Name: 高含量体外胰岛β细胞复制发现平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 了解高含量筛选方法用于糖尿病研究中的胰岛β细胞复制，通过自动化数据分析识别促进β细胞再生的信号通路。该技术为开发再生疗法提供了重要工具。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）NIDDK 资助项目 DK098143 和 DK101530（JPA），以及斯坦福大学 Spectrum 儿童健康研究所（CHRI）和 SPARK 项目（UL1 TR001085，JPA）的支持。

本方案严格遵循斯坦福大学医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）的规定进行。所述方案适用于从六只250–300 g（8–9周龄）雄性Sprague Dawley大鼠中分离胰岛，所获胰岛量足以进行384孔板中228个孔的胰岛细胞增殖评估。
1. 材料准备
<ol>
	<li>在开始胰岛分离前，准备包被培养基：收集在15 cm组织培养皿中汇合培养3天的804G大鼠膀胱癌细胞的条件培养基（含20 ml RPMI1640）28。经无菌过滤后，将条件培养基储存于-20 °C，以备后续使用。</li>
	<li>在开始胰岛分离前，对以下手术器械进行灭菌处理：一把12 cm带齿组织镊、一把11.5 cm精细剪刀、一把14.5 cm外科剪刀、两把16 cm弯头镊、一把12 cm弯头止血钳、一把12 cm手术刀柄，以及一个30目组织筛。</li>
	<li>通过将纯化的I型与II型胶原酶按60%:40%的比例混合（总胶原酶活性为300,000 - 400,000单位），溶解于60 ml含钙和镁的1×Hanks平衡盐溶液（HBSS）中，制备胰腺消化液。将10 ml消化缓冲液分装至六支10 ml注射器中（每支配备1&#34; 22 G针头），置于冰上备用。 
	注意：每只大鼠注射10 ml消化液。请根据实验动物数量相应调整配制量。</li>
	<li>在通风橱内配制4.5 ml麻醉混合液：混合1.3 ml氯胺酮（100 mg/ml）、0.2 ml赛拉嗪（100 mg/ml）和3 ml PBS。应在开始胰岛分离前1小时内完成麻醉液的配制。</li>
	<li>通过向500 ml HBSS中加入25 ml新生小牛血清，制备洗涤缓冲液。将洗涤缓冲液置于冰上，以备后续使用。</li>
	<li>准备一瓶胰岛培养基，成分为500 ml低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、50 ml胎牛血清（FBS）、5,000单位/ml青霉素和5,000 µg/ml链霉素。</li>
	<li>由功能/活力检测溶液（500 ml）配制胰岛功能培养基，其中含2% FBS、2 mM谷氨酰胺、5 mM葡萄糖、5,000单位/ml青霉素和5,000 µg/ml链霉素。将胰岛功能培养基储存于4 °C，以备后续使用。</li>
	<li>通过向37.38 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中加入2.5 ml驴血清和0.12 ml Triton X-100，配制40 ml封闭缓冲液。将封闭缓冲液储存于4 °C，以备后续使用。</li>
	<li>在开始实验方案前，准备好所需抗体。 
	注意：使用PDX-1（TRITC）与Ki-67（FITC）共染色进行初级β细胞复制筛选。如需进行谱系特异性复制分析，应联合进行其他细胞身份标志物（胰岛素、胰高血糖素、波形蛋白或生长抑素；TRITC标记）的免疫荧光染色，并同时进行核染（DAPI）、PDX（Cy5）和Ki-67（FITC）染色。也可选用其他复制标志物，例如 PCNA。</li>
	<li>制定228孔处理方案，每种处理条件设四个重复孔。应包括阳性对照孔（5-碘代结核菌素[1 µM]或双嘧达莫[15 µM]）和溶剂对照孔（DMSO 1:666稀释）。</li>
</ol>
2. 胰腺灌注
<ol>
	<li>通过腹腔注射稀释的麻醉剂混合液（0.30 ml/100 g 体重）对大鼠进行麻醉。待大鼠完全麻醉且对有害刺激无反应后，实施颈椎脱臼处死。</li>
	<li>将已处死的大鼠仰卧位（头尾方向）置于叠放的纸巾上，并用70%乙醇喷洒腹部区域。</li>
	<li>在耻骨区域做U形切口打开腹腔，将皮肤向头侧方向翻开以暴露腹腔。</li>
	<li>使用两把弯头镊子小心夹住十二指肠，找到胆总管在十二指肠的开口（欧狄氏括约肌），并用弯止血钳夹闭乳头处的十二指肠开口。</li>
	<li>提起用于夹闭胆总管乳头的弯止血钳，用弯头镊子夹住靠近肝脏的胆管，使用弯头镊子钝性分离以游离并暴露胆管。</li>
	<li>重新摆放大鼠位置，使头部靠近操作者，足部远离操作者。</li>
	<li>在胆囊管与肝总管汇合处或稍远端，用装有胰腺消化液的10 ml 注射器插入胆总管（CBD），缓慢注入10 ml 胰腺消化液。注射时用手术刀柄支撑胆总管。若胰腺和胆管未膨胀，需调整针头位置。</li>
	<li>使用弯头镊子和精细剪刀将膨胀的胰腺从降结肠、肠道、胃和脾脏中分离取出。将取出的胰腺置于含有5 ml 胰腺消化液的50 ml 离心管中，并放置于冰上。 
	注意：为获得最大胰岛产量，应在30分钟内收集所有胰腺，每根50 ml 消化管中仅放置1至2个胰腺。</li>
</ol>
3. 胰腺的解离
<ol>
	<li>收集所有胰腺组织后，将消化管放入 37 °C 水浴中孵育 15 分钟，每 3 分钟轻轻摇动一次。</li>
	<li>15 分钟后，用力垂直振荡消化管 10 次，加入 10 ml 冷的 洗涤缓冲液；再用力振荡 5 次，然后将管置于冰上。</li>
	<li>用冷的 洗涤缓冲液 将消化管补至 50 ml，通过倒置混匀 5 次。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 97 × g 离心 1 分钟，倾去上清液。注意不要扰动沉淀的组织。</li>
	<li>加入 25 ml 洗涤缓冲液，轻轻涡旋重悬组织。重复步骤 3.4 和 3.5 两次。</li>
	<li>将 30 目组织筛置于无菌 250 ml 烧杯上，将组织悬液倒入筛中；用额外 20 ml 洗涤缓冲液 冲洗消化管，并将冲洗液倒入筛网。此步骤可去除未消化的胰腺组织和脂肪组织。</li>
	<li>将滤过物转移至两个新的 50 ml 离心管中，在 4 °C 条件下以 97 × g 离心 1 分钟收集组织沉淀。弃去上清液，将离心管倒置以去除残留缓冲液。</li>
</ol>
4. 胰岛的纯化
<ol>
	<li>向沉淀的胰腺组织中加入 20 ml 冷的聚蔗糖/泛影酸钠溶液（密度为 1.119 g/ml）。通过轻轻吹吸 5 次，将每管内容物均匀重悬。</li>
	<li>沿管壁缓慢加入 10 ml HBSS，轻柔地覆盖在聚蔗糖/泛影酸钠溶液上方。沿管壁缓慢加样以维持清晰的液面界面。</li>
	<li>将消化后的胰腺在 4 °C 条件下以 560 × g 离心 15 分钟，使用慢加速且不启用刹车。</li>
	<li>使用 10 ml 移液器从界面处收集胰岛层，并将胰岛转移至新的 50 ml 管中。此阶段不要合并胰岛。</li>
