Name: 构建模块化水凝胶片的微模式化宏观缩放3D细胞结构 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-11T10:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学习模块化水凝胶片的微图案化制备与组装技术，用于构建宏观尺度的三维细胞培养系统。该方法可创建可控的细胞微环境，为组织工程和细胞行为研究提供经济高效的功能性组织模型。

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本研究由韩国国家研究基金会通过国家领先研究实验室计划（资助号 NRF-2013R1A2A1A05006378）资助，该基金会由韩国科学、信息通信技术与未来规划部支持。作者同时感谢韩国科学技术院系统医疗计划的支持。

&#160; &#160;1. 微图案化模具与水凝胶的制备
<ol>
	<li>使用 SU-8 光刻胶通过标准的两步光刻技术在硅片表面制备所需的微尺度图案15,17 用于浇铸PDMS模具。所示示例采用类似肝小叶的网状图案（图1).</li>
	<li>称取 PDMS 和固化剂溶液，比例为 1:5（即，12.5 g PDMS 和 2.5 g 固化剂）。</li>
	<li>将15 g溶液充分混合，在真空腔中脱除气泡，然后将混合溶液均匀涂布于硅片的微图案化表面，置于铝箔铸型皿中。</li>
	<li>将硅片置于65 &#176;C 将 PDMS 在平坦表面上置于加热板上加热 90 分钟以使其固化。</li>
	<li>将固化后的聚二甲基硅氧烷（PDMS）从浇铸皿和硅晶片上取下。</li>
	<li>将PDMS的边缘裁剪后，放置于直径为100 mm的培养皿中，微图案面朝上。</li>
	<li>用70%乙醇和蒸馏水清洗培养皿中已固化并带有微图案的PDMS，进行初步灭菌。然后将PDMS置于65 °C烘箱中完全干燥10分钟。 &#176;C.</li>
	<li>过夜溶解并混合&#160;3 g 非离子表面活性剂粉末溶于 100 ml 蒸馏水中，配制成 3% (w/v) 的包被溶液。</li>
	<li>将微图案化PDMS模具放入等离子清洗仪中，以85 W、0.73 mbar的条件处理1分钟，使其表面变为亲水性，以便于后续添加水相液体。随后，将100 ml表面活性剂溶液涂覆于PDMS表面，至少浸泡&#160;3 小时（或过夜）使用实验室摇床。</li>
	<li>用烘箱在 65 ℃ 下彻底清洗并干燥 PDMS 模具中的表面活性剂溶液 &#176;C 下孵育 10 分钟。然后，将每个微图案化模具暴露于紫外（UV）辐射下超过 30 分钟以进行灭菌。</li>
</ol>
2. 在水凝胶前体中制备细胞悬液
<ol>
	<li>制备水凝胶前体：将 0.1 g 海藻酸钠粉末溶解于 10 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成 1%（w/v）的海藻酸钠前体溶液。为使粉末完全溶解，需在室温下孵育并混合过夜（O/N）。</li>
	<li>使用连接至 1&#160;ml 注射器的 0.22 µm 滤器过滤该溶液。</li>
	<li>在含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，将 HepG2 细胞接种于常规组织培养皿中，在 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中培养至细胞融合度达 70%–80%。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞一次，随后加入 1 ml 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中消化 4 分钟。将从培养皿中收集的细胞以 250 × g 离心 3 分钟，弃去上清液后用 1 ml PBS 重悬细胞。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪对 PBS 中单细胞悬液的细胞数量进行计数。</li>
	<li>在以 250 × g 离心 3 分钟并去除 PBS 后，向剩余的细胞沉淀中加入 1 ml 1%（w/v）海藻酸钠溶液，通过移液操作轻柔混匀。最终细胞接种密度应为 5 × 106&#160;–107 个细胞/ml。将细胞-水凝胶悬液置于 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中孵育。</li>
