紧凑型量子点的单分子成像
October 9th, 2012
我们描述了准备的胶体量子点与最小化的流体力学尺寸为单分子荧光成像。相比传统的量子点，这些纳米颗粒的尺寸类似于球状蛋白质单分子反对光降解，亮度，稳定性和耐非特异性结合的蛋白质和细胞进行了优化。
该程序的总体目标是制备具有最佳亮度和稳定性的荧光量子点，以及最小的尺寸和非特异性结合，用于单分子成像。这是通过首先制备小的硒化镉量子点核心来实现的。第二步是将这些核心与汞合金化，以将其荧光转移到红色光谱中并增加其亮度。
接下来，在纳米晶体上生长一层薄的合金壳以稳定其荧光发射。最后一步是使用多齿状聚合物将这些颗粒从有机溶剂转移到水性缓冲液中，该聚合物可以用生物惰性聚乙二醇进行改性。最终，荧光光谱法、凝胶色谱法和凝胶电泳表明，这些颗粒具有明亮的荧光、紧凑的流体动力学尺寸和中性静电荷属性，非常适合生物学中的单分子荧光成像。
与现有的商业材料相比，这些量子点的主要优点是这些纳米颗粒的流体动力学尺寸显着减小。尽管较小的量子点会受到荧光强度降低、荧光稳定性降低和荧光仅在蓝色光谱中的负面影响，但我们使用汞阳离子交换工艺抵消了这些影响。这些纳米晶体可以在拥挤的生物环境中对单个生物分子进行动态成像，从而帮助回答生物物理学和细胞信号传导中的关键问题。
首先，将硒加入 50 毫升中，准备 0.4 摩尔的硒溶液。三颈烧瓶，在高真空下抽空烧瓶，并在无空气条件下使用 sch shank 管路填充氩气。加入 10 毫升顶部，加热至 100 摄氏度，同时搅拌 1 小时，得到透明无色溶液。
将溶液冷却至室温，然后将培养瓶放在一边。此外，使用书面方案中列出的数量，在 250 毫升三颈烧瓶中制备氧化镉 TDPA 和 ODE 的溶液。在本视频中，在搅拌时使用柄线抽出溶液。
将温度提高到 100 摄氏度，然后再抽真空 15 分钟。为了去除阿贡气体下的低沸点杂质，将混合物加热到 300 摄氏度 1 小时以完全溶解氧化镉。溶液会从微红色变为透明，无色将溶液冷却至室温。
接下来，将 HDA 加入镉溶液中，加热至 70 摄氏度并抽空。达到恒定压力后，提高温度并将溶液回流 30 分钟。将 schlink 管路阀切换到惰性气体，并将热电偶直接插入溶液中。
在无空气条件下，将 DPP 加入镉溶液中，并将温度升高至 310 摄氏度。现在使用连接到 16 号针头的一次性塑料注射器去除 7.5 毫升 0.4 摩尔顶部硒溶液。一旦温度平衡到 310 摄氏度，将温度控制器设置为零摄氏度，然后迅速将顶部硒溶液直接注入镉溶液中。
溶液会从无色变为黄色、橙色，温度会迅速下降并再次升高至约 280 摄氏度。该程序中最困难的步骤是尽快将注射器的整个体积注入镉溶液中。这确保了颗粒均匀地成核。
反应 1 分钟后，从加热套中取出培养瓶，用气流快速冷却，直到温度低于 200 摄氏度。当温度达到约 40 摄氏度时，用 30 毫升己烷稀释，剩余的镉前驱体大部分将从溶液中沉淀出来。通过离心去除该沉淀物。
在 6 个 50 毫升聚丙烯锥形离心管中，每个离心管稀释 12 毫升所得粗纳米 Krystal 溶液。用 40 毫升丙酮，以相同的参数离心后，小心倒出并弃去上清液。接下来，将纳米晶颗粒溶解在己烷中。
用等体积的甲醇提取溶液，保留顶部相。对于第三次提取，请再重复此提取两次。甲醇的体积可以调节到大约 15 毫升，以获得大约 200 微摩尔的纯硒化镉量子点的浓缩己烷溶液。
该反应的典型产率是三个直径为两个三纳米的微摩尔硒化镉晶体确定纳米晶状体的直径和浓度，通过测量书面程序中描述的紫外可见吸收光谱，纳米晶体可以与汞部分交换以红移、吸收和荧光发射。要在带有搅拌棒的 20 毫升玻璃瓶中混合己烷和氯仿，然后加入硒化镉量子点溶液 OLA 和辛烷汞。按照书面程序所述纯化纳米晶体并确定其浓度后，让纳米晶体在室温下老化至少 24 小时以促进壳生长。
在镉前驱体、锌前驱体和硫前驱体的真空加热溶液中制备 0.1 摩尔壳前驱体溶液，在 50 毫升三个瓶颈瓶中回流 1 小时以产生澄清溶液，然后用氩气装入三口烧瓶中。加入拓扑 ODE 和制备的硒化汞镉量子点。在室温下使用侧翼线将己腥抽空。
将温度升高到 100 摄氏度并反流 15 分钟。将管路阀更改为 Argonne 气体，并将热电偶插入纳米 Krystal 溶液中。将温度升高到 120 摄氏度后，加入 0.5 个单层或 140 微升硫前驱体溶液，让反应进行 15 分钟。
将温度提高到 140 摄氏度。加入 0.5 个单层或 140 μL 镉前驱体溶液，让反应进行 15 分钟。然后在反应液中加入 500 微升无水 OLA。
加入 160 摄氏度，加入 0.5 个单层或 220 微升硫前体溶液，然后加入等量的 170 摄氏度锌前体溶液，每次添加之间间隔 15 分钟。然后在 180 摄氏度下，以 15 分钟的间隔添加 0.25 个单层或 150 微升硫前体溶液和锌前体溶液。凉。室温的解和这些粒子的新消光系数。
