Name: 定向分化诱导性多潜能干细胞向T淋巴细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 了解如何利用诱导性多潜能干细胞定向分化为T淋巴细胞的方法，通过OP9-DL1培养系统和体内成熟技术生成抗原特异性T细胞，用于肿瘤免疫治疗研究。

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我们感谢京都大学的 Shinya Yamanaka 博士提供 iPS-MEF-Ng-20D-17 细胞系，圣裘德儿童研究医院的 Dario Vignali 博士支持提供 OT1-2A•pMig II 载体，多伦多大学免疫学系的 Juan Carlos Zuniga-Pflucker 博士支持提供 OP9-DL1 细胞系，以及宾夕法尼亚州立大学医学院药理学系的 Kent E Vrana 博士在本研究设计方面提供的帮助。本项目获得美国国家癌症研究所（资助号：K18CA151798）、Barsumian 信托基金和黑色素瘤研究基金会（J. Song）的资助。

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未声明任何利益冲突。

对于基于ACT的疗法， 体外 大量高活性抗原特异性T细胞的制备 体内 再次输注是一种最佳方法。尽管我们的 体外 该方法可由iPS细胞获得功能性T细胞，但大量iPS细胞来源的细胞在四周内死亡，尤其在第四周尤为显著。我们得出结论：由DL1介导的Notch信号通路以及IL-7和FLt3L提供的存活信号不足以维持iPS细胞来源的T细胞前体的存活，可能需要其他存活因子协同作用以调控这些细胞的成熟。TCR基因转导及 体外 使用Notch配体刺激可有效引导iPS细胞向T细胞分化，然而iPS细胞来源的抗原特异性T细胞仍无法长期存活，这阻碍了获得足够数量的iPS细胞来源抗原特异性T细胞用于基于过继性细胞转移（ACT）的免疫治疗。
T淋巴细胞在胸腺中的发育是一个高度有序的过程。那些不表达CD4和CD8的未成熟胸腺细胞被称为双阴性（DN）细胞。DN前体细胞根据CD44和CD25的表达情况进一步划分为不同的发育亚群：DN1（CD44+CD25-）、DN2（CD44...

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>B6.129S7-&lt;em&gt;Rag1&lt;sup&gt;tm1Mom&lt;/sup&gt;/J&lt;/em&gt;</td><td>杰克逊实验室</td><td>002216</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD3 (2C11) 抗体</td><td>BD 生物科学</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD28 (37.51) 抗体</td><td>BD 生物科学</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD3 (17A2) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>100202</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD4 (GK1.5) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>100417</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD8 (53-6.7) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD25 (3C7) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>101912</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD44 (1M7) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>103012</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD117 (2B8) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>105812</td><td></td></tr><tr><td>抗 TCR-&amp;#946; (H57597) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>109220</td><td></td></tr><tr><td>抗 IL-2 (JES6-5H4) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>503810</td><td></td></tr><tr><td>抗 IFN-&amp;#947; (XMG1.2) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>505822</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>布雷菲尔德菌素 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>GeneJammer</td><td>Integrated Sciences</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>RNA 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>DNA 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>CD8 分离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-236</td><td></td></tr><tr><td>ACK 裂解缓冲液</td><td>Lonza Inc.</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>PeproTech Inc</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>PeproTech Inc</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>FITC-抗 OVA 抗体</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>200-4233</td><td></td></tr><tr><td>通透缓冲液</td><td>Biolegend</td><td>421002</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>0.4 &amp;mu;m 滤膜</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moflo 细胞分选仪</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calibur 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠固定器</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

