诱导多能干细胞向T淋巴细胞的定向分化

本实验的总体目标是从诱导性多能干细胞（iPS细胞）中生成并表征T淋巴细胞。这些iPS细胞可在体外通过OP9-DL1共培养系统进行分化，随后在rag缺陷型小鼠体内完成成熟；或者，可对细胞进行基因改造，使其过表达OT-I T细胞受体（TCR），然后通过过继转移实现体内发育。

经过六周的体内分化后，可通过腹腔注射 EEG7 肿瘤细胞对小鼠进行攻击，随后可评估由诱导性多能干细胞（IPS）衍生的 T 细胞的抗原特异性。最终，IPS 细胞可分化为常规 T 细胞和抗原特异性 T 细胞，后者能够保护动物抵抗肿瘤攻击。该技术的应用前景拓展至个体化癌症免疫治疗领域。

该方法能够利用极少量的患者血液或皮肤组织生成大量肿瘤反应性T细胞。在第0天，将5×10⁴个iPS细胞接种至一个100毫米培养皿中，该培养皿内含有融合的OP9-DL1细胞单层，并使用含20%胎牛血清（FBS）的α-MEM培养基。在第5天，用胰蛋白酶消化后离心收集细胞，将细胞在新鲜的100毫米培养皿中于37°C孵育30分钟，随后将5×10⁵个悬浮细胞接种至新的100毫米培养皿中，该培养皿含有OP9-DL1细胞单层，培养基为含20% FBS的α-MEM，并添加小鼠Flt3配体。在第8天，轻轻吹打收集松散贴壁的细胞，离心后将细胞转移至六孔培养板中的一个孔内，该孔预先包被有融合的OP9-DL1细胞单层。将细胞在37°C、5%二氧化碳条件下继续培养两周。在第22天进行后续操作。

将分离的IPS细胞置于新鲜培养基中，在新的培养皿内于37摄氏度孵育30分钟。随后移除约一半的悬浮细胞，通过70微米尼龙滤网过滤以去除细胞团块，并用预冷的PBS洗涤所得的单细胞悬液三次。第三次洗涤后，将细胞重悬于PBS中，浓度为每毫升1.5 × 10⁷个细胞，并在冰上保存，待静脉注射使用。

将一只四周大的rag缺陷小鼠置于红外灯下以扩张尾静脉。然后用26.5号针头的1毫升注射器吸取200微升细胞悬液，通过扩张的尾静脉进行过继性细胞转移。在确认过继转移小鼠安乐死后三周，机械破碎组织后取出淋巴结和脾脏。

用CK裂解缓冲液裂解单细胞悬液，随后用预冷的PBS洗涤所得的单核细胞两次。在第0天，对细胞表面标志物进行染色后，通过流式细胞术分析细胞；第1天，使用基因JAMA转染试剂，对前一晚已铺板的Plat E包装细胞进行OT-1 MIDR转染；第2天，将1×10⁶个iPS细胞接种至经0.1%明胶预包被的24孔板中的一个孔内，收集Plat E细胞中含S natin的假病毒，经离心后通过0.4微米滤器过滤以去除潜在污染物，在32摄氏度、330×g条件下，于多聚素存在下转导细胞一小时。

重复转导步骤后，在相同温度下过夜孵育。在第4天用胰蛋白酶处理转导的iPS细胞，离心后将细胞重悬于新鲜培养基中，并接种至预先辐照的SNL 767饲养层细胞上。当转导的细胞达到汇合状态时，通过流式细胞术分选GFP和DS Red双阳性细胞。

在过继转移IPS细胞六周后，于肿瘤攻击实验的第50天，向同一只小鼠的腹腔内注射50微升EEG七索玛细胞。使用Mil E Biotech CD8阳性T细胞分离试剂盒，从过继转移动物的脾脏和淋巴结中分选CD8阳性T细胞。将分离得到的CD8阳性T细胞与来自未经处理的C57BL/6J小鼠的经辐照SPOC细胞按1:10的比例混合，并在共培养体系中加入0.5微摩尔/毫升的OVA，刺激40小时。

随后，向细胞中加入felden A，继续孵育四小时。最后，在从未经处理的C57BL/6J小鼠中分离出SP细胞后，将细胞悬液分为两组，并通过流式细胞术分析细胞群体。

用5 µmol/mL的CFSE标记CFSE高表达组，并用10 µg/mL的ova肽脉冲处理细胞1小时；用0.5 µmol/mL的CFSE标记CFSE低表达组，不进行脉冲处理。将2.5 × 10⁶个CFSE高表达细胞与2.5 × 10⁶个CFSE低表达细胞在PBS中混合，然后通过流式细胞术分析细胞的CFSE表达情况。

