Name: 人多能干细胞对原始和最终造血祖细胞定向分化的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: 学习利用阶段性WNT信号调控技术，将人多能干细胞定向分化为CD34+造血祖细胞的方法。该技术可分别诱导原始或最终造血程序，为研究人类造血发育机制提供可靠实验方案。

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本工作得到了华盛顿大学医学院内科系血液学部的支持。CD 获得美国国家心肺血液研究所 T32HL007088 项目的支持。CMS 获得美国血液学会学者奖的支持。

1. 试剂
<ol>
	<li>获取细胞系：hESC 或 hiPSC1、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）29、OP9-DL4 基质细胞30,31。</li>
	<li>试剂准备
	<ol>
		<li>配制 0.1% w/v 的明胶 PBS 溶液。经高压灭菌后分装，4 °C 保存。
		<ol>
			<li>准备明胶包被的塑料器皿。用 1.5 mL 0.1% 明胶溶液包被 6 孔板，室温孵育 15 分钟。使用前立即吸除残留的明胶溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制 MEF 培养基：将 IMDM 与 15% v/v FBS 和 1x&#160;抗生素混合。使用前补充 2 mM L-谷氨酰胺和 400 µM 巯基甘油（MTG），4 °C 保存。</li>
		<li>配制 hPSC 培养基：将 DMEM/F12 与 20% v/v 去除血清替代物（KOSR）、1x&#160;非必需氨基酸（NEAA）、1x&#160;抗生素、55 µM β-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺和 10 ng/mL bFGF 混合。用 2 µm 滤器过滤除菌，避光保存于 4 °C。</li>
		<li>配制无血清洗涤培养基（Wash media）：将 DMEM/F12 与 5% v/v KOSR 和 4 mM HCl 混合。用 2 µm 滤器过滤除菌，分装后避光保存于 4 °C。</li>
		<li>将 DNase I 在冰上用预冷的无菌去离子水中溶解 3–4 小时，配制成 1 mg/mL 的 DNase I 溶液。用 2 µm 滤器过滤除菌，分装后保存于 -20 °C。</li>
		<li>配制终止液（STOP 溶液）：在洗涤培养基中加入 10% FBS 和 10 µg/mL DNase I。终止液需在使用前立即配制。</li>
		<li>配制基底膜基质（例如，Matrigel，以下简称 MAT）混合液。 
		注：所有 MAT 混合液的配制和使用步骤均需在冰上或 4 °C 下进行。将冷冻的 MAT 在 4 °C 冰上过夜融化。加入 10 mL 预冷的 IMDM 将 MAT 按 1:1 稀释，并在 4 °C 冰上过夜冷藏。再加入额外的 20 mL 预冷 IMDM 进一步稀释，并在 4 °C 冰上过夜冷藏。分装至预冷的离心管中，-20 °C 保存备用。使用前需在 4 °C 过夜融化。
		<ol>
			<li>包被 MAT 细胞培养板。 
			注：所有 MAT 板的包被步骤均需在冰上进行。将 6 孔板和 24 孔板预冷至 -20 °C 至少 1 小时。准备包被时，将板置于冰上。每孔加入 4 倍稀释的 MAT，吸除多余液体并可重复使用。冰上孵育 30–60 分钟后，吸除多余 MAT。将包被好的板在 37 °C、5% CO2 培养箱中干燥至少 3 小时。包被后 72 小时内使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将 10% w/v 的牛血清白蛋白（BSA）溶于预冷的蒸馏去离子水中，4 °C 下搅拌 3–4 小时。用 2 µm 滤器过滤除菌，装入避光瓶中，4 °C 保存。</li>
		<li>配制抗坏血酸溶液：将 L-抗坏血酸缓慢溶于预冷的蒸馏去离子水中，终浓度为 5 mg/mL，冰上搅拌 3–4 小时，间歇轻摇至完全溶解。用 2 µm 滤器过滤除菌，分装后保存于 -20 °C。</li>
		<li>配制无血清分化培养基（SFD）：将 IMDM 与 Ham's F-12 按 75:25 混合，加入 0.5% BSA、1x&#160;B27 和 0.5x&#160;N2 补充剂，4 °C 保存。使用前立即加入 1x&#160;L-谷氨酰胺、50 µg/mL 抗坏血酸、400 µM MTG 和 150 µg/mL 全转铁蛋白。</li>
		<li>根据制造商说明配制无血清干细胞培养基（例如，StemPro，以下简称 SP34），4 °C 保存。使用前立即加入 1x&#160;L-谷氨酰胺、50 µg/mL 抗坏血酸、400 µM MTG 和 150 µg/mL 全转铁蛋白。</li>
		<li>将胶原酶 II 溶于 1:4 FBS:PBS 溶液中，配制成终浓度为 0.2% w/v 的胶原酶 II 溶液。在 37 °C 水浴中溶解至少 15 分钟。用 2 µm 滤器过滤除菌，分装后保存于 -20 °C。</li>
		<li>使用前立即配制流式细胞分选（FACS）缓冲液：将 5% FBS 溶于 IMDM 中。</li>
		<li>配制 OP9 培养基：将 α-MEM 与 20% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和 1x&#160;抗生素混合。用 2 µm 滤器过滤除菌，4 °C 保存。</li>
		<li>获取基于甲基纤维素的培养基（例如，MethoCult，以下简称 MeC），可为预分装的 3 mL 规格或 100 mL 瓶装。若使用 100 mL MeC，到货后立即分装为每管 2.5 mL 至 14 mL 圆底离心管中。 
		注：所有分装样品均应保存于 -20 °C。MeC 培养基需在使用前立即解冻。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 人多能干细胞的中胚层分化
<ol>
	<li>将hPSC细胞系在MEFs上培养至70 - 80%汇合度，置于37 °C、含5% CO₂的培养箱中2. 
	注意：人多能干细胞（hPSCs）应具有清晰、未分化的边缘。</li>
	<li>在传代人多能干细胞（hPSCs）前24小时，准备经MAT包被的塑料器皿。 
	注意：不同hPSC细胞系所需的MAT包被6孔板总数有所差异。通常情况下，每6孔板在MEFs上汇合的hPSCs需要三个MAT包被的6孔板。
	<ol>