	<li>向每个 50 ml 管中加入 40 ml 洗涤缓冲液，在 4 °C 条件下以 140 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>倾去上清液，通过反复倒置管子数次，将合并的胰岛重悬于 50 ml 洗涤缓冲液 中。在 4 °C 条件下以 97 × g 离心 1 分钟，使胰岛形成沉淀。</li>
	<li>倾去 洗涤缓冲液，重复洗涤一次。将胰岛转移至组织培养超净台中，并吸除上清液。</li>
	<li>将每管胰岛重悬于 6 ml 胰岛培养基 中。</li>
	<li>将每个 50 ml 管中的胰岛转移至六孔组织培养板的一个孔中。轻轻摇动六孔板，使胰岛聚集于孔中央，并在显微镜下观察胰岛的质量和纯度。</li>
	<li>使用 1 ml 移液器手动挑选胰岛，并将挑出的胰岛转移至相邻孔中，该孔内含有 6 ml 胰岛培养基。重复摇动和挑选过程，直至达到 &#62; 90% 的纯度。</li>
	<li>将纯化后的胰岛转移至一个 10 cm 组织培养皿中，其中含有 20 ml 胰岛培养基。</li>
	<li>将胰岛置于组织培养孵箱中（37 °C，5% CO2）过夜（图 1A）。</li>
	<li>为接种胰岛细胞做准备，向 384 孔板的每个孔中加入 40 µl 804G 条件培养基进行包被。在组织培养孵箱中孵育过夜。</li>
</ol>
5. 胰岛细胞的分散与铺板
<ol>
	<li>次日，使用细胞刮轻轻将胰岛从10 cm培养皿上分离，并将胰岛转移至50 ml离心管中。</li>
	<li>在室温下以22 × g离心1分钟，使胰岛沉淀，吸除上清液。</li>
	<li>用20 ml预热的PBS洗涤胰岛，倾去液体，操作同上。</li>
	<li>将胰岛重悬于0.25%胰蛋白酶中（每只大鼠胰腺使用150 µl），在37 °C孵育10分钟。在孵育5分钟和10分钟时，用1 ml移液器将胰岛上下吹打10次。</li>
	<li>孵育10分钟后，取20 µl消化后的胰岛样品在显微镜下观察，确认消化是否完全，并使用血细胞计数板计数胰岛细胞。若仍有未消化的胰岛，继续孵育3–5分钟，并再上下吹打10次。必要时重复此步骤。 
	注意：通常每只大鼠可获得约125,000–150,000个胰岛细胞。</li>
	<li>从培养箱中取出经804G条件培养基包被的384孔板，使用12通道多联吸头移除培养基。</li>
	<li>将胰岛细胞以45,000个细胞/ml的密度重悬于Islet function medium中，使用多通道移液器每孔加入70 µl（含3,150个细胞）（图1B）。 
	注意：由于β细胞倾向于从外周孔向板边缘迁移，因此应使用C至N行以及4至21列的区域，将6只大鼠分离的胰岛细胞接种至228个孔中。</li>
	<li>将培养板放入组织培养箱中孵育48小时，以促进细胞贴壁。</li>
</ol>
6. 胰岛细胞培养处理、固定与染色
<ol>
	<li>在胰岛功能培养基中配制200 µl的溶剂和化合物（处理条件设四个复孔），浓度为2倍。将化合物按顺序排列于无菌96孔板中，以便进行多通道移液。</li>
	<li>使用12通道多联吸液器小心吸除胰岛培养基，并用12通道移液器每孔加入35 µl胰岛功能培养基。每次处理一行，逐行更换培养基，以减少干燥风险（图1C）。</li>
	<li>通过向每孔转移35 µl的2倍浓度化合物溶液开始处理。将板放回培养箱，持续处理48小时。</li>
	<li>处理48小时后，将板倒置，倾去处理用培养基。</li>
	<li>用每孔50 µl的1×PBS轻柔洗涤胰岛细胞（1分钟）。使用多通道移液器加入PBS。</li>
	<li>倾去PBS，每孔加入50 µl用1×PBS稀释的冷4%多聚甲醛（PFA）固定细胞。4 °C孵育15分钟。</li>
	<li>将板倒置以去除PFA，每孔轻柔加入60 µl PBS，重复洗涤三次，每次5分钟（方法同上）。</li>
	<li>通过混合14.25 ml甲酰胺和0.75 ml 0.15 M柠檬酸钠（pH 6）配制15 ml抗原修复液。抗原修复液需现配现用。</li>
	<li>将板倒置去除孔内PBS，每孔加入60 µl抗原修复液。将板置于70 °C水浴中加热45分钟。孵育期间在板上放置加热块，防止多孔板变形。 
	注意：水位应达到板裙边的一半高度；板不可完全浸没。</li>
	<li>从水浴中取出板，在室温下冷却20分钟。通过目视检查确保板无变形。</li>
	<li>每孔加入60 µl 1×PBS，洗涤细胞三次，每次5分钟。使用多通道移液器加入PBS，倒置板以倾去PBS。</li>
	<li>使用多通道移液器每孔加入40 µl封闭缓冲液，室温孵育30分钟。通过倒置板并倾倒的方式去除封闭缓冲液。</li>
	<li>每孔加入40 µl用封闭缓冲液稀释的鼠抗人Ki-67抗体（1:200）和山羊抗人PDX-1抗体（1:100），4 °C孵育过夜。</li>
	<li>次日，倾去抗体溶液，按上述方法用1×PBS洗涤细胞三次，每次5分钟。倾去PBS。</li>
	<li>每孔加入40 µl用封闭缓冲液稀释的生物素标记驴抗鼠IgG和罗丹明标记驴抗山羊IgG（1:200），室温孵育1小时。</li>
	<li>用1×PBS洗涤细胞三次，每次5分钟。每孔加入40 µl用封闭缓冲液稀释的荧光素标记链霉亲和素（1:400），室温孵育30分钟。</li>
	<li>用1×PBS洗涤细胞三次，每次5分钟。每孔加入40 µl DAPI（300 nM，溶于封闭缓冲液），室温孵育15分钟。</li>
	<li>用1×PBS洗涤细胞两次，每次5分钟，最后每孔保留40 µl 1×PBS。此时板即可用于分析。</li>
</ol>
7. β细胞复制分析
注意：必须为用于检测β细胞复制的高内涵筛选显微镜建立检测方案。该方案最简单的形式为双色检测，其中使用一种身份标记物来定义β细胞（PDX-1+细胞），并使用一种复制标记物（Ki-67）来识别细胞分裂事件。
<ol>
	<li>根据PDX-1染色（549 nm滤光片）在预期β细胞核像素面积内、近似圆形（长宽比 &#60; 1.6）区域中的平均荧光强度来识别对象（β细胞）（图2A）。</li>
	<li>接着，基于PDX-1+区域内Ki-67阳性复制事件的平均荧光强度（485 nm滤光片）设定识别参数 （图2B）。 
	注意：必须固定曝光时间，以便在不同图像间进行像素强度比较。应调整检测方案参数，确保仪器自动识别时持续排除非特异性染色、碎片及细胞聚集体，以避免对数据质量产生不利影响。</li>
	<li>每孔至少分析500个β细胞，以最大程度提高准确性并减少变异性。 
	注意：大鼠胰岛培养中基础β细胞复制指数预期为0.5 - 3%。通常情况下，每孔采集40幅图像已足以识别出500个β细胞。</li>
	<li>在分析整块板之前，应先分析选定的阴性对照（DMSO处理）和阳性对照（5-碘代结核菌素 [1 µM] 或双嘧达莫 [15 µM]）处理孔，以评估检测方案的有效性。当检测体系建立正确时，阳性对照化合物应使复制中β细胞的比例至少增加两倍。</li>
	<li>在检测方案验证通过后，对整块板进行读板分析。</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