</ol>
3. 细胞/水凝胶悬液的加载与交联
<ol>
	<li>将1.47 g二水合氯化钙溶解于100 ml去离子水中2以生成交联试剂（即，100 mM CaCl₂2&#183;2H2O 在 ddH₂O 中2O)</li>
	<li>使用70%乙醇冲洗带有超声波换能器的加湿器内部，并加入200 ml交联试剂。该加湿器宽110 mm、长300 mm、深170 mm（即，110 毫米 ×&#160;300 mm × 170 mm（宽 × 高 × 深）</li>
	<li>将微图案化PDMS模具放入等离子清洗机中，在85 W功率下清洗1分钟，以形成亲水表面。</li>
	<li>稳定加载 7.2 &#181;在模具微图案边缘加入适量充分混合的细胞/水凝胶悬液。图示示例采用类似肝小叶的网状图案（图1悬液的体积取决于拓扑图案。</li>
	<li>为实现细胞/水凝胶悬浮液的凝胶化，打开加湿器并确认其产生交联试剂的雾状物。将交联试剂喷洒至水凝胶前体上持续5分钟，覆盖距离在5 cm范围内的PDMS模具的拓扑表面。 
	注意：距离超过5 cm或不足5 cm分别可能导致凝胶不完全或不均匀。确保加湿器的喷雾速率为250 ml/hr，可在5分钟内产生20 ml的交联试剂雾化液。</li>
	<li>交联过程完成后，关闭加湿器，并用 PBS 填充 PDMS 模具。</li>
</ol>
4. 单个模块化水凝胶片的处理
<ol>
	<li>用200 µL移液枪轻轻吸取PBS，沿微图案化模具中的水凝胶片边缘吹打，使其脱离模具&#160;&#181;移液管吸头</li>
	<li>使用末端切割的1,000 μL移液枪头吸取每片漂浮的水凝胶片&#160;&#181;l 移液管尖端。每个肝小叶状网状水凝胶片的尺寸为 8 mm × 8.7 mm，厚度为 100 - 200 µm &#181;微米厚。</li>
	<li>将单层水凝胶片转移至12孔板中含1 ml DMEM的培养基内，培养细胞 体外 以水凝胶构建体作为基本单元，在12孔板中悬浮培养一周，培养条件为5% CO₂2 37℃ 湿润培养箱 &#176;C. 每隔一天更换一次培养基。</li>
</ol>
5. 多层水凝胶片的组装
<ol>
	<li>重复步骤 1.1 至 1.5，制备一个尺寸为 18 mm x 18 mm 的 PDMS 框架&#160;毫米 × 4 毫米（宽 × 高 × 深），并包含 170-&#181;m高的柱状结构。使用42 g PDMS与固化剂的混合物，其比例与步骤1.2相同。将特制的聚碳酸酯模具置于硅片上，用于制备PDMS框架，形成内部尺寸为8 mm × 9 mm × 2 mm（宽×高×深）的框架。</li>
	<li>将 PDMS 框架和 180-&#181;m-pore 尼龙滤膜纸&#160;浸入蒸馏水中，并将镊子放入高压灭菌器中，在121℃下灭菌15分钟 &#176;C.</li>
	<li>将灭菌的聚二甲基硅氧烷（PDMS）框架置于直径为5 cm的尼龙滤纸片的四分之一处，放入直径为60 mm的培养皿中&#160;培养皿</li>
	<li>使用末端切割的1,000 μL移液器吸头将模块化水凝胶片转移至PDMS框架内部&#160;&#181;l 移液器吸头。用于组装的 hydrogel 片在制备后应培养至少一天。</li>
	<li>使用一个空的 200 μL 移液枪头，将每块模块化水凝胶片的边缘与 PDMS 框架对齐。&#160;&#181;移液器吸头</li>
	<li>使用模块化水凝胶片重复步骤 5.4 和 5.5，形成 4 - 6 层的叠层结构。</li>
	<li>通过PDMS框架底部的柱状结构将培养基流出，移除培养基。然后加入2 &#181;在多层结构的一个角落加入 l 的海藻酸钠溶液（2% w/v）。</li>
	<li>将交联试剂以喷雾形式喷洒于多层结构上30秒，使各层边缘相互粘连。使用2 ml交联试剂喷雾（喷洒速率为250 ml/hr）。</li>
	<li>用400 µL轻轻冲洗多层结构 &#181;l DMEM，并用镊子移除PDMS框架。</li>
	<li>加入4 ml DMEM后，用细胞刮轻轻擦拭滤纸，将多层结构从滤纸上分离。</li>
	<li>将多层结构通过滤纸转移至含有3 ml DMEM的6孔板中，培养细胞 体外 以悬浮方式，在6孔板中将水凝胶结构作为多尺度细胞支架培养一周，置于5% CO₂环境中2 37℃湿润培养箱 &#176;C. 每隔一天更换一次培养基。</li>
</ol>

