Name: 紧凑型量子点的单分子成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: 学习制备紧凑型胶体量子点用于单分子荧光成像的方法。该方法通过汞合金化与薄壳生长技术优化纳米粒子的亮度与稳定性，并利用多齿聚合物将其转移至水相缓冲液，最终获得水动力尺寸小、表面电荷中性的高质量荧光探针。

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作者感谢埃默里大学综合显微镜中心的 Hong Yi 博士提供的电子显微镜成像支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）基金（PN2EY018244、R01 CA108468、U54CA119338 和 1K99CA154006-01）资助。

以下合成步骤涉及标准的无水无氧操作技术以及真空/惰性气体多通管的使用；详细的方法可参见文献10和11。在使用前应查阅所有可能有毒和易燃物质的材料安全数据表（MSDS），所有易燃和/或对空气敏感的化合物应在手套箱或手套袋中分装至带有隔垫密封的小瓶中。
1. 硫化汞镉（HgxCd1-xSe）量子点核的合成
<ol>
 <li>制备三辛基膦（TOP）中浓度为 0.4 M 的硒溶液。将硒（0.316 g，4 mmol）加入 50 ml 三颈烧瓶中，通过施伦克线抽真空并用氩气置换。在无氧条件下（干燥氮气或氩气氛围），加入 10 ml TOP，搅拌并加热至 100 °C，持续 1 小时，得到澄清无色的溶液。将溶液冷却至室温，备用。</li>
 <li>向 250 ml 三颈烧瓶中加入氧化镉（CdO 0.0770 g，0.6 mmol）、十四烷基膦酸（TDPA，0.3674 g，1.32 mmol）和十八烯（ODE，27.6 ml），在搅拌下使用施伦克线抽真空。升温至 100 °C，继续抽真空 15 分钟，以去除低沸点杂质。</li>
 <li>在氩气或氮气氛围下，将混合物加热至 300 °C 并维持 1 小时，使 CdO 完全溶解。溶液颜色将由微红色变为澄清无色。随后将溶液冷却至室温。</li>
 <li>向镉溶液中加入十六胺（HDA，7.0 g），加热至 70 °C 并抽真空。当压力稳定后，升温至 100–110 °C，回流 30 分钟。切换施伦克线阀门通入惰性气体，并将热电偶直接插入溶液中。</li>
 <li>在无氧条件下，向溶液中加入二苯基膦（DPP，100 μl），并将温度升至 310 °C。用一次性塑料注射器连接 16 号针头，吸取 7.5 ml 的 0.4 M TOP-Se 溶液（含 3 mmol 硒）。</li>
 <li>当温度稳定在 310 °C 时，将温控器设定为 0 °C，并迅速将 TOP-Se 溶液直接注入镉溶液中。溶液颜色将由无色变为黄橙色，温度迅速下降后回升至约 280 °C。反应 1 分钟后，将烧瓶移离加热套，用气流快速冷却，直至温度低于 200 °C。</li>
 <li>当温度降至约 40 °C 时，加入 30 ml 己烷稀释；大部分未反应的镉前驱体会析出。通过离心（5,000 × g，10 分钟）去除沉淀。</li>
 <li>在六个 50 ml 聚丙烯圆锥形离心管中，各加入 12 ml 粗制纳米晶体溶液，并用 40 ml 丙酮稀释，离心（5,000 × g，10 分钟），小心倾去并弃去上清液。</li>
 <li>将纳米晶体沉淀溶解于己烷（总体积 25 ml）。用等体积甲醇萃取该溶液三次，保留上层相。第三次萃取时，可将甲醇体积调整至约 15 ml，以获得浓度约为 200 μM 的纯 CdSe 量子点己烷溶液。该反应的典型产率为 3 μmol CdSe 纳米晶体，直径为 2.3 nm（反应产率 50–60%）。</li>
 <li>通过测量紫外-可见吸收光谱，并参考 Mulvaney 及其同事12的尺寸拟合图以及 Bawendi 及其同事13的消光系数相关数据，确定纳米晶体的直径和浓度。详见附录。</li>
