定向分化诱导性多潜能干细胞向T淋巴细胞

该程序的总体目标是从诱导多能干细胞或 IPS 细胞中生成和表征 T 淋巴细胞。然后可以在 OP 9 DL one 培养系统上对 IPS 细胞进行体外分化，然后在破布缺陷小鼠体内成熟。或者可以对细胞进行基因工程改造，以过表达 OT 一种 TCR，然后过继转移用于体内发育。

体内分化 6 周后，可以通过腹腔注射 EEG 7 个肿瘤细胞来攻击小鼠，然后可以评估 IPS 衍生的 T 细胞的抗原特异性。最终，IPS 细胞可以分化为常规 T 细胞和抗原特异性 T 细胞，后者能够保护动物免受肿瘤攻击。该技术的含义延伸到个体化癌症免疫疗法。

该方法允许从最少量的患者血液或皮肤组织中产生大量肿瘤反应性 T 细胞 在第 0 天将 5 乘以 10 转移到第四个 IPS 细胞上，该培养皿含有汇合的 OP 9，DL 1 细胞单层在 20% FBS α MEM 培养基中，第 5 天， 胰蛋白酶眼。然后将细胞在新鲜的 100 毫米培养皿和 37 度培养板上孵育 30 分钟后进行离心，将漂浮细胞在 20% FBS α、MEM 培养基和小鼠扁平三配体中孵育 5 次 10 至五分之一，放在含有单层 OP 9 的新 100 毫米培养皿上。DL one 细胞在第 8 天轻轻吸取松散附着的细胞，离心细胞，然后将细胞转移到涂有汇合 OP 的六孔培养板的单个孔中 9 DL one 细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下再孵育细胞两周在第 22 天。

将分离的 IPS 细胞在新鲜培养基中置于 37 °C 的新培养皿上孵育 30 分钟。然后去除大约一半的漂浮细胞，将它们通过 70 微米尼龙过滤器以排除细胞团块，并用冷 PBS 洗涤所得的单细胞悬液 3 次。第三次洗涤后，以每毫升第七个细胞的 1.5 倍 10 倍的 PBS 重悬细胞，并在静脉注射前将细胞保持在冰上。

将一只 4 周龄的破布缺陷小鼠放在红外光下，以扩张尾静脉。然后将 200 微升细胞悬液填充配备 26 号半针头的 1 毫升注射器，并通过扩张的尾静脉过继转移细胞。三周后，在确认过继转移的小鼠实施安乐死后，在机械分解组织后切除淋巴结和脾脏。

用 CK 裂解缓冲液溶出单细胞悬液，然后在冷 PBS 中洗涤所得的单核细胞两次。然后在细胞表面标志物染色后，在第 0 天通过流式细胞术分析评估细胞，使用基因 JAMA 转染试剂将过夜铺板 E 包装细胞与第 1 天种子的 OT 1 个 MIDR 转染到六个 IPS 细胞中，第 2 天放入 0.1% 明胶预编码的 24 孔板的一个孔中， 从 Plat E 细胞中收集含有 S natin 的假病毒，然后通过 0.4 微米过滤器，以排除离心后的潜在污染物。在 32 摄氏度下，在多脑存在下以 330 倍 G 转导细胞 1 小时。

重复转导程序后，在相同温度下孵育过夜。胰蛋白酶在第 4 天观察转导的 IPS 细胞，然后在沉淀后，细胞复苏将细胞悬浮在新鲜培养基中，并将它们接种在预先编码的辐照 snl 7 6 7 饲养层细胞上。一旦转导的细胞达到一致性，通过流式细胞术对 GFP 和 DS red 双阳性细胞进行分类。

IPS 细胞过继转移 6 周后，在肿瘤攻击的第 50 天，将 50 微升 EEG 7 thoma 细胞注射到同一只小鼠的腹膜腔中。使用 mil E biotech CD 8 阳性 T 细胞分离试剂盒从过继转移动物的脾脏和淋巴结中分选 CD 8 阳性 T 细胞。将来自幼稚 C 57 black six J 小鼠的分离的 CD 8 阳性 T 细胞与辐照的 SPOC 大小以 1 比 10 的比例混合，并以每密耳卵 0.5 微摩尔脉冲共培养物 40 小时。

此后，将 felden A 添加到细胞中再 4 小时。最后，从幼稚的 C 57 black six J 小鼠中分离 SP 细胞后，通过流式细胞术分析评估细胞群。将细胞悬液分成两组。

用 5 微摩尔/密耳的 CFSE 标记 CFSE 高组，并用 10 微克/密耳的卵肽脉冲细胞一小时，用 0.5 微摩尔/密耳的 CFSE 标记的 A-C-F-S-E 低组，不要脉冲。将 2.5 倍 10 混合至第六个细胞，将 CFSE 高细胞与 2.5 倍 10 混合至第六个细胞，将 CFSE 低细胞混合在 PBS 中。然后通过流式细胞术分析 CFSE 表达的细胞。