		<li>以不同比例的融合hPSC：MAT孔进行试用饲养层耗竭实验（1:4，1:3，1:2） 等等。在首次诱导分化前进行计数，以确定后续分化所需的MAT包被6孔板数量。 
		注意：接种至 MAT 后 24 小时，hPSCs 应达到 80 - 90% 汇合度，细胞集落大小约为 10 - 20 个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸弃hPSC培养基，每孔加入1 mL 37 °C的0.25%胰蛋白酶-EDTA，作用1分钟。吸弃胰蛋白酶-EDTA，每孔加入1 mL STOP培养基。使用细胞刮，将细胞从培养板上刮下。每孔加入1 mL洗涤缓冲液。
	<ol>
		<li>使用 2 mL 血清学移液管吹打 3 - 5 次，以分散细胞团块，并将细胞转移至 50 mL 锥形管中。在 330 x g 条件下离心 hPSCs 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞重悬于与待使用的 MAT 包被器皿每孔相当的 hPSC 培养基中，总体积为每孔 2 mL。向器皿每孔加入 2 mL hPSC 细胞悬液，并在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中过夜培养。2.</li>
	<li>24 小时后，吸去培养基，加入 37 °C 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，孵育 1 分钟。吸去胰蛋白酶-EDTA 溶液，每孔加入 1 mL STOP 培养基。用细胞刮充分刮取细胞。每孔加入 1 mL WASH 培养基。用 2 mL 血清移液管将细胞吹打 1–2 次，转移至 50 mL 锥形离心管中。在 220 × g 条件下离心 5 分钟。 
	注意：胰蛋白酶-EDTA处理时间的长短应由研究者针对每种hPSC细胞系自行确定。胰蛋白酶处理应持续尽可能长的时间，但不得引起单细胞解离。此步骤应使所有hPSC从MAT包被的培养板上脱落，但不产生单细胞解离。所形成的EBs平均应为6–10个细胞。</li>
	<li>吸弃培养基。用5 mL血清移液管在20 mL洗涤培养基中轻柔重悬细胞。以220 × g离心5分钟。</li>
	<li>轻轻将EBs重悬于第0天培养基中（表1）。使用10 mL血清移液管，将含有拟胚体的2 mL分化培养基加入6孔低黏附细胞培养板的每个孔中。置于37 °C、5% CO₂培养箱中培养2 5% O₂2 （多气体）培养箱 
	注意：第0天培养基：SFD培养基添加10 ng/mL BMP4（表1每两板hPSCs使用一个6孔低黏附细胞培养皿。</li>
	<li>24小时后，加入2 mL第1天培养基（表1)。将细胞在多气体培养箱中孵育过夜。 
	注意：第1天培养基：每孔加入含10 ng/mL BMP4和10 ng/mL bFGF的SFD培养基表1).</li>
	<li>18小时后，用5 mL血清移液管轻轻收集拟胚体，100 × g离心5分钟。用10 mL IMDM培养基洗涤并合并整个培养物，100 × g离心5分钟，吸除上清液。 
	注意：培养物中会存在碎片。此低速离心步骤（100 × g）可去除碎片。</li>
	<li>轻轻重悬EBs于添加了第2天培养基（表1）的SFD培养基中，随后每孔加入2 mL，分装至6孔低黏附细胞培养板中。于37 °C多气体培养箱中孵育30 h。 
	注意：第2天培养基：10 ng/mL BMP4、5 ng/mL bFGF，以及适当的WNT激动剂或拮抗剂（表1).
	<ol>
		<li>加入3 µM CHIR99021以诱导定型性造血祖细胞。或者，加入3 µM IWP2和1 ng/mL Activin A以诱导原始造血祖细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>继续进行第3节造血祖细胞特化。</li>
</ol>
3. CD34+ 造血祖细胞的鉴定
<ol>
	<li>分化第3天，用2 mL移液管在30小时后分离拟胚体（EBs），转移至50 mL锥形管中，在330 × g条件下离心5分钟。用10 mL IMDM培养基轻柔重悬并洗涤，再次在330 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>将拟胚体重悬于第3天培养基（表2）中，并将2 mL分装至低黏附6孔板的每孔中。在37 °C多气体培养箱中培养72小时。 
	注意：第3天培养基为SP34培养基，添加15 ng/mL VEGF和5 ng/mL bFGF（表2）。若分化第3天收集的培养基pH发生显著变化（即，培养基变为黄橙色），则每孔添加更多培养基。或者，在第0天减少每孔的拟胚体数量。</li>
	<li>培养72小时后，向每孔加入2 mL第6天培养基（表2）。在37 °C多气体培养箱中继续培养额外48小时。 
	注意：第6天培养基为SP34培养基，添加15 ng/mL VEGF、5 ng/mL bFGF、200 ng/mL SCF、4 IU EPO、20 ng/mL IL-6、10 ng/mL IL-11和50 ng/mL IGF-1（表2）。若在步骤3.1中添加了更多培养基，则在步骤3.2中应加入等量的培养基，以保持最终细胞因子浓度不变。</li>
	<li>在分化第8天分离经CHIR99021处理的拟胚体。进入第4节操作。</li>
	<li>在分化第8天收获经IWP2处理的拟胚体至50 mL锥形管中，在330 × g条件下离心5分钟。用第8天培养基（表2）轻柔重悬，于低黏附培养皿中在37 °C、5% CO2培养箱中继续培养24小时。进入第4节操作。 
	注意：第8天培养基为SP34培养基，添加100 ng/mL SCF、2 IU EPO、10 ng/mL IL-6、5 ng/mL IL-11、25 ng/mL IGF-1、30 ng/mL TPO、10 ng/mL Flt3-L和30 ng/mL IL-3（表2）。</li>
</ol>
4. 胚状体的酶解离与造血祖细胞的分离
<ol>
	<li>用移液管将拟胚体（EBs）转移至50 mL锥形管中。以330 × g离心5分钟，吸除上清液。</li>
	<li>向拟胚体（EBs）中加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，涡旋振荡5秒。置于37 °C水浴中孵育8分钟。加入5 mL终止液（STOP solution），以330 × g离心5分钟，吸除上清液。</li>
	<li>用5 mL胶原酶II（Collagenase II）重悬拟胚体（EBs），涡旋振荡5秒后置于37 °C水浴中孵育。60分钟后再次涡旋振荡5秒，并加入5 mL终止液（STOP solution）。以330 × g离心5分钟，吸除上清液。</li>