在将细胞过继转移至目标小鼠后的16小时，于肿瘤攻击实验的第20天计数腹腔内肿瘤细胞。使用装有18.5号针头的10毫升注射器及冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗腹腔。计数回收的肿瘤细胞，以鉴定肿瘤浸润细胞。

在肿瘤攻毒实验的晚期阶段取出肿瘤，然后将肿瘤切成三块。将第一块肿瘤放入冻存管中，并将冻存管置于干冰上。立即用甲醛固定第二块肿瘤组织。

在冻存的组织切片空气干燥后，将其第三部分保存于条件性 RPMI 1640 培养基中。将固定后的切片再次空气干燥 15 分钟，随后在冷丙酮中固定 15 分钟。固定完成后，用 PBS 洗涤载玻片 5 分钟。

将切片置于湿盒中，加入30微升含3% BSA的PBS溶液，室温孵育30分钟以封闭非特异性结合位点。随后吸除封闭液，于湿盒中加入50微升稀释于含3% PSA的PBS中的pe抗TCR RVα2抗体与fitc抗ova抗体混合液，孵育2小时。孵育结束后，用冷PBS洗涤切片3次，最后使用水性封片剂封片，进行荧光显微镜观察及肿瘤浸润T细胞的流式细胞术分析。

将肿瘤压碎成单细胞悬液，然后分析细胞的特异性表面标志物。CD3 和 TCRβ 作为T细胞的标志物，用于检测IPS细胞经Notch配体DL1刺激后，是否能够促进CD3阳性、TCRβ阳性IPS细胞来源细胞表达T细胞表面标志物CD4和CD8。

注意右侧的点图，其显示了由iPS细胞在体外生成的第22天CD3阳性、TCRβ阳性、CD4阴性、CD8阳性单阳性T细胞。此外，前图中由iPS细胞衍生的单阳性细胞在体外经抗CD3包被培养板及可溶性抗CD28抗体刺激后，能够分泌白细胞介素-2和干扰素-γ，证实这些由iPS细胞衍生的T细胞在过继性移植至受体小鼠后具有功能活性。大多数经TCR基因转导的iPS细胞分化为CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），在肽段刺激下，这些来自汇集的淋巴结和脾细胞的点图显示其在体外可分泌白细胞介素-2和干扰素-γ。

在过继转移了TCR转导的iPS细胞而非对照转导的iPS细胞的小鼠中，生成了CD8阳性Vβ5阳性T细胞。CD8阳性Vβ5阳性细胞群对细胞内细胞因子染色呈阳性，可产生白细胞介素-2和干扰素-γ，如直方图中深色线条所示，而阴影部分的同型对照直方图则显示阴性，表明iPS来源的CTL具有功能活性。这些数据表明，在iPS细胞转移后10周或OVA特异性CTL转移后1天，将用肽段致敏的CFSE高表达细胞（各图中右侧峰所示）和CFSE低表达的对照细胞（各图中左侧峰所示）注射入小鼠体内。

抗原特异性的iPS来源的CTL在抗原刺激下产生应答，并表现出细胞毒性活性，表现为此处CFSE高荧光细胞的缺失。将转导了OT-I TCR基因的iPS细胞过继转移至C57BL/6小鼠体内，随后在第20天用EG7肿瘤细胞进行攻击，随后计数腹腔内的肿瘤细胞。请注意，接受TCR转导iPS细胞的小鼠肿瘤细胞数量较对照组显著减少。

最重要的是，过继性转移经 TCR 转导的 iPS 细胞可诱导过度活化的 CTL 浸润肿瘤组织，并保护动物免受肿瘤攻击，这一点在肿瘤攻击后第 30 至 35 天回收的肿瘤组织的 H&E 染色中可见：接受 TCR 转导细胞或 OT-I CTL 过继转移的小鼠肿瘤组织出现浸润，而模拟注射或对照组小鼠则无此现象。经转导的细胞被炎性细胞浸润，如图中红色箭头所示。在表达 OVA 的绿色肿瘤组织中，检测到特异性识别 OVA 的红色 Vα2 阳性 CTL 浸润。

尽管对照组小鼠的肿瘤在此图中显示较少或没有肿瘤浸润细胞，但通过流式细胞术分析了来自肿瘤组织的单细胞悬液，在圈选CD8阳性细胞群后，检测其Vα2阳性和Vβ5阳性表达情况。需要注意的是，接受TCR转导的iPS细胞过继转移的小鼠其肿瘤组织中肿瘤浸润细胞水平最高，而接受对照转导iPS细胞的小鼠肿瘤中则未见卵清蛋白特异性CD8阳性T细胞的浸润。

观看本视频后，您应能够充分理解如何从诱导多能干细胞（IPS细胞）生成抗原特异性T细胞，以及如何评估IPS细胞来源T细胞的功能。