 <li>汞离子交换：可通过部分汞离子交换使吸收和荧光发射发生红移。在 20 ml 玻璃小瓶中按以下顺序加入各组分并放入搅拌子（此反应可按需放大）：3 ml 己烷、2 ml 氯仿、1 ml 200 μM CdSe 量子点溶液（200 nmol）、15 μl 油胺（OLA）以及 500 μl 氯仿中的 0.1 M Hg(OT)2 溶液。硫代辛酸汞（HgOT2）可通过乙酸汞与辛硫醇在甲醇中反应制备（见附录）。随着离子交换反应的进行，可通过紫外-可见吸收光谱监测红移程度。当达到目标吸收峰后，测量纳米晶体溶液在 350 nm 处的吸光度，并确定新的消光系数（假设纳米晶体浓度未变，本例中为 30.7 μM）。通过去除未反应的汞来终止反应：加入 5 ml 癸烷、10 ml 己烷和 7 ml 甲醇进行萃取，保留含纳米晶体的上层相。再用己烷和甲醇萃取两次，并调节甲醇体积，使上层相体积约为 7 ml。若两相分离缓慢，可进行离心（5,000 × g，10 分钟）。向纳米晶体中加入 100 μl TOP、100 μl OLA 和 100 μl 油酸，随后加入 40 ml 丙酮诱导沉淀。通过离心收集纳米晶体，并重新分散于 3 ml 己烷中。再次离心以去除不溶物，并使用 350 nm 处新的消光系数重新测定纳米晶体浓度。将纳米晶体溶液在室温下陈化至少 24 小时，再进行下一步操作。</li>
</ol>
2. 硫化镉锌（CdyZn1-yS）壳层的生长
<ol>
 <li>在50 ml三颈烧瓶中配制0.1 M的壳层前驱体溶液。镉前驱体：乙酸镉水合物（230.5 mg，1 mmol）和10 ml油胺（OLA）。锌前驱体：乙酸锌（183.5 mg，1 mmol）和10 ml OLA。硫前驱体：硫粉（32.1 mg，1 mmol）和10 ml十八烯（ODE）。在真空条件下将各溶液加热至回流1小时，得到澄清溶液，随后用氩气置换气氛。硫前驱体溶液可冷却至室温，而镉和锌前驱体溶液需维持在约50 °C。壳层前驱体用量的计算方法见参考文献14。</li>
 <li>向一个三颈烧瓶中加入：HgxCd1-xSe量子点（120 nmol，直径2.3 nm）、ODE（2 ml）和三辛基氧化膦（TOPO，250 mg）。通过Schlenk线在室温下除去己烷。将温度升至100 °C并回流15分钟。切换Schlenk线阀门通入氩气或氮气，并将热电偶插入纳米晶体溶液中。</li>
 <li>将温度升至120 °C，加入0.5个单层的硫前驱体溶液（140 μl），反应继续进行15分钟。可用玻璃注射器取出少量等分试样（&lt;50 μl），通过荧光和/或紫外-可见吸收光谱法监测反应进程。随后将温度升至140 °C，加入0.5个单层的镉前驱体溶液（140 μl），继续反应15分钟。向反应体系中加入500 μl无水OLA。</li>
 <li>在160 °C下加入0.5个单层的硫前驱体溶液（220 μl），然后在170 °C下加入等量的锌前驱体溶液，每次加料间隔15分钟。随后在180 °C下以15分钟为间隔交替加入0.25个单层的硫前驱体溶液（150 μl）和锌前驱体溶液。</li>
 <li>将反应溶液冷却至室温，并利用紫外-可见光谱重新计算这些粒子的消光系数，假设纳米晶体数量未发生变化（120 nmol溶于3.8 ml反应溶液中）。将反应液作为粗产物混合物存于冰箱中；可根据需要按照1.8和1.9节所述方法解冻并纯化纳米晶体。</li>
 <li>可采用电子显微镜、紫外-可见吸收光谱和荧光光谱对纳米晶体进行表征。量子产率可通过积分球进行绝对测定，或参照已知标准品，采用参考文献15所述方法进行相对计算。</li>
</ol>
3. 相转移
<ol>
 <li>将纯化的核/壳结构 HgxCd1-xSe/CdyZn1-yS 量子点（5 ml，20 μM）加入50 ml三口烧瓶中，在高真空下除去正己烷，得到干燥的薄膜。向烧瓶中充入氩气，加入无水吡啶（3 ml）溶解纳米颗粒薄膜，并将悬浮液加热至80 °C。在1–2小时内，纳米颗粒将完全溶解。</li>
