人多能干细胞对原始和最终造血祖细胞定向分化的研究

该方法的总体目标是使用阶段特异性信号纵方法将人类多能干细胞的分化引导至原始或确定的造血程序。这种方法可以解决该领域的许多关键问题，例如了解人类确定性造血的信号和转录调节因子。这种技术的主要优点是它可以立即使用特定于阶段的作。

演示此程序的是我实验室的博士后 Carissa Dege。要开始该方案，请在 37 摄氏度、含 5% CO2 的培养箱中，获得先前制备的人多能干细胞系或 HPSC，在小鼠胚胎成纤维细胞或 MEF 上生长，使其达到 70% 至 80% 汇合。吸出 HPSC 培养基，向每个孔中加入 1 毫升 37 摄氏度 0.25% 胰蛋白酶 EDTA，持续 1 分钟。

1 分钟后，吸出胰蛋白酶并向每个孔中加入 1 毫升储备培养基。使用细胞刮刀，将细胞从板上刮下来。然后，向每个孔中加入 1 mL 洗涤缓冲液。

用 2 毫升血清移液管研磨细胞 3 到 5 次，以打碎大块。并将细胞转移到 50 毫升锥形管中。将 HPSC 以 330 x G 离心 5 分钟。

离心后，添加 HPSC 培养基并重新悬浮细胞。接下来，向 MAT 编码塑料器皿的每个孔中加入 2 毫升重新悬浮的 HPSC，并将细胞孵育过夜。24 小时后，吸出培养基并用 37 摄氏度的 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 替换 1 分钟。

吸出胰蛋白酶 EDTA。加入 1 毫升储备培养基，用细胞刮刀用力刮擦细胞。然后加入 1 毫升洗涤培养基。

用 2 毫升血清移液管研磨细胞 3 次，然后将它们转移到 50 毫升锥形管中。将细胞以 220 x G 离心 5 分钟。然后吸出培养基，加入 20 mL 洗涤培养基，并使用 5 mL 血清移液管轻轻重悬细胞。

离心和抽吸后，小心地将拟胚体或 EB 重新悬浮在第 0 天培养基中。使用 10 毫升血清移液管，将 2 毫升含有 EB 的分化培养基分配到 6 孔低粘附细胞培养皿的每个孔中。将 EB 放入 37 摄氏度、5% CO2、5% O2 多气体培养箱中。

24 小时后，添加 2 mL Day One 培养基。将细胞在多气体培养箱中孵育过夜。18 小时后，用 5 毫升血清移液管轻轻收集 EB，并以 100 x G 离心 5 分钟。

洗涤整个培养物，并将其与 10 毫升 Iscove 改良的 Dulbecco 培养基或 IMDM 混合。再次以 100 X G 离心培养物 5 分钟以去除碎片后，吸出培养基。使用 P1000 移液器用 Day Two 培养基轻轻重悬 EB。

然后将每孔 2 mL EB 分配到 6 孔低粘附细胞培养板中。添加三个微摩尔 CHIR99021 或 IWP2 以分别指定确定或原始的造血祖细胞。将板在 37 摄氏度的多气体培养箱中孵育 30 小时。

30 小时后，用 2 毫升血清移液管分离 EB，方法是将其转移到 50 mL 锥形管中，并以 330 x G 的离心速度离心 5 分钟。轻轻重新悬浮 EB 并用 10 毫升 IMDM 洗涤它们。将 EB 重新悬浮在第 3 天培养基中，并将 2 毫升分配到低粘附性 6 孔板的每个孔中。

将细胞在 37 摄氏度的多气体培养箱中孵育 72 小时。孵育 72 小时后，向每个孔中加入 2 mL Day Six 培养基。然后将 EB 在 37 摄氏度的多气体培养箱中再孵育 48 小时。

在分化的第 8 天分离CHIR99021处理的 EB，然后进行下一部分。将 EB 以 330 x G 离心 5 分钟。吸出上清液。

接下来，向 EB 中加入 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA。涡旋 EB 5 秒钟，然后将 EB 在 37 摄氏度的水浴中孵育 8 分钟。然后加入 5 毫升终止液并离心 EB。

