构建模块化水凝胶片的微模式化宏观缩放3D细胞结构

该程序的总体目标是展示用于 3D 细胞培养系统的模块化水凝胶片的简单制造、作和组装。这种方法可以帮助回答组织工程领域的关键问题，例如如何在培养的微环境中创建更多类似体内的功能工程组织。该技术的主要优点是可以在没有任何昂贵的增量的情况下生成细胞水凝胶构建体。

3D 细胞培养条件将取决于每个模块化水凝胶片。该技术的意义延伸到改进的基于细胞的检测和生物学研究，因为该技术可以提供 3D 细胞微观和宏观环境的各种几何形状和组成。虽然这种方法可以提供对基于体外细胞的分析的见解，但它也可以应用于其他系统，例如 3D 组织模型的可移植支架。

首先使用标准光刻技术生产所需的微尺度模型。本视频中所示的示例将使用类似肝小叶的网状图案，如此处所示。接下来称取 2.5 克 PDMS 和 2.5 克固化剂溶液，并将组分彻底混合在一起。

在真空室中对溶液进行脱气，然后将混合溶液均匀地涂抹在铝箔铸造皿内的硅晶片的微图案表面上。接下来，将培养皿放在 65 摄氏度加热板的平面上 90 分钟，以固化 PDMS。固化后，从铸盘中取出 PDMS，并小心地将其从硅晶片上剥离。

切掉 PDMS 的边缘，将图案部分放在直径为 100 毫米的培养皿上，使微图案面朝上。然后，用 70% 乙醇洗涤微图案 PDMS，然后用蒸馏水洗涤，进行初级灭菌。然后，在 65 摄氏度的烤箱中将设置完全干燥 10 分钟。

接下来，将微图案 PDMS 模具放入等离子清洗机中并清洁一分钟，以形成亲水表面。这将有助于水性液体的加载。然后用材料表中列出的 100 毫升表面活性剂溶液涂覆 PDMS 的表面。

将样品在实验室摇床上孵育至少 3 小时。接下来，使用无菌水清洗 PDMS 模具上的表面活性剂溶液，并在 65 摄氏度的烘箱中完全干燥 10 分钟。然后，将每个微图案模具暴露在紫外线照射下 30 分钟，对其进行消毒。

首先使用标准技术培养 hepg2 细胞。一旦细胞达到 70% 至 80% 汇合，使用 PBS 洗涤细胞一次。然后，加入一毫升 05% tripsin edta 并在 37 摄氏度下孵育 4 分钟，收获细胞。

分离后，将细胞收集在离心管中，并以 250 g 的浓度沉淀 3 分钟。去除上清液，然后将细胞重悬于一毫升 PBS 中。使用自动细胞计数器计数 PBS 中单个分布细胞的数量。

然后，再次以 250 g 的浓度沉淀细胞 3 分钟。去除 PBS 上清液，向细胞中加入足够的 1% 海藻酸钠溶液，使最终接种密度在每毫升 5 至 1000 万个细胞之间。使用移液管轻轻混合细胞溶液，然后在 37 摄氏度的 5% CO2 加湿培养箱中孵育细胞水凝胶悬浮液。

当细胞孵育时，将微图案化的 PDMS 模具放入等离子清洗机中，并以 85 瓦的功率清洁一分钟，以形成亲水表面。通过轻轻上下吹打来混合细胞水凝胶悬浮液，然后在模具中微图案的边缘稳定加载 7.2 微升悬浮液。然后，用加湿器以每小时 250 毫升的速度产生交联剂雾，并将其喷洒到水凝胶前体上 5 分钟，使细胞水凝胶悬浮液凝胶化。

确保此过程在 5 厘米的范围内覆盖 PDMS 模具的形貌表面。在交联过程之后，关闭加湿器并用 PBS 填充 PDMS 模具。使用 200 微升移液器，在硬化的水凝胶片的边缘轻轻分配 PBS，以分离每个水凝胶。

然后，使用端切的 1， 000 微升移液器吸头拿起每个漂浮的水凝胶片。将每张水凝胶转移到含有一毫升预热 DMEM 的 12 孔板的各个孔中，以便它们漂浮在培养基表面。像这样培养细胞一周，每隔一天更换一次培养基。

接下来，生成一个 PDMS 框架，该框架在下表面包含 170 微米高的柱状结构，如随附的文本协议中所述。在制造过程中，将专用的聚碳酸酯模具放在 PDMS 框架的硅晶片上，以创建宽 8 毫米、高 9 毫米、深 2 毫米的内部框架。消毒后，将 PDMS 框架放在 60 毫米培养皿中的四分之一尼龙滤纸上。

从培养箱中取出水凝胶片，并使用端切 1， 000 微升移液器吸头将第一个模块化水凝胶片转移到 PDMS 框架的内部。使用空的 200 微升移液器吸头将模块化水凝胶片材的边缘与 PDMS 框架对齐。用额外的水凝胶片重复此过程，直到达到四到六层的堆叠。

接下来，通过流经 PDMS 框架底部的支柱结构来去除培养基。然后，在多层结构的一个角落加入两微升 2% 的海藻酸盐溶液。使用加湿器，以每小时 250 毫米的速度将交联试剂雾喷到多层结构上 30 秒，以将每层的边缘连接在一起。

然后，用 400 微升 DMEM 轻轻冲洗多层构建体，并使用镊子去除 PDMS 框架。然后，再添加 4 毫升 DMEM。用细胞提升器轻轻擦拭，用滤纸分离多层结构，然后使用滤纸将其转移到含有 3 毫升 DMEM 的六孔板中。

用水凝胶构建体作为多尺度细胞支架在六孔板中以漂浮方式培养细胞至少一周。每隔一天更换一次培养基。此处显示了肝小叶状微模式水凝胶片的逐层组装的结果，其中发出绿色荧光的人肝癌细胞和发出红色荧光的 NIH-3T3 成纤维细胞在组合网上共培养在一起生长。

使用此处介绍的技术，可以创建许多图案变化，包括六边形柱、薄网、整个阵列和多个微梳状微纤维，形成 100 至 200 微米左右的薄水凝胶结构。这些结构为许多不同的细胞类型提供了丰富的 3D 培养环境。观看此视频后，您应该对如何自下而上创建用于工程类体内 3D 培养系统的细胞水凝胶片有很好的了解。