使用紫外可见光谱，假设纳米晶体的数量没有变化，将反应溶液作为粗混合物储存在冰箱中。在此阶段，可以使用电子显微镜、紫外可见光吸收光谱和荧光光谱对纳米晶体进行表征。将纯化的核壳量子点添加到 50 毫升三颈烧瓶中，并在高真空下去除己嘧啶。
要获得干膜，请在培养瓶中加入 argonne。将无水嘌呤添加到纳米颗粒膜中，并在 1 到 2 小时内将浆料加热到 80 摄氏度。纳米颗粒将完全溶解。
向溶液中加入 1 毫升 1 个 FIO 甘油，并在 80 摄氏度下搅拌 2 小时。将溶液冷却至室温后，加入 0.5 毫升三乙胺，使硫代甘油去质子化，搅拌 30 分钟。由于极性纳米晶体在该溶剂混合物中的溶解度差，因此加入三乙胺后溶液可能会变得浑浊。
将量子点溶液转移到含有 20 毫升己烷和 20 毫升丙酮混合物的 50 毫升锥形离心管中，并充分混合。通过离心分离沉淀的纳米晶体，然后用丙酮洗涤沉淀，用浴超声处理将量子点沉淀溶解在 5 毫升 DMSO 中，然后离心。为了去除可能的聚集体，然后从 UV V 吸收光谱中确定纳米颗粒浓度。
纯量子点的溶液应在三小时内使用，因为表面 ths 在空气的环境条件下会缓慢氧化。用 DMSO 将量子点溶液稀释至 10 μmol 或更低，然后转移到 50 mL烧瓶中。将制备好的 5 毫克/毫升膨胀聚丙烯酸的 DMSO 溶液滴加到量子点溶液中，同时搅拌并在室温下脱气 5 分钟。
用 Argonne 吹扫量子点聚合物溶液，并加热至 80 摄氏度 90 分钟。将溶液冷却至室温后，滴加等体积的 50 毫摩尔钠 pH 8 并搅拌 10 分钟。按照书面程序中的说明纯化量子点，并在带有搅拌棒的 4 毫升玻璃瓶中从紫外可见光吸收光谱中测定浓度，将一摩尔量子点在硼酸盐缓冲液中与 40， 000 倍摩尔过量的 750 道尔顿单氨基聚乙二醇混合。
可以在有关如何向纳米晶体添加特定化学功能的书面程序中找到说明。将 25， 000 倍摩尔过量的新鲜制备的活化剂溶液快速加入量子点溶液中，并在室温下搅拌 30 分钟。再重复此步骤四次，以用 PEG 使纳米 krysttal 表面饱和。
最后，加入 200 微升一摩尔 tris 缓冲液淬灭反应，然后纯化纳米晶体使用透析离心过滤器或超速离心，可以使用液相色谱、凝胶电泳和荧光显微镜分析所得纳米晶体的单分散性、流体动力学尺寸和表面电荷。这里显示的是硒化镉纳米晶体、汞、镉、硒化物、纳米晶体经过镉交换的代表性光谱，以及核中汞镉、壳中镉、硫化锌纳米晶体经过壳层生长。核心硒化镉纳米晶体的荧光量子产率接近 15%，然而，在汞交换后，这种效率下降到不到 1%，这可能是由于表面原子破坏引入了电荷载流子陷阱。
硫化镉锌薄壳的生长将这种效率提高到 70% 以上，这在转移到水中后在很大程度上保持不变。相比之下，除非长出厚壳，否则没有汞掺入的核硒化镉、壳镉、硫化锌纳米晶体在水中会损失很大一部分量子产率。需要注意的是，由于电子电荷载流子泄漏到壳材料中，用硫化镉锌加帽会使光谱变为红色。
对于核心镉核心，这种偏移约为 20 到 30 纳米，并且随着核心中汞含量的增加而增加。因此，通过将汞掺入核心纳米晶体中，可以在不牺牲亮度的情况下保持纳米 Krystal 的小尺寸。该透射电子显微照片显示了小尺寸，核心汞、镉、硒化物、壳镉、硫化锌纳米晶体的粒度分布显示平均直径为 3.2 正负 0.6 纳米。
使用两步相转移到水中对于获得均匀的纳米晶体群至关重要，这些纳米晶体不需要进一步的尺寸分选来去除团簇并聚集尺寸排斥。此处描述的色谱图证实其大小与 con 白蛋白的大小相似。在 75 道尔顿时，用 750 道尔顿氨基 PEG 修饰后，尺寸增加到仅 12 纳米，类似于 IgG 抗体的大小。
PEG 修饰中和了表面电荷，如此处描述的 aros 凝胶电泳实验中证实的那样，孔用箭头标记，电极极性在右侧表示，表明在共轭之前，纳米晶体以离子粒子的形式迁移，并且聚乙二醇化纳米晶体是静电中性的。这里显示的是这些纳米晶体沉积在玻璃盖玻片上并用 545 纳米可见光激发的落射荧光显微照片。这些纳米晶体很容易用电子倍增 CCD 相机以每秒 30 帧的速度在单分子水平上观察到。
该图显示，在连续激发下，每帧中观察到的荧光粒子数量随时间波动。这是由于闪烁和照片退化的结合。在氧化性光降解慢慢变得明显之前，眨眼在前 7 分钟内占主导地位。
看完这个视频，你应该对如何化学合成量子点、如何将它们转移到水性缓冲液中以及如何针对生物成像应用对其进行修饰有了很好的了解。不要忘记，使用含有镉和汞的试剂可能非常危险，应采取额外的预防措施以防止个人接触。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本文描述了针对单分子荧光成像优化的胶体量子点的制备。这些纳米粒子经过工程设计，具有最小化的流体动力学尺寸、增强的亮度和对光降解的稳定性。
关键研究组成部分
科学领域
- 纳米技术
- 荧光成像
- 生物物理学