诱导多能干细胞向t淋巴细胞的定向分化

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

过继性细胞转移（adoptive cell transfer, ACT）抗原特异性的CD8+ 细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）是治疗多种恶性肿瘤的有前景策略1。CTLs可通过T细胞受体（TCR）与肿瘤抗原相互作用来识别恶性细胞，并释放细胞毒素及细胞因子以杀伤恶性细胞。已知分化程度较低且具有中央记忆样表型（称为高反应性）的CTLs是基于ACT的免疫治疗中最理想的细胞群体，因为这类CTLs具有较强的增殖潜能，较已分化细胞更不易发生凋亡，并且对稳态细胞因子具有更强的响应能力2-7。然而，由于从患者体内获取大量此类CTLs存在困难，因此迫切需要开发一种新方法以生成高反应性的抗原特异性CTLs，从而实现ACT疗法的成功应用。
将T细胞受体转导至可自我更新的干细胞以实现免疫重建，在疾病治疗中具有治疗潜力 8-10然而，从患者体内获取胚胎干细胞（ESCs）的方法并不可行。尽管造血干细胞（HSCs）在临床治疗中的应用已十分广泛 11-13，造血干细胞的分化能力和增殖能力降低，且难以在体外扩增 体外 细胞培养 14-16. 近期iPS细胞技术的发展及一种 体外 无需任何外科手术即可从患者体内生成诱导多能干细胞的基因递送系统。此外，与胚胎干细胞类似，诱导多能干细胞具有无限增殖能力 体外，并已被证明可分化为造血细胞。因此，与胚胎干细胞（ESCs）或造血干细胞（HSCs）相比，诱导性多能干细胞（iPS细胞）在基于细胞疗法的免疫治疗中具有更大的应用潜力。
本文介绍了由诱导性多能干细胞（iPS细胞）生成T淋巴细胞的方法 体外，和 体内 由iPS细胞编程抗原特异性CTL以促进癌症免疫监视。刺激 体外 使用Notch配体可诱导iPS细胞向T细胞分化，而TCR基因转导可使iPS细胞分化为抗原特异性T细胞 体内，从而抑制肿瘤生长。因此，我们展示了由iPS细胞分化为抗原特异性T细胞的过程。本研究为生成用于过继性细胞治疗（ACT）的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）提供了一种潜在更高效的方法，并有助于推动针对各类疾病的治疗策略的开发。

由诱导性多能干细胞（iPS细胞）生成T淋巴细胞，为T细胞免疫治疗提供了一种替代使用胚胎干细胞的新途径。该方法表明，通过利用以下任一方式 体外 或 体内 诱导系统能够使iPS细胞分化为常规T淋巴细胞和抗原特异性T淋巴细胞。

诱导多能干细胞向T淋巴细胞的定向分化

过继性细胞转移（adoptive cell transfer, ACT）抗原特异性CD8+ 细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes, CTLs）是治疗多种恶性肿瘤的一种有前景的策略1。CTLs能够……

本实验的总体目标是从诱导性多能干细胞（iPS细胞）中生成并鉴定T淋巴细胞。这些iPS细胞可在体外通过OP9-DL1共培养系统进行分化，随后在rag缺陷型小鼠体内成熟；或者，可对细胞进行基因改造，使其过表达OT-I TCR，然后通过过继转移实现体内发育。经过六周的体内分化后，可通过腹腔注射 EEG7 肿瘤细胞对小鼠进行攻击，随后可评估由诱导性多能干细胞（IPS）衍生的 T 细胞的抗原特异性。最终，IPS 细胞可分化为常规 T 细胞和抗原特异性 T 细胞，后者能够保护动物免受肿瘤攻击。该技术的应用前景包括个体化癌症免疫治疗。该方法能够利用极少量的患者血液或皮肤组织生成大量肿瘤反应性T细胞。在第0天，将5×10⁴个iPS细胞接种至一个100毫米培养皿中，该培养皿内含有融合的OP9-DL1细胞单层，并使用含20% FBS的α-MEM培养基。在第5天，用胰蛋白酶消化细胞，离心收集细胞，将细胞在新鲜的100毫米培养皿中于37°C孵育30分钟，然后取5×10⁵个悬浮细胞，接种至另一个含有OP9-DL1细胞单层的100毫米培养皿中，使用含20% FBS的α-MEM培养基，并添加小鼠Flt3配体。在第8天，轻轻吹打以收集松散贴壁的细胞，离心后将细胞转移至一个六孔培养板中的单个孔内，该孔预先包被有融合的OP9-DL1细胞单层。将细胞在37°C、5% CO₂条件下继续培养两周。在第22天进行后续操作。将分离的IPS细胞置于新鲜培养基中，在新的培养皿中于37摄氏度孵育30分钟。然后移除约一半的悬浮细胞，通过70微米尼龙滤网过滤以去除细胞团块，并用预冷的PBS洗涤所得的单细胞悬液三次。第三次洗涤后，将细胞重悬于PBS中，浓度为每毫升1.5 × 10⁷个细胞，并在冰上保存，待静脉注射使用。将一只四周大的rag缺陷型小鼠置于红外灯下以扩张尾静脉。然后用一支26.5号针头的1毫升注射器吸取200微升细胞悬液，通过扩张的尾静脉进行过继性细胞转移。在确认过继转移小鼠安乐死后三周，机械破碎组织后取出淋巴结和脾脏。用CK裂解缓冲液裂解单细胞悬液，然后用预冷的PBS洗涤所得的单核细胞两次。在第0天，对细胞表面标志物进行染色后，通过流式细胞术分析细胞；第1天，使用基因JAMA转染试剂，对前一晚已铺板的Plate E包装细胞转染OT一MIDR；第2天，将一乘以十的六次方个IPS细胞接种至经0.1%明胶预包被的24孔板的一个孔中，收集Plate E细胞中含S natin的假病毒，经离心后通过0.4微米滤器过滤，以去除潜在污染物。在多聚素存在条件下，于32摄氏度、330×g离心力下转导细胞一小时。重复转导步骤后，在相同温度下过夜孵育。在第4天用胰蛋白酶处理转导的iPS细胞，离心后将细胞重悬于新鲜培养基中，并接种至预先制备的经照射的SNL 767饲养细胞上。当转导的细胞达到汇合状态时，通过流式细胞术分选GFP