	<li>用1 mL FACS缓冲液重悬细胞，通过40 µm细胞滤网过滤，以去除未完全解离的细胞团块。</li>
	<li>计数细胞。取1 × 106个细胞分装至14 mL锥形管中，以330 × g离心5分钟。用FACS缓冲液重悬细胞至终浓度为5 × 106个细胞/mL。将每种实验条件下10%的细胞分装并混合，用于流式细胞术的荧光补偿对照。将细胞与抗体在冰上避光孵育30分钟。 
	注：建议的荧光染料组合见材料表。
	<ol>
		<li>对于IWP2处理的细胞，使用抗CD34和抗CD43抗体。</li>
		<li>对于CHIR99021处理的细胞，使用抗CD34、抗CD43、抗CD73和抗CD184抗体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用FACS缓冲液洗涤细胞两次，每次以330 × g离心5分钟。将细胞重悬至终浓度为5 × 106个细胞/mL。</li>
	<li>通过流式细胞术分析或分选细胞。对于原始造血祖细胞，分析CD34和CD43的表达水平（图2A）；对于定型造血祖细胞，通过流式细胞术（FACS）分选内皮-造血过渡细胞（HE，表型为CD34+CD43−CD73−CD184−）（图2B），并将细胞收集至含有预冷FACS缓冲液的收集管中。</li>
	<li>为评估分选出的HE细胞的定型造血潜能，可继续进行第5节的内皮-造血转化实验，或第7节的T淋巴细胞分化检测。对于原始造血集落形成细胞（CFC）检测，请继续进行第6节。</li>
</ol>
5. 内皮细胞向造血细胞转变
<ol>
	<li>将分离的 CD34+CD43−CD73−CD184− 细胞以 330 x g 离心 5 分钟。用 HE 培养基重悬细胞至浓度为 200,000 个细胞/mL&#160;（表 2）。将细胞以每孔 50 µL 分装至 96 孔低黏附细胞培养板中。于 37 °C、5% CO2、5% O2 多气体培养箱中过夜培养。 
	注意：HE 培养基：SP34 培养基添加 5 ng/mL VEGF、5 ng/mL bFGF、100 ng/mL SCF、2 IU EPO、10 ng/mL IL-6、5 ng/mL IL-11、25 ng/mL IGF-1、30 ng/mL TPO、10 ng/mL FLT3-L、30 ng/mL IL-3、10 ng/mL BMP4、20 ng/mL SHH、10 µg/mL 血管紧张素 II 和 100 µM 氯沙坦钾，细胞密度为 2 × 105 个细胞/mL（表 2）。</li>
	<li>根据需要准备 24 孔 MAT 包被板（见步骤 1.2.7.1）。</li>
	<li>细胞将在过夜后聚集成每团 6–10 个细胞的细胞簇。次日早晨，将每份 50 µL 重聚的细胞轻柔转移至 24 孔 MAT 包被板的中央。将培养板轻柔放入 37 °C 多气体培养箱中孵育 4–6 小时，直至细胞贴壁。</li>
	<li>细胞贴壁后，向每孔加入 1 mL 新鲜 HE 培养基。在 37 °C、5% CO2、5% O2 多气体培养箱中继续培养，直至可见造血细胞出现（通常为 5–7 天；图 2D）。使用光学显微镜在 100 倍放大下观察。</li>
	<li>通过轻柔移除细胞上的 HE 培养基来收获确定性造血祖细胞。将该培养基通过 40 µm 细胞滤网过滤并收集。向孔中贴壁的细胞加入 0.5 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 孵育 5 分钟。向每孔加入 0.5 mL 终止液。将细胞悬液通过同一 40 µm 滤网，以合并所有贴壁和非贴壁细胞。以 330 x g 离心 5 分钟。
	<ol>
		<li>为评估该批量培养物的集落形成能力（CFC），进入第 6 节。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 FACS 缓冲液洗涤细胞两次。以 330 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于 FACS 缓冲液中，浓度为 5 × 106 个细胞/mL。在冰上避光条件下，使用抗 CD45 和抗 CD34 抗体对细胞染色 30 分钟（推荐的荧光染料见 材料表）。</li>
	<li>用 FACS 缓冲液洗涤细胞两次。以 330 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>通过 FACS 分离 CD34+CD45+ 细胞（图 2E）。将细胞分选至预冷的 FACS 缓冲液中。</li>
	<li>根据需要评估确定性 CD34+CD45+ 造血祖细胞（第 6 节进行集落形成单位检测，第 7 节评估淋巴系潜能，或其他研究者自主设计的检测方法）。</li>
</ol>
6. CFC 实验
<ol>
	<li>为每个用于CFC实验的样品解冻一份MeC。</li>
	<li>将待检测的细胞（步骤4.5、4.7、5.5或5.9）加入MeC中，充分涡旋混匀，并按照制造商说明，将MeC培养物静置5–10分钟，直至气泡消散。使用装有16½号针头的3 mL注射器，小心吸取2 mL MeC。 
	注意：典型的铺板密度范围为1,000–20,000个细胞/mL，具体取决于预期的前体细胞频率。</li>
	<li>小心地将1 mL MeC细胞混合液分别加入两个35 mm组织培养皿中。通过轻轻敲击和旋转培养皿，使MeC在35 mm培养皿中均匀分布。将上述每个培养皿置于盛有水的15 cm组织培养皿中。在37 °C、5% CO2培养箱中孵育。</li>
	<li>使用光学显微镜在40X&#160;放大倍数下观察MeC培养物。对获得的不同类型的CFC进行定量。在铺板后8–10天分析原始型CFC实验（图2C）；在铺板后14天分析确定型CFC实验。代表性CFC实验的克隆形态见图2F。</li>
</ol>
7. 建立确定性造血潜能的T细胞检测实验
<ol>
	<li>在100 mm细胞培养皿中将OP9-DL4细胞培养至融合30,31,32.
	<ol>
		<li>在接种T细胞实验前72至96小时解冻OP9-DL4细胞。将OP9-DL4细胞重悬于10 mL OP9培养基中，分装至10 cm培养皿。于37 °C、5% CO₂培养箱中培养。2 孵育至70%–90%汇合度。</li>
		<li>从100 mm培养皿中收获OP9-DL4细胞时，移除培养基，加入5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，作用5分钟。加入5 mL OP9培养基以终止胰蛋白酶活性。在330 × g离心5分钟。用1 mL OP9培养基重悬细胞，并进行细胞计数。 