研究调控β细胞生长与再生的分子通路的实验方法，是糖尿病研究人员的重要工具。本文介绍了一种基于大鼠胰岛的筛选平台，可用于鉴定和表征小分子β细胞复制刺激剂。
尽管本方案的大多数步骤经验丰富的研究人员均可轻松完成，但仍有少数步骤需要特殊的技术。首先，在胰岛分离过程中，对胆管进行插管而不破坏其完整性需要一定的操作经验。一个有效的策略是先轻微膨胀胆管，以确保在完全注入胰腺消化液之前针头位置正确。其次，从外分泌组织中高效分离胰岛需要密切注意消化时间和适当的振荡。应通过间歇性旋转确保消化过程中受热均匀。第三，实验成功的关键在于手动挑选胰岛时能够熟练区分胰岛与外分泌组织碎片；这一技能随着实践会逐步提高。第四，胰岛的分散和铺板应使所有胰岛被分散为单细胞和由两到三个细胞组成的小细胞团的混合物。铺板前对胰岛的过度或不足消化均会影响实验结果。新铺板的胰岛细胞应在48小时内保持未受干扰状态，使其贴壁，并在铺板后达到约50%的融合度后再进行后续操作。图1展示了铺板后不同时间点成功培养的胰岛细胞的形态。第五，对胰岛细胞培养物更换培养基时应小心操作，以避免破坏贴壁较弱的细胞。第六...