<ol><li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (Supplement), 18-23 (2012).</li>
<li>Lan, S., Starly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+based+3D+hydrogels+as+an+in+vitro+co-culture+model+platform+for+the+toxicity+screening+of+new+chemical+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Alginate based 3D hydrogels as an in vitro co-culture model platform for the toxicity screening of new chemical entities.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 256 (1), 62-72 (2011).</li>
<li>Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+bioengineered+tumors+based+on+collagen+I+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels.</a> Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).</li>
<li>Lim, F., Sun, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulated+islets+as+bioartificial+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas.</a> Science. 210 (4472), 908-910 (1980).</li>
<li>Koh, W. G., Itle, L. J., Pishko, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molding+of+hydrogel+microstructures+to+create+multiphenotype+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molding of hydrogel microstructures to create multiphenotype cell microarrays.</a> Anal. Chem. 75 (21), 5783-5789 (2003).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Hydrogel+Capable+of+Cell+Preservation+without+Perfusion+Culture+under+Cell-Based+Assay+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Hydrogel Capable of Cell Preservation without Perfusion Culture under Cell-Based Assay Conditions.</a> Adv Mater. 22 (28), 3017-3021 (2010).</li>
<li>Um, E., Lee, D. S., Pyo, H. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+generation+of+hydrogel+beads+and+encapsulation+of+biological+materials+using+a+microfluidic+droplet-merging+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Continuous generation of hydrogel beads and encapsulation of biological materials using a microfluidic droplet-merging channel.</a> Microfluid. Nanofluid. 5 (4), 541-549 (2008).</li>
<li>Lee, D. H., Lee, W., E, U. m, Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbridge+structures+for+uniform+interval+control+of+flowing+droplets+in+microfluidic+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microbridge structures for uniform interval control of flowing droplets in microfluidic networks.</a> Biomicrofluidics. 5 (3), 034117(2011).</li>
<li>Lee, D. H., Bae , C. Y., Han, J. I., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+heterogeneity+in+the+lipid+content+of+single+green+microalgae+in+alginate+hydrogel+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of heterogeneity in the lipid content of single green microalgae in alginate hydrogel microcapsules.</a> Anal. Chem. 85 (18), 8749-8756 (2013).</li>
<li>Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+chemically+and+physically+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+guided+cell+growth+and+networking%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking.</a> Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).</li>
<li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+formation+of+heterotypic+hepatic+micro-organoids+in+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+long-term+preservation+of+liver-specific+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions.</a> Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).</li>
<li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nat. Mater. 12 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Lee, W., Son, J., Yoo, S. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+and+Biocompatible+Fabrication+of+Chemically+Sol%E2%88%92Gel+Transitional+Hydrogel+Free-Standing+Microarchitectures%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Facile and Biocompatible Fabrication of Chemically Sol−Gel Transitional Hydrogel Free-Standing Microarchitectures.</a> 12 (1), 14-18 (2011).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+hydrogel+biopaper+for+patterned+3D+cell+culture+and+modular+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">Cellular hydrogel biopaper for patterned 3D cell culture and modular tissue reconstruction.</a> Adv. Healthcare Mater. 1 (5), 635-639 (2012).</li>
<li>Bae, C. Y., Min, M. K., Kim, H., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+effect+of+the+hydrogel+grid+structure+on+in+vitro+formation+of+homogeneous+MIN6+cell+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Geometric effect of the hydrogel grid structure on in vitro formation of homogeneous MIN6 cell clusters.</a> Lab Chip. 14 (13), 2183-2190 (2014).</li>
<li>Bruzewicz, D. A., McGuigan, A. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+modular+tissue+construct+in+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a modular tissue construct in a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 8 (5), 663-671 (2008).</li>
<li>Choi, S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+photolithography+to+fabricate+multilevel+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Two-step photolithography to fabricate multilevel microchannels.</a> Biomicrofluidics. 4 (4), 046503(2010).</li>
<li>Lee, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+formation+and+collagen-alginate+composite+encapsulation+of+pancreatic+islet+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In situ formation and collagen-alginate composite encapsulation of pancreatic islet spheroids.</a> Biomaterials. 33 (3), 837-845 (2012).</li>
<li>Cabodi, M., Choi, N. W., Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+biomaterial%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A microfluidic biomaterial.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (40), 13788-13789 (2005).</li>
<li>Choi, N. W., Cabodi, M., Held, B., Gleghorn, J. P., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Microfluidic scaffolds for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 6 (11), 908-915 (2007).</li>
<li>Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogels+as+synthetic+extracellular+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials.</a> Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案提供了一种简便的方法，用于制备模块化水凝胶片，并将其组装成三维细胞支架。
为了在短时间内构建出清晰明确的海藻酸盐图案化结构，我们需要确定一种交联过程，该过程既能形成足够刚性的结构以保留模具中的复杂微图案，又能维持细胞的活力和代谢活性。我们开发了一种包含溶胶-凝胶转变的交联方法，利用加湿器以雾化形式喷洒交联试剂。若无此交联过程，则无法在扩散深度有限（100 - 200 µm）的薄型水凝胶结构中形成微尺度图案，而此类结构对代谢物和营养物质具有较高的扩散通透性。此外，与现有依赖扩散的方法（需30 - 60分钟）18−20相比，该交联过程所需时间较短（3 - 5分钟）。
此外，操作这些薄水凝胶片也具有挑战性，因为它们仅在液体环境中才具有机械稳定性。如图1所示，通过使用末端切割的常规移液枪头，可在不同培养条件下简单且稳定地转移和操作薄水凝胶结构。利用该制备与操作技术，我们不仅能够提供以漂浮形式存在的单层水凝胶片，用于潜在的药物检测应...