		注意：一个10 cm培养皿的汇合OP9-DL4细胞可获得约10 × 10⁶个细胞。6 OP9-DL4 细胞</li>
		<li>T细胞实验前48小时，接种2 × 106 在24孔板中每孔加入0.5 mL OP9培养基，共12 mL，接种细胞。于37 °C、5% CO₂条件下培养2 培养箱</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步骤 4.5、4.7、5.5 或 5.9 中获得的 2,000 - 10,000 个待检测细胞加入含 OP9 培养基的一孔 OP9-DL4 细胞中，培养基中添加以下成分：30 ng/mL SCF（仅前 6 天使用）、5 ng/mL IL-7 和 5 ng/mL FLT3-L。于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养2 培养箱中孵育。此步骤不更换培养基。</li>
	<li>每4至5天，将T细胞前体传代至6孔板中新鲜的OP9-DL4基质细胞上。用1 mL移液器吹打细胞，并通过40 µm滤膜去除细胞团块。以330 × g离心5分钟。吸除上清液。用2 mL新鲜OP9培养基重悬细胞，该培养基添加有5 ng/mL IL-7和5 ng/mL Flt3-L，然后将细胞接种至新鲜的OP9-DL4细胞上。 
	注意：传代前 48 小时，接种 2 × 106 将新鲜的OP9-DL4细胞加入12 mL OP9培养基中，每孔2 mL分装至6孔板。</li>
	<li>共培养至少21天后，剧烈吹打细胞，通过40 µm滤网以去除细胞碎片。在330 x g下离心5分钟，吸除上清液。</li>
	<li>用预冷的FACS缓冲液洗涤细胞两次，330 × g离心5分钟。</li>
	<li>用 FACS 缓冲液重悬细胞，浓度为 5 x 106 细胞/mL。在冰上避光孵育30分钟，用抗-CD45、抗-CD56、抗-CD4和抗-CD8抗体对细胞进行染色（建议的荧光染料组合见于 材料表）。加入活/死细胞染色剂（DAPI， 等等。以去除分析中的碎片。</li>
	<li>用 FACS 缓冲液洗涤细胞两次，330 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>使用流式细胞仪分析细胞，以检测T淋巴细胞前体的存在（图3).</li>
</ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li>
<li>Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+of+human+haematopoietic+development+from+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A view of human haematopoietic development from the Petri dish.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).</li>
<li>Chen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythroid%2Fmyeloid+progenitors+and+hematopoietic+stem+cells+originate+from+distinct+populations+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).</li>
<li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Sources+of+Hematopoietic+Progenitors+Emerge+before+HSCs+and+Provide+Functional+Blood+Cells+in+the+Mammalian+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo.</a> Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).</li>
<li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+definitive+erythroid+lineage+with+unique+regulation+of+the+beta-globin+locus+in+the+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo.</a> Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).</li>
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<li>Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+erythroid+and+myeloid+progenitors+in+the+yolk+sac+and+embryo+proper+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse.</a> Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).</li>
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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本方案描述了一种快速、无血清、无基质细胞的分化方法，可用于生成原始型或定型造血祖细胞。利用本方案可稳定实现原始型或定型造血祖细胞的中胚层特化，其独特之处在于使用了经典WNT信号通路的小分子抑制剂。通过GSK3β抑制剂CHIR9902133进行阶段特异性WNT激活，可诱导生成定型造血中胚层；而使用PORCN抑制剂IWP234抑制WNT信号，则可指定生成原始造血中胚层26。值得注意的是，该方法尚不能有效产生具有移植能力的类造血干细胞群体（未展示）。然而，采用此方法获得的定型造血祖细胞可通过转基因手段赋予其移植潜能35，显示出其在未来转化应用中的潜力。
成功进行hPSC分化的关键因素之一是hPSC形成的拟胚体（EB）的初始大小。理想情况下，EB应由约6至10个细胞组成。如果EB过大，分化培养物可能会异常地同时启动多种分化程序，这可能是由于EB内部信号激活不恰当所致。应在分化开始后的前24小时内对分化...

