气管插管，以单次快速推注的方式将细胞接种至肺组织中。确保主生物反应器的空气过滤器已盖好。然后立即使用注射泵以每分钟 3 毫升的速度缓慢抽取 60 毫升空气，从主生物反应器中单次缓慢呼吸一次。此过程将持续约 20 分钟。此后让肺脏静态放置约18小时。开始以每分钟约0.5毫升的速度进行缓慢血管灌注。在器官培养期间，灌注通常以每分钟1至3毫升的速度进行。在上皮细胞培养过程中使用滚轴泵时，通常以每分钟一次呼吸的连续速率提供通气，潮气量为5至10毫升。使用注射泵时，通过周期性地将空气抽出并注入生物反应器，使主腔室内交替产生负压与大气压，从而模拟呼吸过程。由于通气期间需要保持生物反应器的密闭性，因此应每日暂停通气一次，并更换主腔室内的空气。此外，培养基应大约每三到四天更换一次。在培养过程中，每次应更换总体积的一半左右，以培养肺上皮和血管内皮。在安装于生物反应器中的支架内，我们能够生成可在短时间内参与气体交换的肺组织。此处展示了天然大鼠肺组织的标准苏木精、嗜伊红和嗜酸性粒细胞染色，以与脱细胞大鼠肺组织的苏木精-伊红（H&E）染色进行对比。最终的脱细胞细胞外基质应完全去除细胞成分，并保留天然肺组织的大体、显微及超微结构特征。H&E染色可用于观察因脱细胞或冲洗不充分而残留在支架上的DNA残留物，从而评估细胞接种及后续肺组织培养的适宜条件。生物反应器应使细胞在肺的五个肺叶内均匀分布，并实现对细胞外基质支架约70%的覆盖。这些图像显示了经免疫荧光染色后，天然肺组织与重新接种细胞的肺组织的比较结果。对于关键的肺部标志物，培养的细胞群体表达Clara细胞分泌蛋白、前体表面活性蛋白C以及水通道蛋白5（Aquaporin five）。所有图中，目标标记物显示为红色，DAPI 染色的细胞核显示为蓝色。一旦掌握从脱细胞到退缩的整个流程，若操作得当，可在四到五天内完成。

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