糖尿病是一组以葡萄糖稳态失衡为共同终末表现的疾病。尽管糖尿病各亚型的致病机制不同，但均导致β细胞质量减少这一共同后果。 即胰岛素生成能力丧失1,2目前，糖尿病的治疗策略依赖于外源性胰岛素的长期给药、药物刺激胰岛素生成或提高胰岛素敏感性，极少数情况下采用胰岛细胞或全胰腺移植3,4遗憾的是，这些策略的效果短暂和/或无法充分模拟内源性胰岛素分泌功能。尽管开发出能够促进β细胞再生的方法具有重要意义，但目前尚无此类有效手段。因此，糖尿病研究的一个重要目标是开发出生成新β细胞或扩增内源性β细胞质量的方法。5尽管来自胚胎干细胞等可再生资源的β细胞再生技术正在取得进展，但出于对安全性和效率的担忧，探索包括成熟β细胞扩增在内的替代策略仍被列为优先方向6,7重要的是，新生β细胞的主要来源 体内 是已存在的β细胞，而非特化的前体细胞8,9尽管β细胞似乎具有有限的增殖能力，但β细胞质量的轻微增加（约30%）可能足以恢复许多糖尿病患者的葡萄糖稳态。此外， 原位 通过药物刺激β细胞质量是一种潜在的低成本且可扩展的治疗策略。本文介绍了一种高内涵筛选方法，用于鉴定和表征能够促进β细胞生长的小分子。
多种体外实验方法可用于鉴定促进初级β细胞复制的基因产物和/或分子。早期测量β细胞复制诱导作用的研究采用胎鼠胰腺培养或完整分离的胰岛培养，通过检测在特定处理条件下，醛品红-硫堇或胰岛素染色细胞群体中 [3H] 胸苷掺入、BrdU 掺入或有丝分裂体的存在来评估复制活性10,11。这些体外方法及其近似变体存在若干局限性。主要缺陷包括：（1）使用胎儿细胞，与成熟β细胞不同，胎儿细胞具有较高的基础β细胞复制率，且其生长调控机制显著不同12；（2）对β细胞复制事件的判定依赖实验人员主观判断；（3）依赖人工计数β细胞复制事件，耗时耗力，限制了实验通量；（4）采用细胞核掺入/染色/形态特征识别复制事件，同时使用非重叠的细胞质染色标记β细胞，可能导致邻近的非β细胞复制事件被错误归因于β细胞。
近年来，成熟的原代β细胞已被用于评估转基因过表达以及基因产物或化合物处理对β细胞复制的影响13-16。然而，这些研究同样依赖于对复制事件的主观计数、通过细胞质染色或非特异性方法鉴定β细胞，和/或存在限制通量的繁琐步骤，例如，将细胞单独接种于载玻片孔中，或对完整胰岛进行石蜡包埋和处理17。值得注意的是，已有文献报道了一种基于图像的人β细胞复制筛选方法，与本文所述方法类似18；然而，该检测方法的成功应用尚未得到证实，且使用人胰岛进行初筛可能不具备广泛的可行性。
鉴定促进复制物质的另一种策略是评估β细胞系的生长诱导能力。早期研究使用了经转化的β细胞系，例如min6细胞或INS 832/13细胞14,19-21。然而，这些细胞系表现出不受控制的生长，与分化良好的β细胞相差甚远22。因此，其生长诱导能力极弱，相关性不明确，有时难以重复。一种改进的基于细胞系的筛选策略利用&#34;可逆转化&#34;细胞，这类细胞在无四环素（多西环素）依赖性SV40 T抗原表达时生长停滞23,24。然而，目前尚不清楚这些细胞在去除多西环素后是否能恢复为&#34;正常&#34;的类似β细胞的状态。遗憾的是，使用这些细胞筛选得到的是广谱性促生长化合物，似乎缺乏直接的应用价值24。总体而言，利用细胞系研究自发复制活性极低的细胞类型的生长调控，其适用性可能有限。
本文所述的β细胞复制筛选平台利用成熟的原代大鼠β细胞以保持 体内 在尽可能实现生长调控的前提下，采用由多种细胞类型组成的胰岛细胞培养体系，以识别谱系受限的促生长活性；通过多孔板格式化设计以最大化通量，并结合自动化分析以消除偏差并提升通量。该平台的成功应用已促成多个促进β细胞复制的化合物的发现。25,26此外，该检测方法已被用于构效关系研究和化学上位性实验，以深入揭示β细胞复制的分子调控机制。本文所述平台已成功应用于基于慢病毒RNA干扰的β细胞复制通路研究。25该检测方法的局限性包括可扩展性受限（需使用原代细胞）、采用啮齿类而非人类胰岛细胞（尽管该方法可经调整后用于人类胰岛研究）、基于抗体成像及原代胰岛使用所带来的较高成本、为便于自动化图像采集而采用分散胰岛（破坏了胰岛原有结构），以及对具备图像采集与分析功能的自动化显微镜设备的依赖。尽管该方法操作简便 体内 用于鉴定刺激β细胞再生的基因产物或化合物的筛选方法 原位 理想的平台尚未问世27因此，所述平台适用于有意研究β细胞复制大多数方面的研究人员。