人类多能干细胞（hPSCs）包括人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导多能干细胞（hiPSCs），在适当的生长条件下不仅具有自我更新的能力，还能够分化为起源于三个胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的所有细胞类型1由于这些独特的能力，人多能干细胞在再生医学、疾病建模和细胞治疗方面具有广阔的应用前景2尽管已成功从人多能干细胞（hPSCs）分化出多种细胞类型，但一个重大挑战是 体外 特异性生成具有成体特征的人多能干细胞来源的造血干细胞（HSCs）及定型造血祖细胞。
从人多能干细胞（hPSCs）发育出人造血干细胞（HSCs）的一个可能障碍，是人类胚胎内存在多种造血程序3。最早出现的程序被称为&#34;原始造血"，起源于胚外卵黄囊组织，其特征主要表现为短暂产生红系爆发形成单位前体细胞（EryP-CFC）、巨噬细胞和巨核细胞。值得注意的是，该程序不会产生HSCs，也不会产生T细胞和B细胞淋巴系前体细胞。然而，卵黄囊会短暂地产生一些受限的确定型造血前体细胞，例如红髓系前体细胞（EMP4,5,6,7,8）以及红系缺陷型淋巴系倾向多能前体细胞（LMPP9）。然而，无论是EMP还是LMPP都不具备完全的多向分化潜能，也无法在成年受体中实现类似HSC的植入能力。相比之下，在发育后期，经典的&#34;确定型&#34;造血程序在胚胎本体的主动脉-性腺-中肾区被特化，产生包括HSC在内的所有成体造血谱系。这些胚内确定型造血细胞的特化过程以Notch信号依赖的方式进行，通过生血内皮（HE）经历内皮-造血转化而实现3,10,11,12,13,14。除了重建能力外，这些细胞的多谱系潜能及其对Notch信号的依赖性也可用于将其与EMP和LMPP区分开来（详见参考文献3,13）。
阐明人多能干细胞（hPSCs）向原始型和定型造血细胞分化的调控机制，对于在不同hPSC细胞系中可重复地生成定型造血祖细胞可能至关重要。直到最近，尚无能够分离出多能性原始型与定型造血祖细胞的hPSC分化方案15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25。许多采用胎牛血清（FBS）和/或基质细胞共培养的方法首次揭示了hPSC分化具有造血潜能，但其产生的细胞混合物同时包含原始型和定型造血潜能15,16,17,19,22,23,25。此外，许多无血清的造血分化方案已描述了从hPSCs诱导生成具有造血潜能的中胚层所需的信号通路要求18,20,21,24。然而，由于这些方法仍会产生两种程序的异质性混合物，其在临床应用及发育机制研究中的用途可能受限。
我们近期在这些研究基础上进一步阐明了从人多能干细胞（hPSC）来源的中胚层向原始和定型造血细胞分化过程中，ACTIVIN/NODAL 和 WNT 信号通路在不同阶段的特异性信号需求18,26。其中尤为独特的是，通过在特定阶段调控 WNT 信号通路，可以选择性地诱导生成仅具有原始造血潜能或仅具有定型造血潜能的造血前体细胞26。在中胚层特化阶段，使用 PORCN 抑制剂 IWP2 抑制经典 WNT 信号通路，可诱导生成 CD43+ 红系集落形成细胞（EryP-CFC）和髓系前体细胞，但未检测到淋巴系潜能。与此形成鲜明对比的是，在相同分化阶段使用 GSK3β 抑制剂 CHIR99021 激活经典 WNT 信号通路，则完全未检测到 CD43+ EryP-CFC 的生成，同时诱导出 CD34+CD43− 血管内皮（HE）细胞群。该细胞群具有髓系、表达 HBG 的红系以及 T 淋巴系分化潜能。后续分析发现，此类 HE 细胞不表达 CD7327,28 和 CD18428，且其造血潜能依赖于 NOTCH 信号28。此外，单细胞克隆分析表明，这些定型造血谱系可源自具有多向分化潜能的单个细胞28。综上所述，这些研究结果表明，通过在特定阶段调控 WNT 信号通路，可选择性地获得纯化的原始造血前体细胞，或获得依赖 NOTCH 信号的多能性定型造血前体细胞。
本文概述了我们的分化策略，该策略通过在中胚层模式形成过程中调控经典WNT信号通路，从而特异性地生成原始型或确定型造血祖细胞，并介绍了其下游的造血谱系检测方法。本方案对于致力于通过人多能干细胞（hPSCs）产生原始型或确定型造血祖细胞并将其应用于再生医学研究的研究人员具有重要价值。