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

定向分化诱导性多潜能干细胞向T淋巴细胞

该视频展示了一项利用人诱导性多能干细胞（iPSC）来源的CD8+...

利用病毒抗原特异性T细胞抑制乙型肝炎病毒复制

本视频展示了一种用于生成肿瘤抗原特异性的诱导性多能干细胞（iPSC）来源的CD8αβ+ T细胞的实验方法。将肿瘤抗原特异性的iPSC在基质细胞单层上培养，并分化为造血祖细胞（HPCs）。随后，利用分化培养基将HPCs分化为CD4+ CD8+...

由诱导性多能干细胞生成单阳性CD8 T细胞

小鼠胚胎干细胞可通过 OP9-DL1 共培养系统在体外分化为 T 细胞。in vitro...

T细胞的制备 体外 从小鼠胚胎干细胞

本方案描述了通过强制表达转录因子，从人多能干细胞高效诱导生血内皮细胞和多能造血祖细胞的方法。...

通过转录因子过表达在人多能干细胞中直接诱导生血内皮和血液细胞

本方案描述了如何在无饲养层条件下，利用含重编程因子的基质胶和仙台病毒载体，从人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）。...

利用仙台病毒在无饲养层条件下由人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞

本实验方案的目的是展示将黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方法。...

由人黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞生成诱导性多能干细胞

本文介绍一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）在小鼠模型中生成具有功能性的抗原（Ag）特异性调节性T细胞（Tregs）的方法，用于自身免疫性关节炎的免疫治疗。...

开发源自干细胞的抗自身免疫抗原特异性调节性T细胞

本文介绍了人类多能干细胞（hPSC）的培养方案，用于将hPSC分化为CD34+造血祖细胞。该方法通过阶段特异性调控经典WNT信号通路，使细胞特异性地定向分化为确定型或原始型造血程序。...

从人多能干细胞定向分化原始和确定型造血祖细胞

本文介绍了一种利用三维（3D）胸腺培养系统生成肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞（iTE）的新方法。iTE...

一种用于产生小鼠诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

本文介绍了一种利用OP9/DLL1共培养系统生成功能性肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的CD8αβ+单阳性T细胞的方法。...

利用人诱导性多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

本文介绍了一种通过过继性细胞转移（ACT）将干细胞来源的病毒抗原（Ag）特异性T淋巴细胞移植到小鼠体内，从而有效抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制的实验方案。该方法可进一步优化，用于HBV感染的潜在ACT免疫治疗研究。...

干细胞来源的病毒抗原特异性T淋巴细胞抑制小鼠中乙型肝炎病毒复制

了解如何利用诱导性多潜能干细胞定向分化为T淋巴细胞的方法，通过OP9-DL1培养系统和体内成熟技术生成抗原特异性T细胞，用于肿瘤免疫治疗研究。

诱导多能干细胞向T淋巴细胞的定向分化

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