复制和β细胞功能评估Adenovirally转分离的啮齿动物胰岛

该程序的总体目标是确定调节功能性 β 细胞质量变化的信号通路。这是通过使用腺病毒载体过表达或抑制基因表达在分离的大鼠孔中实现的。此作后，通过胰岛素分泌评估 β 细胞功能，并通过氚化胸苷掺入测量孔眼复制。

最终，这些检测可以显示目的基因是否在体外调节 β 细胞增殖和/或功能。这种方法可以帮助回答眼睑生物学领域的关键问题，例如信号通路的特定成分是否会影响 β 细胞的生长和功能？通过向所需孔数中加入 2 mL 改性培养基来制备 6 孔非组织培养包被板。

例如，一个典型的实验可能需要三个孔，一个用于无病毒对照、一个病毒对照，实验组在组织培养箱中将板加热至 37 摄氏度至少 30 分钟。分离大鼠孔眼后，立即在准备好的板的每个孔中放置 1 至 200 个孔眼。60 个孔眼将用于生化测定，剩余的孔眼可用于基因表达研究或免疫印迹，轻轻膨胀板以将孔眼带到每个孔的中心。

然后立即将腺病毒直接移液到孔眼上。在盘子的中央。使用 1 到 500 倍数的感染，具体取决于腺病毒在过度表达或敲低目标蛋白质方面的有效性。

腺病毒有效地渗透到眼睑核心，增加了结果的一致性。在眼睑后立即转导眼睑。隔离是必不可少的。

不要搅动板 5 分钟，然后将其移至培养箱中 24 小时。第二天，从培养箱中取出板，轻轻地将孔眼膨胀到孔的中心。使用 200 微升微量移液器将孔眼转移到含有新鲜培养基的新孔中。

如果孔眼附着在孔板上，可以用移液器吸头轻轻地将其移出。使用表达 GFP 的对照病毒通过使用共聚焦显微镜观察腺病毒渗透到胰岛核心培养物中是有帮助的，以验证足够的转导效率。小岛再呆一到三天，每天更换介质。

培养时间必须通过试点研究进行优化，并根据实验目标而变化。在最后 24 小时内，将氚化胸苷以每毫米培养基 1 微居里的浓度加入培养基中。首先，在 50 毫升锥形管中新鲜制备 50 毫升工作 SAB，并在 37 摄氏度的水浴中加热。

将 10 毫升工作 SAB 移液到 15 毫升锥形管中，并加入 66.8 微升 2.5 摩尔 D 葡萄糖。要制备高葡萄糖 SAB，请将 44.8 微升 2.5 单 D 葡萄糖添加到剩余的 40 毫升工作 SAB 中。为了制备低葡萄糖 SAB，接下来标记三个 1.7 毫升微量离心管。

对于六孔板的每个孔，并向每个试管中加入 1 毫升 PBS。不要忘记遵循处理和处置放射性孔眼的机构规程。使用立体镜或标准显微镜，选择 20 个大小相当的孔眼并将其转移到每个微量离心管中。

例如，每根管子可能包含 5 个小孔、10 个中孔和 5 个大孔眼。尽管在实验结束时将结果标准化为总蛋白质含量，但大小匹配组之间的孔眼至关重要。通过重力或离心使孔眼沉淀在管底部后，吸出，用微量移液管称量 PBS，然后继续准备孔眼以进行生化测定。

为了准备用于胰岛素分泌测定的孔眼，必须首先将它们与低葡萄糖 SAB 预孵育。为此，将 400 微升低葡萄糖 SAB 添加到试管中，并盖上盖子放入组织培养箱中 一小时后 60 分钟，吸出孵育前的低葡萄糖 SAB 以测量基础胰岛素分泌。重复预孵育程序。

然而，为了测量刺激的胰岛素分泌，使用 400 微升高葡萄糖 SAB 代替低葡萄糖 SAB，并且像以前一样，在高糖或低糖 SAB 抽吸物中孵育孔眼 60 分钟，SAB 用于胰岛素放射免疫测定，这将根据制造商的方案执行。然后使用相同的孔眼集合进行胸苷掺入测定。从仅用于胰岛素分泌测定的孔眼开始。

加入 1 毫升 PBS，让孔眼在重力作用下沉降。然后用微量移液器吸出 PBS。丢弃并再次重复此步骤。

接下来，在孔眼中加入 500 微升冰冷的三氯乙酸，并在冰上孵育 30 分钟。在 4 摄氏度下离心试管。然后抽吸，丢弃 TCA。

接下来，加入 80 微升 0.3 正常氢氧化钠，并在室温下孵育孔眼 30 分钟。在此孵育过程中，每 10 分钟对样品进行 5 到 10 秒的剧烈涡旋。同时，将 4 毫升 conno 安全计数混合物添加到 7 毫升液体闪烁计数管中。

当孔眼的孵育结束后，将 50 微升孔眼加入闪烁管中。短暂摇动加盖的试管，并在液体闪烁计数器中测量样品放射性。此外，为了测量蛋白质浓度，将 10 微升 vilas 转移到商业仿生酸测定中，并遵循制造商的方案。

稍后在数据分析过程中，使用描述的方案将结果标准化为蛋白质浓度。孔眼复制和 β 细胞功能。在大鼠孔眼中，评估了腺病毒过表达的假设基因 6 强烈刺激孔眼复制，而不改变 β 细胞功能。

基因 6 的表达增加，通过胸苷的掺入来测量 DNA 合成增加，因为大鼠孔眼中的大多数细胞是 β 细胞。进一步的实验可能表明，胸苷掺入的增加是由于 β 细胞复制的增加。胰岛素分泌测定表明，基因 6 的过表达不会改变低血糖和高血糖时胰岛素分泌的主要 β 细胞功能之一。

低葡萄糖浓度和高葡萄糖浓度下胰岛素分泌的增加反映了腺病毒治疗后孔眼的健康状况。如果基因 6 的表达增加损害了 β 细胞功能，这很可能反映为在高刺激葡萄糖浓度下分泌的胰岛素减少。观看此视频后，您应该对如何测量 β 细胞复制和胰岛素分泌以确定特定基因是否影响 β 细胞生长或功能有很好的了解。