<table><tbody><tr><td>伊氏改良杜尔贝科培养基（IMD）</td><td>Corning</td><td>10-016</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），胚胎干细胞级别</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-500</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺，200 mM 溶液</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>明胶，猪皮来源，A型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>α-最低必需培养基（Alpha-MEM）</td><td>Life Technologies</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 培养基</td><td>Corning</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>无血清替代物（Knock-out serum replacement）</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td>&quot;KOSR&quot;</td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇，55 mM 溶液</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，V组分</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F12 培养基</td><td>Corning</td><td>10-080</td><td></td></tr><tr><td>N2 添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂，不含维生素A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34（SP34）</td><td>Life Technologies</td><td>10639011</td><td>&quot;SP34&quot;</td></tr><tr><td>生长因子减量基底膜基质（Matrigel）</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>&quot;MAT&quot;</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>人血清转铁蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10652202001</td><td></td></tr><tr><td>单硫代甘油（MTG）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶B</td><td>Roche</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶II</td><td>Life Technologies</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Life Technologies</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&amp;D Systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>激活素A（Activin A）</td><td>R&amp;D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>255-SC</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>291-G1</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R&amp;D Systems</td><td>203-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>R&amp;D Systems</td><td>206-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-7</td><td>R&amp;D Systems</td><td>207-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-11</td><td>R&amp;D Systems</td><td>218-1L</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>R&amp;D Systems</td><td>288-TP</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Peprotech</td><td>100-64</td><td></td></tr><tr><td>Flt-3 配体（FLT3-L）</td><td>R&amp;D Systems</td><td>308-FK</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>IWP2</td><td>Tocris</td><td>3533</td><td></td></tr><tr><td>血管紧张素II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9525</td><td></td></tr><tr><td>氯沙坦钾</td><td>Tocris</td><td>3798</td><td></td></tr><tr><td>CD4 PerCP Cy5.5 单克隆抗体 RPA-T4</td><td>BD Biosciences</td><td>560650</td><td>稀释比例 1:100；T细胞检测</td></tr><tr><td>CD8 PE 单克隆抗体 RPA-T8</td><td>BD Biosciences</td><td>561950</td><td>稀释比例 1:10；T细胞检测</td></tr><tr><td>CD34 APC 单克隆抗体 8G12</td><td>BD Biosciences</td><td>340441</td><td>稀释比例 1:100；EHT检测</td></tr><tr><td>CD34 PE-Cy7 单克隆抗体 8G12</td><td>BD Biosciences</td><td>348801</td><td>稀释比例 1:100；造血内皮细胞检测</td></tr><tr><td>CD43 FITC 单克隆抗体 1G10</td><td>BD Biosciences</td><td>555475</td><td>稀释比例 1:10；造血内皮细胞检测</td></tr><tr><td>CD45 APC-Cy7 单克隆抗体 2D1</td><td>BD Biosciences</td><td>557833</td><td>稀释比例 1:50；T细胞检测</td></tr><tr><td>CD45 eFluor450 单克隆抗体 2D1</td><td>BD Biosciences</td><td>642284</td><td>稀释比例 1:50；EHT检测</td></tr><tr><td>CD56 APC 单克隆抗体 B159</td><td>BD Biosciences</td><td>555518</td><td>稀释比例 1:20；T细胞检测</td></tr><tr><td>CD73 PE 单克隆抗体 AD2</td><td>BD Biosciences</td><td>550257</td><td>稀释比例 1:50；造血内皮细胞检测</td></tr><tr><td>CD184 APC 单克隆抗体 12G5</td><td>BD Biosciences</td><td>555976</td><td>稀释比例 1:50；造血内皮细胞检测</td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td>稀释比例 1:10,000；T细胞检测</td></tr><tr><td>OP9 DL4 细胞</td><td></td><td></td><td>Holmes, R. 和 J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156</td></tr><tr><td>MethoCult H4034</td><td>Stemcell Technologies</td><td>4034</td><td>&quot;MeC&quot;</td></tr><tr><td>Milli-Q 水纯化系统</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% CO2 培养箱</td><td></td><td></td><td>设定温度为 37 °C</td></tr><tr><td>多气体培养箱</td><td></td><td></td><td>设定温度为 37 °C，5% CO2，5% O2</td></tr><tr><td>6 孔组织培养板</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24 孔组织培养板</td><td>Corning</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>6 孔低黏附组织培养板</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>24 孔低黏附组织培养板</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 组织培养皿</td><td>Corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>钝头针，16 号</td><td>Corning</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>3 cc 注射器</td><td>Corning</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚丙烯试管</td><td>Corning</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯试管</td><td>Corning</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 聚丙烯锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 聚丙烯锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430921</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 血清移液管</td><td>Corning</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 血清移液管</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Corning</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 冻存管</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 试管配 40 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS AriaII 或同等设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSRii 或同等设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 软件</td><td>TreeStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td>设定温度为 37 °C</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 过滤系统</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 °C 冰箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 °C 冰柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80 °C 冰柜</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从人多能干细胞定向分化原始和确定型造血祖细胞