<table><tbody><tr><td>250 g 雄性 Sprague Dawley 大鼠</td><td>Charles River</td><td>品系编号 # 400</td><td></td></tr><tr><td>12 cm 齿状组织镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>11.5 cm 精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>14.5 cm 外科剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>16 cm 弯头镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-16</td><td></td></tr><tr><td>12 cm 弯头止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>12 cm 手术刀柄</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>组织筛网-30 目</td><td>Bellco Glass</td><td>1985-85000</td><td></td></tr><tr><td>Cizyme RI，375,000 CDA 单位</td><td>VitaCyte</td><td>005-1030</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液（含 Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;）</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮（200 mg/20 ml）</td><td>JHP Pharmaceuticals</td><td>NDC# 42023-113-10</td><td>用于配制麻醉混合液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>赛拉嗪（5 g/50 ml）</td><td>LLOYD</td><td>NADA# 139-236</td><td>用于配制麻醉混合液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>H-1077</td><td>用于配制 Histopaque 1100</td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>H-1119</td><td>用于配制 Histopaque 1100</td></tr><tr><td>新生小牛血清 500 ml</td><td>Hyclone</td><td>SH30118.03</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液</td><td>Hyclone</td><td>SH30268.01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco 改良 Eagle 培养基/低糖&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>功能/活性检测溶液&amp;nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>99-768-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 培养基&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>用于配制条件培养基</td></tr><tr><td>804G 大鼠膀胱癌细胞系</td><td>可应要求提供</td><td></td><td>用于配制条件培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定合格</td><td>Gibco</td><td>26160</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>青霉素（5,000 IU/ml）/链霉素（5 mg/ml）&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺 500 ml</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP227-500</td><td></td></tr><tr><td>抗原修复溶液 250 ml（pH 6.0）</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td>用于配制 0.15 M 柠檬酸钠溶液</td></tr><tr><td>无水右旋糖</td><td>EMD Chemicals</td><td>DX0145-1</td><td>用于配制 1 M 葡萄糖溶液</td></tr><tr><td>正常驴血清（粉末）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 Ki67 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>556003</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗人 PDX-1 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF2419</td><td></td></tr><tr><td>多克隆豚鼠抗胰岛素抗体</td><td>Dako</td><td>2016-08</td><td></td></tr><tr><td>多克隆兔抗胰高血糖素抗体</td><td>Dako</td><td>2014-06</td><td></td></tr><tr><td>多克隆兔抗生长抑素抗体</td><td>Dako</td><td>2011-08</td><td></td></tr><tr><td>多克隆鸡抗波形蛋白抗体</td><td>abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>生物素-SP 标记驴抗小鼠 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-065-150</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素，Alexa Fluor 488 标记&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S32354</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明标记驴抗山羊 IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-025-147</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明标记驴抗豚鼠 IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-025-148</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明标记驴抗兔 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-025-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 标记驴抗豚鼠 IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 标记驴抗山羊 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-175-147</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 标记驴抗兔 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-175-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 标记驴抗鸡 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-175-155</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Millipore</td><td>S7113</td><td></td></tr><tr><td>一次性试剂储液槽 25 ml</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39900</td><td></td></tr><tr><td>384 孔黑色/透明细胞培养处理板</td><td>BD Falcon</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>96 孔黑色/透明细胞培养处理板</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Costar</td><td>4880</td><td></td></tr><tr><td>12 通道真空吸液器</td><td>Drummond</td><td>3-000-096</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 水浴锅型号 2223&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高内涵筛选仪器：ArrayScan VTI</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