背景
- 量子点是具有独特光学性质的半导体纳米粒子。
- 由于其亮度和稳定性，它们被用于各种生物成像应用。
- 最小化尺寸和非特异性结合增强了它们在单分子研究中的实用性。
- 硒化镉是用于量子点核心的常见材料。
研究目的
- 制备具有优化亮度和稳定性的荧光量子点。
- 最小化量子点的尺寸以更好地与生物系统兼容。
- 减少与蛋白质和细胞的非特异性结合。
使用的方法
- 制备小型硒化镉量子点核心。
- 与汞合金以将荧光移至红色光谱。
- 在纳米粒子上生长一层薄的合金壳以稳定荧光发射。
- 使用多齿聚合物将颗粒从有机溶剂转移到水性缓冲液中。
主要结果
- 颗粒表现出适合成像的明亮荧光。
- 流体动力学尺寸紧凑，与球状蛋白相当。
- 中性静电荷最小化非特异性相互作用。
- 表征技术证实了制备方法的有效性。
结论
- 优化的量子点对于单分子荧光成像有效。
- 制备方法在增强亮度和稳定性的同时最小化了尺寸。
- 这些纳米粒子可以成为生物研究的宝贵工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
Compact quantum dots enable prolonged single-molecule imaging in crowded biological environments by combining high photostability with minimized hydrodynamic size. This addresses a key limitation in biophysics and cellular signaling studies where conventional labels either photobleach rapidly or perturb native molecular behavior due to size. The technology supports target validation and mechanistic de-risking by allowing direct observation of biomolecular dynamics under near-physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct visualization of single biomolecule interactions in complex milieus.
- Operational Value: Provides stable, long-duration signal for tracking transient binding events and conformational changes.
- Predictive Value: Reduces false negatives in target engagement assays by minimizing label-induced artifacts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, single-molecule resolution data on binding kinetics and heterogeneity.
- Operational Value: Compatible with TIRF and epifluorescence microscopy, requiring no specialized imaging infrastructure beyond standard fluorescence setups.
- Assay Readiness: Hydrodynamic size near 12 nm allows use in physiological buffers without significant diffusion hindrance.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Emission tunable to red/NIR wavelengths (550-800 nm) supports deep-tissue imaging and reduces autofluorescence in vivo.
- Mechanistic De-risking: Enables correlation of single-molecule behavior with cellular phenotypes in disease-relevant models.
