高内涵 体外 胰腺胰岛β细胞复制发现平台

该高通量β细胞复制筛选平台的总体目标是促进对限制β细胞生长的分子通路的研究。该方法有助于解答β细胞生物学领域中的重要问题，例如调控β细胞再生的关键信号分子和信号通路。

该技术的主要优势在于能够提高特定评估的细胞铺板通量，并实现对原代胰岛细胞增殖的自动化数据分析。该技术的应用有望推动糖尿病再生治疗的发展——糖尿病是一种给社会带来重大健康和经济负担的疾病。

首先，使用装有10毫升胰酶消化液并配备22号针头的注射器，在胆囊管与肝总管汇合处或稍远端的位置插管至胆总管。用手术刀柄支撑胆总管，缓慢注入10毫升消化液。待胶原酶完全注入后，使用弯头镊子和剪刀将膨胀的胰腺从降结肠、肠道、胃和脾脏上分离下来。

然后将最多两个胰腺放入含有5毫升胰腺消化液的50毫升离心管中，置于冰上。当所有胰腺收集完毕后，将消化管置于37°C水浴中孵育15分钟，每3分钟轻轻摇晃一次。消化结束后，用力垂直振荡试管10次。

向样本中加入10毫升冷洗涤缓冲液。剧烈振荡试管5次，然后置于冰上。接着用冷洗涤缓冲液将试管补至终体积50毫升，并将试管轻轻颠倒5次。

然后离心沉淀组织，小心弃去上清液，注意不要扰动沉淀物。用25毫升洗涤缓冲液重悬组织匀浆，并轻轻涡旋混匀。重复离心和重悬步骤两次。

将组织悬液通过30目组织筛过滤至无菌的250毫升烧杯中。用额外的20毫升洗涤缓冲液冲洗消化管，并将洗涤液倒入筛网上，以去除未消化的胰腺和脂肪组织。将过滤后的材料分装至两个新的50毫升离心管中，通过离心沉淀组织。

然后倾去上清液，将离心管倒置以沥尽多余的缓冲液。为纯化胰岛，向胰腺组织沉淀中加入20毫升冷密度梯度液，轻轻吹打5次，使内容物均匀重悬。接下来，沿每根含梯度液的离心管管壁缓慢加入10毫升HBSS，注意保持清晰的液面界面，并通过离心分离胰腺细胞。

使用10毫升移液管将胰岛层从界面转移至新的50毫升锥形管中。然后用40至50毫升洗涤缓冲液洗涤胰岛三次，每次离心之间通过倒置试管重新悬浮沉淀物。

最后一次洗涤后，将离心管转移至组织培养超净台中。吸除上清液，并将沉淀重悬于6 mL胰岛培养基中。

将每根试管中的胰岛分别过筛至六孔组织培养板的各个孔中。轻轻摇晃培养板，使胰岛聚集于各孔中央。在显微镜下评估胰岛纯度。

为了进一步纯化胰岛，使用1毫升移液器收集胰岛，并用6毫升胰岛培养基转移至相邻孔中。重复胰岛涡旋、收集、转移及显微镜下评估，直至纯度超过90%。随后，将胰岛转移至一个含有20毫升胰岛培养基的10厘米组织培养皿中。

在收获所有胰岛后，将培养皿放入组织培养箱中过夜。然后用804G条件培养基为384孔板的每个孔包被40微升，并将该板放入培养箱中过夜。次日，使用细胞刮轻轻脱离胰岛。

然后将胰岛转移至一个50毫升离心管中。通过离心收集胰岛。随后用20毫升预热的PBS洗涤。

离心一分钟。吸除上清液。将沉淀重悬于0.25%胰蛋白酶中。

将胰岛在37摄氏度下孵育10分钟，使用1毫升移液器在第5分钟和第10分钟时分别对胰岛进行10次吸打。第二次吹打后，计数20微升胰蛋白酶消化后的胰岛细胞样本。如果组织已完全消化，则将解离的胰岛细胞以每毫升4.5×10⁴个细胞的浓度悬浮于胰岛功能培养基中。

然后使用12孔多通道移液器，从先前准备好的384孔板中移除804G条件培养基。并将70微升胰岛悬液每孔接种到第4至第21列、C至N行的孔中。将胰岛置于组织培养孵育箱中，使其贴壁48小时。

两天后，使用12孔多通道移液器小心吸除胰岛培养基，并用12通道移液器向每孔加入35 µL胰岛功能培养基。然后向每孔加入35 µL新配制的2倍浓度的待测化合物溶液。将胰岛放回培养箱中继续培养48小时。

48小时后，使用自动化高内涵成像平台对经化合物处理的胰岛培养物进行固定、染色和分析。在典型实验中，通过表达Ki-67的DAPI、PD-1和胰岛素阳性β细胞所占比例来确定β细胞的增殖率。α细胞增殖率则以DAPI阳性、PD阴性、胰高血糖素阳性且共表达Ki-67的细胞所占比例来衡量。

例如，在本项代表性实验中，观察到双吡啶胺可促进β细胞而非α细胞的复制。该技术可在七天内完成。通过此方法，可对促进β细胞复制的化合物进行进一步研究，以揭示其作用机制。

该技术已使胰岛β细胞生物学领域的研究人员能够鉴定出调控β细胞生长的新型信号因子和信号通路。观看本视频后，您应能充分理解如何检测小分子选择性刺激β细胞再生的能力。