高内涵 体外 胰腺胰岛β细胞复制发现平台

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

胰岛素生成性β细胞的丧失是糖尿病的核心特征。尽管目前正在探索多种潜在的替代疗法，但扩增内源性胰岛素生成性胰岛β细胞仍是一种具有吸引力的策略。β细胞的自发再生能力有限，因此，一项关键的研究方向是深入理解抑制β细胞增殖的分子通路，并鉴定能够克服这些抑制作用的药物。本文介绍了一种基于自动化高内涵成像的原代细胞筛选方法，用于鉴定促进β细胞复制的小分子化合物。该方法克服了以往多种方法的局限性。首先，采用原代胰岛细胞而非永生化细胞系，可最大程度地保留 体内 生长抑制因素。其次，采用混合组成的胰岛细胞培养物而非β细胞系，可识别出谱系特异性及广谱性的生长刺激因子。第三，通过使用384孔板格式，该技术使原代胰岛的应用变得切实可行，从而克服了原代胰岛作为有限资源的制约。第四，通过优化胰岛分离、分散、铺板和培养参数，克服了因胰岛培养质量不稳定而导致的实验变异性问题。第五，通过优化免疫染色参数、自动化数据采集和数据分析，克服了准确且一致地测量胰岛内分泌细胞低基础复制率的困难；自动化同时提高了通量并减少了实验者偏倚。该检测方法的显著局限性包括：使用分散的胰岛细胞培养物会破坏胰岛结构，使用啮齿类动物而非人胰岛，以及使用原代细胞所带来的通量和成本固有局限。重要的是，该策略可轻松适用于人胰岛复制研究。该检测方法非常适合用于研究物质对β细胞的促有丝分裂效应及其调控β细胞生长的分子机制。

为了评估β细胞或α细胞的复制情况，需要采用四色检测方案。首先，通过DAPI染色（通道1，386 nm）识别所有细胞对象。接着，计数β细胞（事件1）：同时表达PDX-1+（通道2，650 nm）和核周胰岛素（通道3，549 nm）的细胞对象。随后，计数正在复制的β细胞（事件2）：在β细胞（事件1）中同时表达Ki-67（通道4，485 nm）的细胞（图3）。复制β细胞的百分比计算公式为：(事件2/事件1) × 100。为了定量分析α细胞的复制，首先通过DAPI染色（通道1）识别全部细胞对象，然后通过PDX-1染色缺失（通道2）和核周胰高血糖素染色阳性（通道3）来确定α细胞（事件1）。复制中的α细胞（事件2）是指同时表达Ki-67（通道4）的α细胞数量（图 4）。复制α细胞的百分比计算公式为：(事件2/事件1) × 100。
在开始实验...

