用于微图案化宏观尺度三维细胞结构的模块化水凝胶片构建

本实验的总体目标是展示用于三维细胞培养系统的模块化水凝胶片的简单制备、操作与组装方法。该方法有助于回答组织工程领域中的关键问题，例如如何利用培养的微环境构建更接近体内功能的工程化组织。该技术的主要优势在于，无需增加昂贵成本即可生成细胞水凝胶结构。

三维细胞培养条件将取决于每种模块化水凝胶片。该技术的意义在于能够为细胞实验和生物学研究提供改进，因为它可构建出多种几何形状和组分的三维细胞微环境与宏观环境。尽管该方法可为体外细胞实验提供深入见解，也可应用于其他系统，例如可移植的三维组织模型支架。

首先，使用标准的光刻技术制备所需的微尺度图案。本视频中展示的示例将采用类似此处所示的肝小叶状网格图案。接下来，称取2.5克PDMS和2.5克固化剂溶液，并将组分充分混合均匀。

将溶液在真空室中脱气，然后将混合溶液均匀地涂布在硅片的微图形表面上，涂布容器为铝箔铸膜皿。接着，将铸膜皿置于65°C的加热板平面上，加热90分钟以固化PDMS。固化完成后，从铸膜皿中取出PDMS，并小心地将其从硅片表面剥离。

切除PDMS的边缘，并将带有图案的部分放置在直径为100毫米的培养皿上，使微图案面朝上。然后用70%乙醇清洗微图案化的PDMS，再用蒸馏水冲洗，进行初步灭菌。随后，将装置置于65摄氏度的烘箱中完全干燥10分钟。

接下来，将微图案化的PDMS模具放入等离子清洗仪中，清洗一分钟，以形成亲水性表面，这有助于水性液体的加载。然后，用材料表中列出的表面活性剂溶液涂覆PDMS表面，用量为100毫升。

将样品置于实验室摇床上孵育至少三小时。接着，使用无菌水清洗PDMS模具中的表面活性剂溶液，并在65摄氏度的烘箱中完全干燥10分钟。然后，通过暴露于紫外辐射30分钟，对每个微图案化模具进行灭菌。

采用标准技术培养HepG2细胞。当细胞融合度达到70%至80%时，使用PBS洗涤细胞一次。随后，加入1 mL 0.5%胰蛋白酶-EDTA，于37°C孵育4分钟，以收集细胞。

细胞脱落后，将其收集至离心管中，在250 g下离心3分钟以形成细胞沉淀。弃去上清液，然后将细胞重悬于1 mL PBS中。使用自动细胞计数仪对PBS中分散的单细胞数量进行计数。

随后，以 250 ×g 离心 3 分钟，再次收集细胞沉淀。弃去 PBS 上清液，向细胞中加入适量的 1% 海藻酸钠溶液，使最终接种密度为每毫升 500 万至 1000 万个细胞。使用移液器轻轻混匀细胞溶液，然后将细胞水凝胶悬浮液置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育。

在细胞孵育的同时，将带有微图案的PDMS模具放入等离子清洗仪中，在85瓦功率下处理1分钟，以形成亲水表面。通过轻柔吹打重悬细胞水凝胶悬液，然后稳定地将7.2 µL悬液加至模具中微图案的边缘处。接着，使用加湿器以每小时250 mL的速率产生交联试剂的雾状物，喷洒至水凝胶前体上5分钟，使细胞水凝胶悬液完成凝胶化。

确保该操作在五厘米范围内覆盖PDMS模具的表面形貌。交联过程完成后，关闭加湿器，并用PBS填充PDMS模具。使用200微升移液器，沿硬化水凝胶片边缘轻轻加入PBS，以使每片水凝胶逐个脱离。

然后，使用剪切末端的 1,000 微升移液器吸头逐个拾取漂浮的水凝胶片。将每片水凝胶转移至含有 1 毫升预热 DMEM 的 12 孔板的各个孔中，使其漂浮在培养基表面。以此方式培养细胞一周，每隔一天更换一次培养基。

接下来，制备一个PDMS框架，其底面含有170微米高的柱状结构，具体方法如随附的文字方案所述。在制备过程中，将特制的聚碳酸酯模具置于硅片上，用于形成PDMS框架的内框，其宽度为8毫米，高度为9毫米，深度为2毫米。经灭菌后，将PDMS框架放置在60毫米培养皿中一片尼龙滤膜的四分之一区域上。

从培养箱中取出水凝胶片，使用剪切过的1,000微升移液器吸头将第一片模块化水凝胶片转移至PDMS框架内部。使用一个空的200微升移液器吸头对齐模块化水凝胶片的边缘与PDMS框架。重复此步骤，逐层添加水凝胶片，直至形成四到六层的堆叠结构。

接下来，通过PDMS框架底部的柱状结构将培养基移除。然后，在多层结构的一个角落加入2微升的2%海藻酸钠溶液。使用加湿器，以每小时250毫升的速率向多层结构喷洒交联试剂雾状溶液，持续30秒，以使各层边缘相互粘合。

随后，用 400 微升 DMEM 轻柔冲洗多层结构，并用镊子移除 PDMS 框架。然后，加入额外的 4 毫升 DMEM。用细胞刮棒轻柔擦拭带有滤纸的多层结构以将其剥离，再使用滤纸将其转移至含有 3 毫升 DMEM 的六孔板中。

将细胞与水凝胶结构一起在六孔板中以悬浮方式培养至少一周，每隔一天更换一次培养基。此处展示的是肝小叶样微图案化水凝胶片层状组装的结果，其中绿色荧光的人肝癌细胞与红色荧光的NIH-3T3成纤维细胞在复合网格上共同共培养生长。

利用本文介绍的技术，可以制造出多种图案化结构，包括六边形微柱、细密网格、完整阵列，以及呈薄层水凝胶结构形式的大量类似微梳状的微纤维，其尺寸在100至200微米范围内。这些结构为多种不同类型的细胞提供了丰富的三维培养环境。观看本视频后，您应能够充分掌握如何自下而上地构建类体内三维细胞培养系统所用的细胞水凝胶片层。