 <li>向溶液中加入1-巯基甘油（1 ml），在80 °C下搅拌2小时。然后将溶液冷却至室温，并加入三乙胺（0.5 ml）以去质子化巯基甘油，继续搅拌30分钟。加入三乙胺后，溶液可能因极性纳米晶体在此溶剂混合物中溶解度较差而变浑浊。</li>
 <li>将量子点溶液转移至含有20 ml正己烷和20 ml丙酮混合液的50 ml锥形离心管中，充分混合。通过离心（5,000 ×g，10分钟）分离析出的纳米晶体，并用丙酮洗涤沉淀物。</li>
 <li>将量子点沉淀物用DMSO（5 ml）溶解，并通过浴式超声处理助溶，然后离心（7,000 ×g，10分钟）以去除可能存在的聚集体。根据紫外-可见吸收光谱测定纳米颗粒浓度。该纯量子点溶液应在3小时内使用，因为在空气环境中表面巯基会缓慢氧化。</li>
 <li>用DMSO将量子点溶液稀释至10 μM或更低浓度，并转移至50 ml烧瓶中。配制5 mg/ml的巯基化聚丙烯酸溶液（合成方法见附录）于DMSO中。在搅拌条件下，将聚合物溶液（每nmol量子点加入0.15 mg聚合物）逐滴加入量子点溶液中，并在室温下脱气5分钟。</li>
 <li>用氩气吹扫量子点/聚合物溶液，然后加热至80 °C反应90分钟。随后将溶液冷却至室温，并逐滴加入等体积的50 mM硼酸钠缓冲液（pH 8）。搅拌10分钟。</li>
 <li>通过透析（截留分子量20 kDa）在50 mM硼酸钠缓冲液（pH 8）中纯化量子点，然后使用离心过滤器（截留分子量10 kDa）浓缩颗粒。根据紫外-可见吸收光谱测定其浓度。</li>
</ol>
4. PEG 涂层
<ol>
 <li>在含有搅拌子的 4 ml 玻璃小瓶中，将 1 nmol 的量子点（QDs）与 40,000 倍摩尔过量的 750 Da 单氨基聚乙二醇（30 mg，40 μmol）在硼酸盐缓冲液中混合。若需向纳米晶体引入特定化学功能基团（例如 酰肼或马来酰亚胺）时，可通过将部分氨基-PEG替换为异双功能氨基-PEG（通常30%摩尔分数效果良好）来引入。用硼酸盐缓冲液将纳米晶体溶液稀释至1 μM。该反应可根据需要进行放大。</li>
 <li>将DMTMM（20 mg，72 μmol）溶于DMSO（144 μl）中，配制新鲜溶液。可通过温水浴或超声波清洗器短暂加热，以确保DMTMM完全溶解。迅速向量子点（QD）溶液中加入该0.5 M DMTMM溶液的25,000倍摩尔过量溶液（50 μl），室温下搅拌反应30分钟。</li>
 <li>重复步骤4.2四次，以使纳米晶体表面充分结合PEG。最后，加入200 μl 1 M Tris缓冲液终止反应，并通过透析、离心过滤或超速离心法纯化纳米晶体。</li>
 <li>可采用液相色谱、琼脂糖凝胶电泳和荧光显微镜对纳米晶体进行单分散性、流体动力学尺寸及表面电荷的分析。为利用自动化液相色谱系统（GE AKTAprime Plus）测定流体动力学尺寸及尺寸分布，应使用Superose 6色谱柱，以PBS缓冲液为洗脱液，流速设为0.5 ml/min，并在260 nm或280 nm波长下进行吸光度检测。将纳米颗粒的洗脱时间与已知分子量标准品的洗脱时间进行比较。进行琼脂糖凝胶电泳时，使用50 mM硼酸钠缓冲液（pH 8.5）或50 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.4）配制0.5%琼脂糖凝胶，将1 μM样品与10%甘油混合后上样至加样孔，以100 V电压电泳30分钟。使用紫外手持灯或紫外透射仪结合荧光激发对凝胶中的纳米晶体成像。为在单分子水平下通过荧光显微镜观察纳米晶体，将颗粒稀释至10 mM磷酸盐缓冲液中浓度为0.2 nM，取2.5 μl该溶液滴加于玻璃盖玻片上，再小心地将另一张盖玻片覆盖于液滴之上，使液体在两张盖玻片间形成均匀薄膜。使用高数值孔径物镜（理想情况下至少1.40），在倒置荧光或全内反射荧光（TIRF）模式下，以400–580 nm波长范围内的激发光结合电子倍增CCD相机对表面固定的颗粒进行成像。具体的成像参数将因显微镜系统的不同而有所差异。