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

再生医学的主要目标之一是生成并维持由人多能干细胞（hPSCs）衍生的造血干细胞（HSCs）。直到最近，将hPSCs分化为HSCs的努力主要产生的是缺乏HSC潜能的造血祖细胞，其特征更类似于卵黄囊造血。&#160;这些获得的造血祖细胞可能具有有限的应用价值 体外 用于建模多种成人造血系统疾病，特别是淋巴系疾病。然而，我们近期已描述了一种基于阶段特异性定向分化方案，从人多能干细胞（hPSCs）生成红-髓-淋巴多系确定性造血祖细胞的方法，本文将概述该方法。通过将hPSCs在包被有基底膜基质的塑料器皿上进行酶解离，形成拟胚体（embryoid bodies, EBs）。EBs在重组BMP4作用下分化为中胚层，随后由GSK3β抑制剂CHIR99021诱导进入确定性造血程序。 alternatively，原始造血可通过PORCN抑制剂IWP2诱导。通过添加重组VEGF及支持性造血细胞因子进一步促进造血过程。利用该方法获得的造血祖细胞具有用于疾病建模和发育研究的潜力， 体外.

图 1 示意性地展示了从人多能干细胞（hPSCs）诱导原始型和确定型造血祖细胞的过程。在分化第2至第3天期间，经典WNT信号通路介导中胚层的模式形成，随后发生造血祖细胞的特化。
代表性的人多能干细胞分化造血细胞培养物的流式细胞术分析及甲基纤维素集落形成实验结果如图所示 图2IWP2处理的分化培养将产生一种独特的CD34+CD43− 和 CD34低/−CD43+ 群体，而经CHIR处理的分化培养物将具有 &lt;1% CD43+ 分化第8天的细胞（图 2A，B)26在...

本文介绍了人类多能干细胞（hPSC）的培养方案，用于将hPSC分化为CD34+造血祖细胞。该方法通过阶段特异性调控经典WNT信号通路，使细胞特异性地定向分化为确定型或原始型造血程序。

再生医学的主要目标之一是生成并维持来源于人类多能干细胞的造血干细胞（HSCs）……

本方法的总体目标是利用特定阶段的信号调控策略，引导人多能干细胞向原始型或定型造血程序分化。该方法可解决该领域内的诸多关键问题，例如解析人定型造血过程中信号通路与转录调控因子的作用机制。该技术的主要优势在于能够实现对特定发育阶段的即时信号干预。演示该实验步骤的是我实验室的博士后研究员 Carissa Dege。开始实验前，获取先前准备好的人多能干细胞系（HPSCs），这些细胞已在含有5% CO2的37°C培养箱中，于小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上培养至70%至80%融合度。吸除HPSC培养基，每孔加入1毫升37°C预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，作用1分钟。一分钟后，吸除胰蛋白酶，并向每孔加入一毫升培养基。使用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下。然后，向每孔加入一毫升洗涤缓冲液。使用2毫升血清移液管将细胞吹打3至5次，以分散大的细胞团块，然后将细胞转移至50毫升锥形管中。在330 × g离心5分钟以收集人多能干细胞（HPSCs）。离心后，加入 HPSC 培养基并重悬细胞。接着，将 2 毫升重悬的 HPSC 加入 MAT 编码塑料器皿的每孔中，并将细胞在培养箱中孵育过夜。24 小时后，吸去培养基，更换为 37 摄氏度的 0.05% 胰蛋白酶 EDTA，作用 1 分钟。吸出胰蛋白酶EDTA。加入一毫升培养基，用细胞刮棒剧烈刮取细胞。然后加入一毫升洗涤培养基。用一支2毫升的血清移液管将细胞吹打重悬3次，然后转移至50毫升锥形管中。以220 × g离心5分钟。随后吸除上清液，加入20毫升洗涤培养基，并用5毫升血清移液管轻轻重悬细胞。离心和吸除上清后，用第零天培养基小心地重悬拟胚体（EBs）。使用10毫升血清移液管，将含有拟胚体的2毫升分化培养基加入六孔低黏附细胞培养板的每个孔中。将拟胚体置于37摄氏度、5% CO2、5% O2的多气体培养箱中培养。24 小时后，加入 2 毫升第一天培养基。将细胞在多气体培养箱中过夜孵育。18 小时后，用 5 毫升血清移液管轻轻收集胚胎小体（EBs），并在 100 × g 下离心 5 分钟。用十毫升伊氏改良杜尔贝科培养基（Iscove's Modified Dulbecco Medium，IMDM）洗涤并重悬整个培养物。再次以100 × g离心5分钟以去除碎片后，吸除上清液。使用P1000移液器用第2天培养基轻柔地重悬拟胚体（EBs）。然后将每孔2毫升的拟胚体加入至6孔低黏附细胞培养板中。分别加入3 µM的CHIR99021或IWP2，以定向诱导生成定型性或原始造血祖细胞。将培养板置于37°C多气体培养箱中孵育30小时。30小时后，用2毫升血清移液管将EBs转移至50毫升锥形管中，于330 × g离心5分钟以收集EBs。轻轻重悬EBs，并用10毫升IMDM洗涤一次。将EBs重悬于第3天培养基中，每孔加入2毫升至低黏附性6孔板的各孔中。将细胞置于37摄氏度的多气体培养箱中培养72小时。培养72小时后，向每个孔中加入2毫升第六天培养基。然后将拟胚体在37摄氏度的多气体培养箱中继续培养48小时。在分化第8天分离经CHIR99021处理的EBs，并进入下一环节。以330 × g离心EBs 5分钟。吸除上清液。接着向EBs中加入2毫升0.25%胰蛋白酶EDTA。将EBs涡旋5秒，并在37摄氏度水浴中孵育8分钟。然后加入5毫升终止液，并离心EBs。然后吸除上清液。用5 mL胶原酶II重悬EBs。涡旋振荡管子5秒，随后将EBs置于37°C水浴中孵育。60分钟后，再次涡旋振荡EBs 5秒，并加入5 mL终止液。离心后，吸除上清液，并将细胞重悬于1毫升FACS缓冲液中。通过40微米细胞筛网过滤细胞，以去除未解离的细胞团块。随后进行抗体标记，并对CD34阳性造血内皮前体细胞进行FACS分离。流式细胞分选分离后，将细胞重悬于HE培养基中。将细胞以每孔50微升的体积分配至96孔低吸附培养板中，随后将细胞过夜培养。次日早晨，造血祖细胞应聚集成由6至10个细胞组成的细胞团。将50微升重聚细胞悬液轻柔转移至24孔MAT编码板的孔板中央。将孔板轻柔放入多气体培养箱中孵育4至6小时，直至细胞贴壁。待细胞贴壁后（4至6小时），向每孔缓慢加入1毫升新鲜配制的HE培养基。将细胞置于多气体培养箱中孵育，直至观察到造血细胞。随后，通过轻轻移除细胞上的HE培养基，并经40微米细胞滤筛过滤以收集滤过液，从而收获定型造血祖细胞。对于剩余的贴壁细胞，加入0.5毫升0.25%胰蛋白酶EDTA溶液，于37°C培养箱中孵育5分钟。胰酶消化后，向每孔加入 0.5 毫升终止液。将细胞通过相同的 40 微米细胞筛网，以汇集所有贴壁和非贴壁细胞，并离心收集细胞。将 2,000 至 10,000 个经 FACS 分选的细胞加入含 OP9 培养基的一孔 OP9 DL4 细胞中。在37摄氏度、5% CO2培养箱中孵育。每四至五天传代一次，用1毫升移液器吹打细胞，经40微米滤网过滤以去除细胞团块。离心后，吸除培养基。用2毫升新鲜T细胞培养基重悬细胞，并将其接种至新鲜的OP9 DL4细胞上。经过至少21天的低温培养后，剧烈吹打细胞，然后通过40微米滤膜过滤，以去除细胞碎片。以330 × g离心5分钟，吸除上清液，然后继续进行标准流式细胞术分析。流式细胞术结果显示，IWP2处理的分化培养物产生明显的CD34阳性、CD43阴性以及CD34低表达CD43阳性细胞群；而CHIR处理的分化培养物在分化第8天时，CD43阳性细胞比例不足1%。在IWP2条件下培养第9天分离得到的原始造血祖细胞，在甲基纤维素集落形成实验中主要产生原始红系和髓系祖细胞。由CHIR99021处理获得的CD34阳性CD43阴性细胞群体为异质性群体，包含内皮祖细胞以及CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性、CD184阴性的生血内皮细胞。该群体经FACS分选后，最初形成一层内皮样细胞单层，随后经历内皮向造血转化过程，产生圆形、折光性强、非贴壁的造血细胞。这些造血细胞可通过流式细胞术检测CD34和CD45的表达情况。从EHT实验中分离得到的造血祖细胞可用于甲基纤维素集落形成实验，能够产生大型爆裂样红系集落形成单位、小型红系集落形成单位以及髓系祖细胞。这些代表性的流式细胞术分析结果展示了由CHIR99021诱导产生的CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性、CD184阴性造血祖细胞，以及由IWP2诱导产生的CD34阳性、CD43阴性造血祖细胞在T淋巴细胞分化潜能方面的表现，结果显示CHIR诱导的祖细胞中存在CD45阳性、CD56阴性、CD4阳性、CD8阳性细胞群，表明输入的CD34阳性细胞群体具有造血分化潜能。观看本视频后，您应能够充分理解如何将人多能干细胞分化为原始或确定型的造血祖细胞。