水凝胶是一类极具前景的生物材料，在基础生物学、药理学检测和医学领域具有重要应用潜力。1 基于水凝胶的细胞结构生物制造技术被认为有望减少动物实验的使用2,3，替代可移植组织4，并提升基于细胞的检测性能5,6。含水（hydro-）的黏弹性材料（凝胶）可将大量细胞包封并维持于支架结构中，从而调控三维细胞微环境。结合微流控或微图案化技术的引导，可在细胞尺度上精确控制水凝胶结构的几何形态。迄今为止，多种形态的水凝胶，包括微粒7-9、纤维10-12和片层13-15，已被用作自下而上构建宏观多细胞结构的基本单元。
基于水凝胶的微粒和纤维已可通过微流控装置在流体控制下快速、便捷地制备，用作微尺度的细胞环境。然而，作为工程化组织的基本单元，将其重新排列并扩增为宏观尺度的结构仍较为复杂16。相比制备微米尺度的基本模块，实现宏观尺度的构建更具挑战性。通过简单的组装工艺，可利用片状的水凝胶结构单元来增加支架的体积。因此，堆叠的水凝胶片层不仅实现了体积的增加，还实现了三维空间中的几何延展。
我们此前已报道过一种制备微图案化水凝胶片的方法13-15，以及将其组装成多层细胞结构的技术。该技术通过多层结构的堆叠过程，实现细胞构建体的复杂微图案化&#160;和模块化设计。通过制备具有微图案化的堆叠式模块化水凝胶片，可构建出具有可控宏观尺度细胞微环境的三维细胞培养系统。本视频方案描述了一种简单而高效的方法，可用于基于人肝癌细胞系（HepG2）构建模块化水凝胶片。本文在此展示了对这些图案化模块化水凝胶片的简便操作及其组装成多层结构的过程。

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>粉末状非离子表面活性剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>海藻酸钠盐，低黏度</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25266</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>超声波加湿器</td><td>MediHeim</td><td>MH-2800</td><td>改装设备，最大喷雾速率：250 ml/hr</td></tr><tr><td>尼龙网滤膜，亲水性，180 &amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>NY8H04700</td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯模具</td><td></td><td></td><td>定制模具，用于制备 PDMS 框架图案</td></tr></tbody></table>