- Scalability: Surface PEGylation ensures batch-to-batch consistency in colloidal stability and low nonspecific binding.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement screening to mechanistic follow-up, particularly for validating targets in complex cellular contexts where size and photostability are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling real-time observation of single-molecule interactions in live-cell environments.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence intensity and blinking statistics as reliable readouts for compound effect assessment.
- Analytics: Outputs include hydrodynamic size (via gel chromatography), surface charge (via gel electrophoresis), and emission spectra (via fluorescence spectrometry) for multiparametric validation.
- Translational Research: Red/NIR emission facilitates transition to preclinical imaging studies without label redesign.
- Enterprise Reuse: Core synthesis and surface modification steps are modular, allowing adaptation across different biomolecular targets and assay formats.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity from label artifacts.
- Operational Value: Standardized synthesis and aqueous transfer protocol ensure reproducibility across laboratories and projects.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on direct, single-molecule evidence of target engagement rather than population averages.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing early, high-resolution mechanistic data on lead candidates.
Implementation Considerations
- Expertise in nanomaterial synthesis and air-free Schlenk techniques required for core alloying and shell growth.
- Need for UV-Vis fluorescence spectrometry, gel chromatography, and gel electrophoresis for quality control.
- Standardization of PEGylation conditions critical for maintaining neutral surface charge and hydrodynamic size.
- Adaptation to different biomolecules requires optimization of conjugation chemistry while preserving compact size.
- Limited by the need for rigorous oxygen and moisture control during synthesis to prevent oxidation.