过继转移到感兴趣的小鼠中后 16 小时在肿瘤攻击的第 20 天对腹膜内肿瘤细胞进行计数。使用配备 10 号半号针头和冷 PBS 的 18 毫升注射器灌洗腹膜腔。对回收的肿瘤细胞进行计数以识别肿瘤浸润细胞。

在肿瘤激发的后期切除肿瘤，然后将肿瘤切成三块。将第一个肿瘤块放入冷冻瓶中，并将小瓶放在干冰上。立即固定第二块甲醛。

风干冷冻保存的组织切片后，将第三块保存在经过调节的 RPMI 1640 培养基中。将它们固定在冷丙酮中 15 分钟，然后将固定部分风干 15 分钟。洗涤后在 PBS 中洗涤玻片 5 分钟。

将玻片置于潮湿的腔室中，用 30 μL 3%B、SA 和 PBS 覆盖组织切片 30 分钟，以阻断非特异性结合。然后吸干封闭缓冲液，并在孵育结束时，将组织切片与 50 微升 pe 抗 TCR RV alpha 2 抗体和 fitzy 抗卵抗体的混合物在湿室中用 3%PSA 的 PBS 溶液稀释孵育两小时。在冷 PBS 中洗涤载玻片 3 次，最后用水基封固剂封片，然后进行荧光显微镜检查，用于肿瘤浸润 T 细胞的流式细胞术分析。

将肿瘤挤压成单细胞悬液。然后分析细胞中的特定表面标志物。C 、 CD、三和 TCR β 用作 T 细胞的标志物，以确定用 Notch 配体 DL one 刺激 IPS 细胞是否有助于 T 细胞 CD 四和 CD 八细胞表面表达 CD 三阳性 TCR r β 阳性 IPS 细胞衍生细胞。

请注意右侧的点图，它显示了第 22 天的 CD、3 个阳性 TCR、R、β 阳性、CD、4 个阴性 CD、8 个阳性、单个阳性 T 细胞，这些 T 细胞是在体外产生的。此外，来自上图的 IPS 细胞衍生的单个阳性细胞在体外受到平板包被的抗 CD 3 和可溶性抗 CD 28 抗体刺激时产生白细胞介素 2 和干扰素 γ，证实 IPS 细胞衍生的 T 细胞在过继转移到受体小鼠后具有功能。大多数 TCR 基因转导的 IPS 细胞分化为 CD 8 阳性 CTL，这些 CLL 通过从合并的淋巴结和脾细胞在这些点图中分泌白细胞介素 2 和干扰素 γ 在体外对肽刺激做出反应。

CD 8 阳性 V β 5 阳性 T 细胞在过继转移的 TCR 转导而非对照转导的 IPS 细胞的小鼠中产生。与阴影同种型对照直方图相比，CD 8 阳性 V β 5 阳性群体的白细胞介素 2 细胞因子染色和干扰素 γ 产生呈阳性，在这些直方图中用暗线表示，表明 IPS 衍生的 CTL 是功能性的。这些数据显示，用肽脉冲的 CFSE 高细胞由每张图中右侧的峰值表示，CFSE 低对照细胞由左侧的峰值表示，这些细胞在 IPS 细胞转移后 10 周或 O OT 一次 CTL 转移后 1 天注射到小鼠中。

抗原特异性 IPS 衍生的 CTL 对抗原刺激有反应，并且具有细胞毒活性，如此处不存在 CFSE 高细胞所示。将 OT 1 个 TCR 基因转导的 IPS 细胞过继转移到 C 57 黑 6 只小鼠中，然后用 EEG 攻击小鼠，第 20 天点数腹膜腔内肿瘤细胞 7 个肿瘤细胞。请注意，与对照组相比，接受 TCR 转导 IPS 的小鼠的肿瘤细胞数量显着减少。

最重要的是，TCR 转导的 IPS 细胞的过继转移触发了过反应性 CTL 浸润到肿瘤组织中，并保护动物免受肿瘤攻击，如肿瘤组织在肿瘤攻击后第 30 至 35 天恢复的 h 和 e 染色所见，这些肿瘤组织来自过继转移 TCR 转导细胞或 OT one CTL 但未模拟注射或对照的小鼠。转导的细胞被炎性细胞浸润，如此处的红色箭头所示。发现 Ova 特异性 V alpha 两个阳性 CTLs（红色）浸润表达 ova 的肿瘤组织（绿色）。

虽然在该图中来自对照组的小鼠中的肿瘤较少或没有肿瘤浸润细胞，但在对 CD 8 阳性群体设门后，通过流式细胞术分析来自肿瘤组织的单细胞悬液的 V alpha 2 阳性和 V β 5 阳性的表达。请注意，用 TCR 转导的 IPS 细胞过继转移的小鼠的肿瘤组织表现出最高水平的肿瘤浸润细胞，而来自接受对照的小鼠的肿瘤。转导的 IPS 未表现出卵特异性 CD 8 阳性 T 细胞的浸润。

观看此视频后，您应该对如何从 IPS 细胞生成抗原特异性 T 细胞以及如何评估 IPS 衍生的 T 细胞的功能有很好的了解。