directed-differentiation-primitive-definitive-hematopoietic

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

人多能干细胞对原始和最终造血祖细胞定向分化的研究

由诱导性多能干细胞（iPS细胞）生成T淋巴细胞，为T细胞免疫治疗提供了一种替代使用胚胎干细胞的新途径。该方法表明，通过利用以下任一方式 体外 或 体内...

诱导多能干细胞向T淋巴细胞的定向分化

我们基于发育生物学知识和已发表的研究，开发了一种优化的方案，可高效地从人类胚胎干细胞和人类诱导多能干细胞中生成A9型中脑多巴胺能神经元，该技术将有助于帕金森病的疾病建模及细胞替代治疗。...

由人类多能干细胞定向分化为多巴胺能神经元

本方案描述了通过强制表达转录因子，从人多能干细胞高效诱导生血内皮细胞和多能造血祖细胞的方法。...

通过转录因子过表达在人多能干细胞中直接诱导生血内皮和血液细胞

本文所述方案详细介绍了通过过表达少量转录因子，在小鼠胚胎成纤维细胞中诱导造血程序的方法。该技术可被拓展至人类体系，为未来研究造血过程、血液系统疾病以及造血干细胞移植提供平台。...

利用转录因子重编程小鼠胚胎成纤维细胞以诱导造血程序

本文介绍了一种在无饲养层且无异源成分的条件下，由人多能干细胞精确诱导生成生血性内皮细胞的实验方案。该方法在疾病建模及治疗性化合物筛选方面具有广泛的应用前景。...

无饲养层和无异种成分的确定性条件下人多能干细胞向造血内皮细胞的分化

本文介绍了一种对脐带血来源的CD34+造血干细胞和祖细胞进行免疫表型鉴定以及细胞因子诱导其向四种髓系谱系分化的实验方案。该方案可用于研究髓系疾病相关突变或小分子化合物对CD34+细胞髓系分化的影响。...

人脐血来源的CD34+造血干细胞和祖细胞的泛髓系分化

本方案通过强制表达转录因子GATA2、GFI1B和FOS，诱导人皮肤成纤维细胞启动造血程序，从而生成造血干细胞和祖细胞。...

通过强制表达转录因子实现人成纤维细胞的造血重编程

本文旨在提供一种标准化的方法，以诱导人多能干细胞分化为肝祖细胞。该实验流程结合即用型培养基配方，为用户提供了便捷的系统，可用于生成人肝细胞，服务于生物医学研究及转化应用。...

利用定义明确的分化系统从多能干细胞诱导肝祖细胞分化

本文介绍了一种在约1周内将人多能干细胞定向分化为生血性内皮细胞的简单方案。...

人多能干细胞向造血内皮细胞的定向分化

本方案介绍了从诱导性多能干细胞（iPSCs）分化生成人破骨细胞的方法，并描述了破骨细胞及其前体细胞的表征技术。...

由人诱导性多能干细胞分化与鉴定破骨细胞

学习利用阶段性WNT信号调控技术，将人多能干细胞定向分化为CD34+造血祖细胞的方法。该技术可分别诱导原始或最终造血程序，为研究人类造血发育机制提供可靠实验方案。

从人多能干细胞定向分化原始和确定型造血祖细胞

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