液相色谱, 纳米晶体, 单分散性, 流体动力学尺寸, 表面电荷, 琼脂糖凝胶电泳, 荧光显微镜, Superose 6色谱柱, PBS缓冲液, 分子量标准品, 硼酸钠缓冲液, 磷酸钠缓冲液, 甘油, 紫外成像, 单分子成像, 高数值孔径物镜, 全内反射荧光显微镜, 电子倍增CCD相机</li>
</ol>

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</ol>

未声明任何利益冲突。

与传统的CdSe量子点相比，三元合金HgxCd1-xSe纳米晶体的尺寸和荧光波长可独立调控。首先在CdSe纳米晶核的合成过程中确定尺寸，随后通过二次汞阳离子交换步骤选择荧光波长，该过程不会显著改变纳米晶体的尺寸9。在包覆前，必须将纯化后的HgxCd1-xSe纳米晶体在室温下孵育至少24小时。这一过程可使部分弱吸附的汞阳离子扩散进入纳米晶体晶格。若不进行此步骤，解离的汞离子可能引发HgS纳米晶体的均相成核，导致在近红外区域常出现第二个荧光峰。
在本研究展示的示例中，我们制备了尺寸约为2.3 nm的CdSe核，通过调节掺入核晶格中的汞含量，其荧光可在550–800 nm范围内调节。包覆2.5个单层的壳后，这些量子点的最终直径约为3.2 nm，这实际上是我们能够制备的、既具有足够光稳定性又具有足够亮度用于单分子成像的最小尺寸纳米粒子（消光系数约为350,000 M⁻¹cm⁻¹）。-1 厘米-1 在400 nm处激发且在水中量子产率接近...