用于微图案化宏观尺度三维细胞结构的模块化水凝胶片构建

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

水凝胶可利用微流控或微图案化技术在微米尺度上进行图案化，以提供一种 体内类三维（3D）组织结构。所构建的基于水凝胶的三维细胞体系已被用作动物实验的替代方案，广泛应用于高级生物学研究、药理学检测以及器官移植等领域。尽管基于水凝胶的微粒和纤维易于制备，但在组织重建过程中对其进行操控仍存在困难。本视频介绍了一种用于制备具有微图案化结构的海藻酸盐水凝胶片的方法，并进一步将其组装成具有可控细胞微环境的宏观尺度三维细胞培养系统。通过使用雾化形式的钙离子交联剂，可便捷地生成厚度为100–200 µm、并具有精确微图案的薄型水凝胶片。随后，细胞可在无支撑条件下借助水凝胶片的几何引导进行培养。此外，可使用末端切割型微量移液器轻松操控这些水凝胶片，并利用图案化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）框架将其堆叠组装成多层结构。这种通过简易工艺即可制备的模块化水凝胶片，在三维细胞培养、组织工程及再生医学等领域具有广阔的应用前景。 体外 药物分析与生物学研究，包括微结构与宏观结构的功能研究以及组织重建。

我们描述了游离细胞水凝胶片的制备与操作方法。如图1所示，我们制备了具有微图案的PDMS模具，并将含有细胞的水凝胶加载到这些模具的亲水表面，通过加湿器产生凝胶剂的气溶胶雾进行交联，从而形成水凝胶片。从模具上释放后，将HepG2细胞在具有不同图案的游离水凝胶片中进行培养（图2）。因此，这种薄的水凝胶片提供了三维细胞培养环境。此外，可通过使用末端切割的移液管头和PDMS框架层层叠加模块化水凝胶片，实现三维宏观尺度的细胞培养（图3）。
<img alt="水凝胶制备步骤：PDMS模具组装、细胞悬液注入、加湿凝胶化。" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. <stro...