糖尿病研究领域面临的关键挑战是阐明调控胰岛β细胞复制的分子机制，并开发出促进β细胞再生的方法。本文介绍了一种高内涵筛选方法，用于鉴定和评估小分子促进β细胞复制的活性。

胰岛素生成性β细胞的丢失是糖尿病的核心特征。尽管目前正在探索多种潜在的替代疗法，但扩增……

该高通量β细胞增殖筛选平台的总体目标是促进对限制β细胞生长的分子通路的研究。该方法有助于解答β细胞生物学领域中的重要问题，例如调控β细胞再生的关键信号分子和信号通路。该技术的主要优势在于能够提高细胞定向分选的通量，并实现对原代胰岛细胞增殖的自动化数据分析。该技术的应用有望推动糖尿病再生治疗的发展，而糖尿病是一种给社会带来重大健康和经济负担的疾病。首先，使用装有10毫升胰蛋白消化液并配备22号针头的注射器，在胆囊管与肝总管汇合处或稍远端的位置对胆总管进行灌注。用手术刀柄支撑胆总管，缓慢注入10毫升消化液。待全部胶原酶注入后，使用弯头镊子和剪刀将膨胀的胰腺与降结肠、肠道、胃和脾脏分离。然后将最多两个胰腺放入含有5毫升胰腺消化液的50毫升离心管中，置于冰上。当所有胰腺收集完毕后，将消化管置于37°C水浴中孵育15分钟，每3分钟轻轻摇晃一次。消化结束后，用力垂直振荡试管10次。向样本中加入10毫升冷洗涤缓冲液。剧烈振荡试管5次，然后置于冰上。接着用冷洗涤缓冲液将试管补至终体积50毫升，并将试管颠倒5次。然后离心沉淀组织，小心弃去上清液，避免扰动沉淀物。用25毫升洗涤缓冲液重悬组织匀浆，并轻轻涡旋混匀。重复离心和重悬步骤两次。将组织悬液通过30目组织筛过滤至无菌的250毫升烧杯中。用额外的20毫升洗涤缓冲液冲洗消化管，并将洗涤液倒入筛网上，以去除未消化的胰腺和脂肪组织。将过滤后的材料分装至两个新的50毫升离心管中，通过离心沉淀组织。然后倾去上清液，将离心管倒置以沥尽多余的缓冲液。为纯化胰岛，向胰腺组织沉淀中加入20毫升冷密度梯度液，轻轻吹打5次，使内容物均匀重悬。接下来，沿每根含梯度液的离心管管壁缓慢加入10毫升HBSS，注意保持清晰的液面界面，并通过离心分离胰腺细胞。使用10毫升移液管将界面处的胰岛层转移至新的50毫升锥形管中。然后用40至50毫升洗涤缓冲液洗涤胰岛三次，每次离心后通过倒置试管重新悬浮沉淀物。最后一次洗涤后，将离心管转移至组织培养超净台中。吸除上清液，并将沉淀重悬于6 mL胰岛培养基中。将每个试管中的胰岛分别过筛至六孔组织培养板的各个孔中。轻轻摇晃培养板，使胰岛聚集于各孔中央。在显微镜下评估胰岛纯度。为进一步纯化胰岛，使用1毫升移液器收集胰岛，并用6毫升胰岛培养基转移至相邻孔中。重复胰岛涡旋、收集、转移及显微镜下评估，直至纯度超过90%。随后，将胰岛转移至一个含有20毫升胰岛培养基的10厘米组织培养皿中。在收获所有胰岛后，将培养皿放入组织培养箱中过夜。然后用804G条件培养基为384孔板的每个孔包被40微升，并将该板放入培养箱中过夜。次日，使用细胞刮轻轻解离胰岛。然后将胰岛转移至一个50毫升离心管中。通过离心收集胰岛。随后用20毫升预热的PBS洗涤。离心一分钟。吸除上清液。将沉淀重悬于0.25%胰蛋白酶中。将胰岛在37摄氏度孵育10分钟，使用1毫升移液器在5分钟和10分钟时分别吸取和排液胰岛10次。第二次吹打后，计数20微升胰蛋白酶消化后的胰岛细胞样本。如果组织已完全消化，则将解离的胰岛细胞以4.5 × 10⁴ 个细胞/毫升的浓度悬浮于胰岛功能培养基中。然后使用12孔多通道吸液器，从先前准备好的384孔板中移除804G条件培养基。将胰岛以每孔70微升的量，过筛至第4至第21列、C至N行的孔中。将胰岛置于组织培养孵育箱中，使其贴壁48小时。两天后，使用12孔多通道吸液器小心吸除胰岛培养基，并用12通道移液器向每孔加入35 µL胰岛功能培养基。然后向每孔加入35 µL新配制的2倍浓度的目标化合物溶液。将胰岛放回培养箱中继续培养48小时。48小时后，使用自动化高内涵成像平台对经化合物处理的胰岛培养物进行固定、染色和分析。在典型实验中，通过表达Ki-67的DAPI、PD-1和胰岛素阳性β细胞所占比例来确定β细胞的增殖率。α细胞增殖率则以DAPI阳性、PD阴性、胰高血糖素阳性且共表达Ki-67的细胞所占比例来衡量。例如，在本项代表性实验中，双嘧达莫被发现可促进β细胞而非α细胞的复制。该技术可在七天内完成。通过此方法，可对影响β细胞复制的化合物进行进一步研究，以揭示其作用机制。该技术已使胰岛β细胞生物学领域的研究人员能够鉴定出调控β细胞生长的新型信号因子和信号通路。观看本视频后，您应能充分理解如何检测小分子选择性刺激β细胞再生的能力。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

