高含量体外胰岛β细胞复制发现平台

对于糖尿病研究领域的关键挑战是要明白，调节胰岛β细胞的复制，并制定刺激β细胞再生方法的分子机制。在此高内涵筛选的方法来识别和评估小分子的β细胞复制促进活性表示。

这种高内涵 β 细胞复制筛选平台的总体目标是促进对限制 β 细胞生长的分子途径的研究。这种方法可以帮助回答 β 细胞生物学领域的重要问题。例如控制 β 细胞再生的关键信号分子和通路之一。

该技术的主要优点是，它能够将细胞内衬的通量提高到特定评估和原代胰岛细胞复制的自动化数据分析师。这项技术的采用有可能扩展到糖尿病再生疗法的发展。一种对我们的社会造成重大健康和经济代价的疾病。

首先使用装有胰腺消化液的 10 毫升注射器，该注射器配备 22 号针头，以在囊性和肝总管交界处或远端形成胆总管。用手术刀手柄支撑胆总管，缓慢注入 10 毫升溶液。施用所有胶原酶后，使用弯曲的镊子和剪刀将充气的胰腺与降结肠、肠道、胃和样条分开。

然后将最多两个胰腺放入含有 5 毫升胰腺消化液的冰上 50 毫升试管中。收集完所有胰腺后，将消化管放入 37 摄氏度的水浴中 15 分钟，每 3 分钟轻轻旋转一次。消解结束时，用力垂直摇动试管 10 次。

并向标本中加入 10 毫升冷洗缓冲液。再用力摇晃试管五次，然后将它们放在冰上。接下来，用冷洗缓冲液填充试管至最终体积为 50 mL，并将试管倒置 5 次。

然后旋转组织并倒出上清液，注意不要使沉淀脱落。将组织浆液重悬于 25 ml 洗涤缓冲液中，然后轻轻涡旋。再重复旋转和重新悬挂步骤两次。

将组织悬液通过 30 目组织筛倒入无菌 250 毫升烧杯中。用额外的 20 毫升洗涤缓冲液冲洗消化管，然后将洗涤液倒在网片上，以去除未消化的胰腺和脂肪组织。将过滤后的材料分装在两个新的 50 毫升试管中，并通过离心沉淀组织。

然后倒出上清液并倒置试管以排出多余的缓冲液。为了纯化胰岛，向胰腺组织沉淀中加入 20 毫升冷密度梯度，并轻轻上下移液 5 次以均匀地重新悬浮内容物。接下来，将 10 毫升 HBSS 缓慢覆盖在每管梯度管的壁上，注意保持尖锐的液体界面并通过离心分离胰腺细胞。

使用 10 毫升移液器将胰岛层从界面转移到新的 50 毫升锥形管中。然后在 40 至 50 毫升洗涤缓冲液中洗涤胰岛 3 次。倒置试管以在每次离心之间重新悬浮沉淀。

最后一次洗涤后，将试管放入组织培养罩中。吸出上清液。并将沉淀重新悬浮在 6 毫升胰岛培养基中。

在六孔组织培养板的单个孔中筛选每个试管中的胰岛。并旋转板以收集孔中间的小岛。在显微镜下评估胰岛纯度。

为了进一步纯化胰岛，使用 1 毫升移液管收集它们，并使用 6 毫升胰岛培养基转移到相邻的孔中。重复胰岛涡旋、收集、转移和显微镜评估，直到达到 90% 以上的纯度。接下来，将胰岛转移到含有 20 毫升胰岛培养基的单个 10 厘米组织培养皿中。

收获所有胰岛后，将培养皿放入组织培养箱中过夜。然后在 384 孔板的孔中涂上 40 微升 804G 的调节培养基，并将板放入培养箱中过夜。第二天，使用细胞刮刀轻轻分离胰岛。

然后将胰岛转移到 50 毫升的试管中。通过离心收集胰岛。然后用 20 毫升温热的 p、b、s 清洗它们。

离心 1 分钟。吸出上清液。并将沉淀重新悬浮在零点 2、5% 的胰蛋白酶中。

使用 1 毫升移液管在 37 摄氏度下孵育胰岛 10 分钟，吸出胰岛，分 5 分钟和 10 分钟分液 10 次。第二次切碎后，对 20 μL 胰蛋白酶化胰岛细胞样品进行计数。如果组织被完全消化，则在胰岛功能培养基中将解离胰岛细胞悬浮在 4 个点的 5 倍 10 至 4 个细胞/毫升浓度。

然后使用 12 孔歧管吸液器从先前制备的 384 孔板中取出 804G 条件培养基。并将每孔 70 微升胰岛筛入第 4 至第 21 列的第 c 至 n 行。让胰岛在组织培养箱中粘附 48 小时。

两天后，使用 12 孔歧管抽吸器小心地去除胰岛培养基，并使用 12 通道移液器向每个孔中加入 35 微升胰岛功能培养基。然后将 35 微升新鲜制备的 2， x 目标化合物溶液转移到每个孔中。并将胰岛放回培养箱中再放置 48 小时。

48 小时后，使用自动化高内涵成像平台固定、染色和分析化合物处理的胰岛培养物。在典型实验中，DAPI、PD-1 和胰岛素阳性 β 细胞的复制速率由共表达 Ki-67 的 β 细胞的百分比决定。α 细胞复制测量为 DAPI 阳性、PD 阴性、胰高血糖素阳性、Ki-67 共表达细胞的百分比。

例如，在这个代表性实验中，观察到 Dipryridamole 促进 β 细胞的复制，但不促进 α 细胞的复制。这项技术可以在 7 天内完成。按照此程序，可以进一步研究 β 细胞复制中的化合物以揭示作用机制。

这项技术使 β 细胞生物学领域的研究能够识别调节 β 细胞生长的新信号因子和通路。看完这个视频，你应该对如何测试小分子选择性刺激 β 细胞再生的能力有了很好的了解。