我们介绍一种利用简单工艺制备可自由组装和操作的自支撑微图案化水凝胶片的方法。利用这些模块化水凝胶片，可构建具有可控细胞微环境的简单宏观尺度三维细胞培养系统。

水凝胶可通过微流控或微图案化技术在微米尺度上进行图案化，以提供类似体内环境的三维（3D）组织结构。

本实验的总体目标是展示用于三维细胞培养系统的模块化水凝胶片的简单制备、操作与组装方法。该方法有助于回答组织工程领域中的关键问题，例如如何利用培养的微环境构建更接近体内功能的工程化组织。该技术的主要优势在于，无需增加昂贵成本即可生成细胞水凝胶结构。三维细胞培养条件将取决于每种模块化水凝胶片。该技术的意义在于能够为细胞实验和生物学研究提供改进，因为它可构建出多种几何形状和组分的三维细胞微环境与宏观环境。尽管该方法可为体外细胞实验提供深入见解，也可应用于其他系统，例如可移植的三维组织模型支架。首先，使用标准的光刻技术制备所需的微尺度图案。本视频中展示的示例将采用类似此处所示的肝小叶状网格图案。接下来，称取2.5克PDMS和2.5克固化剂溶液，并将组分充分混合均匀。将溶液在真空室中脱气，然后将混合溶液均匀地涂布在硅片的微图形表面上，涂布容器为铝箔铸膜皿。接着，将铸膜皿置于65°C的加热板平面上，加热90分钟以固化PDMS。固化完成后，从铸膜皿中取出PDMS，并小心地将其从硅片表面剥离。切除PDMS的边缘，并将带有图案的部分放置在直径为100毫米的培养皿上，使微图案面朝上。然后用70%乙醇清洗微图案化的PDMS，再用蒸馏水冲洗，进行初步灭菌。随后，将装置置于65摄氏度的烘箱中完全干燥10分钟。接下来，将微图案化的PDMS模具放入等离子清洗仪中，清洗一分钟，以形成亲水性表面，这有助于水性液体的加载。然后，用材料表中列出的表面活性剂溶液涂覆PDMS表面，用量为100毫升。将样品置于实验室摇床上孵育至少三小时。接着，使用无菌水清洗PDMS模具中的表面活性剂溶液，并在65摄氏度的烘箱中完全干燥10分钟。然后，通过暴露于紫外辐射30分钟，对每个微图案化模具进行灭菌。采用标准技术培养HepG2细胞。当细胞融合度达到70%至80%时，使用PBS洗涤细胞一次。随后，加入1 mL 0.5%胰蛋白酶-EDTA，于37°C孵育4分钟，以收集细胞。细胞脱落后，将其收集至离心管中，在250 g下离心3分钟以形成细胞沉淀。弃去上清液，然后将细胞重悬于1 mL PBS中。使用自动细胞计数仪对PBS中分散的单细胞数量进行计数。随后，以 250 ×g 离心 3 分钟，再次收集细胞沉淀。弃去 PBS 上清液，向细胞中加入适量的 1% 海藻酸钠溶液，使最终接种密度为每毫升 500 万至 1000 万个细胞。使用移液器轻轻混匀细胞溶液，然后将细胞水凝胶悬浮液置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育。在细胞孵育的同时，将带有微图案的PDMS模具放入等离子清洗仪中，在85瓦功率下处理1分钟，以形成亲水表面。通过轻柔吹打重悬细胞水凝胶悬液，然后稳定地将7.2 µL悬液加至模具中微图案的边缘处。接着，使用加湿器以每小时250 mL的速率产生交联试剂的雾状物，喷洒至水凝胶前体上5分钟，使细胞水凝胶悬液完成凝胶化。确保该操作在五厘米范围内覆盖PDMS模具的表面形貌。交联过程完成后，关闭加湿器，并用PBS填充PDMS模具。使用200微升移液器，沿硬化水凝胶片边缘轻轻加入PBS，以使每片水凝胶逐个脱离。然后，使用剪切末端的 1,000 微升移液器吸头逐个拾取漂浮的水凝胶片。将每片水凝胶转移至含有 1 毫升预热 DMEM 的 12 孔板的各个孔中，使其漂浮在培养基表面。以此方式培养细胞一周，每隔一天更换一次培养基。接下来，制备一个PDMS框架，其底面含有170微米高的柱状结构，具体方法如随附的文字方案所述。在制备过程中，将特制的聚碳酸酯模具置于硅片上，用于形成PDMS框架的内框，其宽度为8毫米，高度为9毫米，深度为2毫米。经灭菌后，将PDMS框架放置在60毫米培养皿中一片尼龙滤膜的四分之一区域上。从培养箱中取出水凝胶片，使用剪切过的1,000微升移液器吸头将第一片模块化水凝胶片转移至PDMS框架内部。使用一个空的200微升移液器吸头对齐模块化水凝胶片的边缘与PDMS框架。重复此步骤，逐层添加水凝胶片，直至形成四到六层的堆叠结构。接下来，通过PDMS框架底部的柱状结构将培养基移除。然后，在多层结构的一个角落加入2微升的2%海藻酸钠溶液。使用加湿器，以每小时250毫升的速率向多层结构喷洒交联试剂雾状溶液，持续30秒，以使各层边缘相互粘合。随后，用 400 微升 DMEM 轻柔冲洗多层结构，并用镊子移除 PDMS 框架。然后，加入额外的 4 毫升 DMEM。用细胞刮棒轻柔擦拭带有滤纸的多层结构以将其剥离，再使用滤纸将其转移至含有 3 毫升 DMEM 的六孔板中。将细胞与水凝胶结构一起在六孔板中以悬浮方式培养至少一周，每隔一天更换一次培养基。此处展示的是肝小叶样微图案化水凝胶片层状组装的结果，其中绿色荧光的人肝癌细胞与红色荧光的NIH-3T3成纤维细胞在复合网格上共同共培养生长。利用本文介绍的技术，可以制造出多种图案化结构，包括六边形微柱、细密网格、完整阵列，以及呈薄层水凝胶结构形式的大量类似微梳状的微纤维，其尺寸在100至200微米范围内。这些结构为多种不同类型的细胞提供了丰富的三维培养环境。观看本视频后，您应能够充分掌握如何自下而上地构建类体内三维细胞培养系统所用的细胞水凝胶片层。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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