然后吸出上清液。将 EB 重悬于 5 毫升胶原酶 II.中，涡旋试管 5 秒钟，然后在 37 摄氏度的水浴中孵育 EB。60 分钟后，涡旋 EB 5 秒钟，并加入 5 mL 终止液。

离心后，吸出上清液并将细胞重悬于一毫升 FACS 缓冲液中。将细胞通过 40 微米细胞过滤器，以去除未解离的细胞团块。继续进行 CD34 阳性造血内皮祖细胞的抗体标记和 FACS 分离。

FACS 分离后，将细胞重悬于 HE 培养基中。将细胞以 50 微升等分试样分布在 96 孔低粘附性培养板中，然后将细胞孵育过夜。第二天早上，造血祖细胞应该聚集成 6 到 10 个细胞的团块。

轻轻地将 50 个体积的重新聚集的细胞转移到 24 孔 MAT 编码板的中心。将板轻轻放入多气体培养箱中 4 到 6 小时，直到细胞附着。4 到 6 小时后，为了让细胞附着，向每个孔中缓慢添加 1 毫升新鲜制备的 HE 培养基。

多气体培养箱中孵育细胞，直到看到造血细胞。接下来，通过轻轻地从细胞中去除 HE 培养基并通过 40 微米细胞过滤器收集流出物来收获最终的造血祖细胞。对于剩余的贴壁细胞，向细胞中加入 0.5 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA，并在 37 摄氏度的培养箱中孵育 5 分钟。

胰蛋白酶消化后，向每个孔中加入 0.5 mL 终止液。将细胞通过相同的 40 微米细胞过滤器，将所有贴壁和非贴壁细胞汇集在一起，然后旋转细胞。将 2， 000 至 10， 000 个 FACS 分离的细胞添加到 OP9 培养基中 OP9 DL4 细胞的一个孔中。

在 37 摄氏度、5% CO2 培养箱中孵育。要每 4 到 5 天传代一次细胞，请用 1 毫升移液器研磨细胞。通过 40 微米过滤器以去除结块。

离心后，吸出培养基。将细胞重悬于两毫升新鲜的 T 细胞培养基中，并将它们置于新鲜的 OP9 DL4 细胞上。冷培养至少 21 天后，用力研磨细胞并通过 40 微米过滤器以去除细胞碎片。

以 330 x G 离心 5 分钟，吸出上清液，然后继续进行标准流式细胞术。流式细胞术显示，IWP2 处理的分化培养物产生不同的 CD34 阳性、CD43 阴性和 CD34 低 CD43 阳性群体。而 CHIR 处理的分化培养物在分化第 8 天的 CD43 阳性细胞少于 1%。

在第 9 天分离的 IWP2 条件下衍生的原始造血祖细胞将在甲基纤维素测定中产生主要是原始红细胞和髓系祖细胞。源自 CHIR99021 治疗的 CD34 阳性 CD43 阴性群体是一个异质性群体，包含内皮祖细胞以及 CD34 阳性、CD43 阴性、CD73 阴性、CD184 阴性的造血内皮，当被 FACS 分离时，最初会形成单层内皮样细胞，然后经历内皮到造血的转变，导致圆形、折射、 非贴壁造血细胞。这些造血细胞可以通过流式细胞术评估 CD34 和 CD45 的表达。

从 EHT 测定中分离的造血祖细胞可用于甲基纤维素测定，并产生大的、爆发状的红细胞集落形成单位、小的红细胞集落形成单位和髓系祖细胞。这些对 CHIR99021 来源的 CD34 阳性、CD43 阴性、CD73 阴性、CD184 阴性造血祖细胞和 IWP2 衍生的 CD34 阳性、CD43 阴性造血祖细胞的 T 淋巴细胞检测电位的代表性流式细胞术分析显示，CHIR 来源的祖细胞中存在 CD45 阳性、CD56 阴性、CD4 阳性、CD8 阳性群体，表明输入 CD34 阳性群体中的造血潜力。观看此视频后，您应该对如何将人类多能干细胞分化为原始或确定数量的造血祖细胞有很好的了解。