高含量<em&gt;体外</em&gt;胰岛β细胞复制发现平台

一种小鼠胰岛分离及细胞内cAMP测定方法

本文描述了一种从人胎儿胰腺细胞中分离、培养和成像胰岛细胞簇（ICCs）的实验方案。...

人胎儿胰腺细胞簇的分离、培养与成像

本方案所述的三维培养方法可重现小鼠胚胎胰腺前体细胞发育为分支器官的过程，包括前体细胞的大量扩增、分化及形态发生。该方法适用于对微环境进行成像观察、功能干扰及操作干预。...

体外 从小鼠胚胎前体细胞诱导胰腺器官发生

体外集落形成实验用于鉴定从成年小鼠胰腺中分离的三潜能前体细胞

离体胰岛研究对糖尿病研究具有重要意义。目前用于研究在天然三维结构中培养的胰岛的技术耗时长、效率低，且很少被使用。本研究介绍了一种简单、高效的新方法，可用于制备高质量的全培养胰岛石蜡切片。...

胰岛组织石蜡切片包埋

我们描述了一种从胚胎期、新生期及出生后胰腺中分离内分泌细胞并进行单细胞RNA测序的方法。该方法可用于分析胰腺内分泌细胞谱系发育、细胞异质性及转录组动态变化。...

小鼠胰腺内分泌细胞的单细胞转录组分析

本文介绍了一种利用基于液滴的微流控单细胞RNA测序技术，从分离的人胰岛中生成高质量、大规模单细胞转录组数据的实验方案。...

单细胞RNA测序及人胰岛分析

干细胞向胰岛细胞的分化为传统的糖尿病治疗和疾病建模提供了替代方案。本文介绍了一种详细的干细胞培养方案，该方案结合商用分化试剂盒与先前已验证的方法，有助于在体外生成可分泌胰岛素的干细胞来源胰岛细胞。...

人多能干细胞向胰岛素分泌型胰岛样细胞团的分化

本文介绍了一种定向分化及功能分析类β细胞的方法。我们描述了在生成胰岛素分泌型胰腺细胞前，人多能干细胞所需的最佳培养条件和传代方法。该六阶段分化过程从定型内胚层形成开始，最终获得能够响应葡萄糖刺激而分泌胰岛素的功能性类β细胞。...

从人多能干细胞生成功能性胰岛素分泌胰腺细胞的优化方案

已提出移植分离的胰岛可能成为治疗1型糖尿病的一种潜在方法。本文介绍一种从小鼠胰腺中分离胰岛并将其移植至肾包膜下空间的方法。...

小鼠胰岛分离与肾包膜下移植方法

了解高含量筛选方法用于糖尿病研究中的胰岛β细胞复制，通过自动化数据分析识别促进β细胞再生的信号通路。该技术为开发再生疗法提供了重要工具。

高内涵体外胰腺胰岛β细胞复制发现平台

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