<table><tbody><tr><td>硒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229865</td><td></td></tr><tr><td>三正辛基膦</td><td>Strem</td><td>15-6655</td><td>97% 纯度，空气中不稳定</td></tr><tr><td>氧化镉</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202894</td><td>剧毒：小心使用 </td></tr><tr><td>十四烷基磷酸</td><td>PCI合成</td><td>4671-75-4</td><td></td></tr><tr><td>十八碳烯</td><td>Alfa Aesar</td><td>L11004</td><td>技术级</td></tr><tr><td>十六烷基胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7408</td><td></td></tr><tr><td>二苯基膦</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252964</td><td>易燃的</td></tr><tr><td>醋酸汞</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>456012</td><td>剧毒：小心使用</td></tr><tr><td>1-辛硫醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471836</td><td>强烈气味</td></tr><tr><td>油酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W281506</td><td></td></tr><tr><td>乙酸锌 </td><td>Alfa Aesar</td><td>35792</td><td></td></tr><tr><td>乙酸镉水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229490</td><td>剧毒：小心使用</td></tr><tr><td>Oleylamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12954</td><td>在空气中不稳定</td></tr><tr><td>硫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>344621</td><td></td></tr><tr><td>三辛基氧化膦</td><td>Strem</td><td>15-6661</td><td>99%</td></tr><tr><td>吡啶</td><td>VWR</td><td>EM-PX2012-6</td><td>无水</td></tr><tr><td>巯基甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1753</td><td>强烈气味</td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471283</td><td>无水</td></tr><tr><td>透析管</td><td>Spectrum Labs</td><td>131342</td><td>20 kDa 截留分子量</td></tr><tr><td>离心过滤器</td><td>Millipore</td><td>UFC801024</td><td>10 kDa 截留分子量</td></tr><tr><td>单氨基-PEG</td><td>Rapp Polymere</td><td>12 750-2</td><td>750 Da</td></tr><tr><td>DMTMM，4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物水合物</td><td>Alfa Aesar</td><td>H26333</td><td></td></tr><tr><td>AKTAprime Plus 层析系统</td><td>GE医疗集团</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL 色谱柱</td><td>GE医疗集团</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖，OmniPur</td><td>VWR</td><td>EM-2120</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;附录&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;em&gt;辛硫醇汞的合成&lt;/em&gt;：在室温下，将乙酸汞（1 当量）的甲醇溶液缓慢加入至1-辛硫醇（3 当量）和氢氧化钾（3 当量）的甲醇搅拌溶液中。通过过滤分离析出的乙酸汞(II)辛硫醇盐沉淀，依次用甲醇洗涤两次、乙醚洗涤一次，然后在真空条件下干燥。&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;em&gt;多齿配体聚合物的合成&lt;/em&gt;：在150 ml三颈烧瓶中，将聚丙烯酸（1 g，1,773 Da）溶于25 ml二甲基甲酰胺（DMF）中，并通入氩气鼓泡30分钟。加入半胱胺的无水DMF溶液（374 mg，4.87 mmol，溶于10 ml DMF）。室温下剧烈搅拌，于30分钟内缓慢加入无水二异丙基碳二亚胺（DIC，736 mg，5.83 mmol），随后加入三乙胺（170 &amp;mu;l，1.22 mmol），在60 °C下反应72小时 &amp;deg;C. 加入巯基乙醇&amp;#8211;加入乙醇（501 mg，6.41 mmol）以淬灭反应，并在室温下搅拌2小时。通过旋转蒸发除去DMF，加入冰丙酮:氯仿（2:1）混合液沉淀聚合物，随后离心分离。将聚合物溶于约5 ml无水DMF中，过滤后用乙醚再次沉淀，并重复该过程。将产物在真空下干燥并保存于氩气氛围中。&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;em&gt;CdSe 核直径的测定&lt;/em&gt;：根据紫外-可见吸收光谱确定第一激子峰的波长（&amp;#955;，单位为 nm），即最长波长的峰（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; CdSe 的波长约为 498 nm &lt;强&gt;图 2a&lt;/strong&gt;，并使用 Mulvaney 及其同事提供的尺寸曲线 &lt;sup&gt;12&lt;/sup&gt;:&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;img src=&quot;/files/ftp_upload/4236/4236eq1.jpg&quot; alt=&quot;公式 1&quot;/&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;em&gt;CdSe纳米晶体浓度的测定&lt;/em&gt;：从经过背景扣除的CdSe纳米晶体透明溶液的紫外-可见光谱中，确定在350 nm波长处的吸光度。可通过系列稀释法判断光学吸光度是否处于比尔定律的线性范围内。纳米晶体浓度（&lt;em&gt;QD&lt;/em&gt;，单位为 M）可通过代入纳米晶体直径（&lt;em&gt;D&lt;/em&gt;，单位为 nm），光吸收值（&lt;em&gt;A&lt;sub&gt;3sa&lt;/sub&gt;&lt;/em&gt;），以及比色皿的光程（&lt;em&gt;l&lt;/em&gt;，代入Bawendi及其同事提出的经验关联方程（单位：cm） &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;:&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;img src=&quot;/files/ftp_upload/4236/4236eq2.jpg&quot; alt=&quot;公式 2&quot;/&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

用于单分子成像的紧凑型量子点

Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

单分子成像技术是理解生物分子功能机制以及可视化细胞生物学中分子行为在空间和时间上异质性的重要工具1-4。为了对单个目标分子进行成像，通常需将其与荧光标记物（染料、蛋白质、微球或量子点）连接，并通过落射荧光显微镜或全内反射荧光（TIRF）显微镜进行观察。尽管染料和荧光蛋白数十年来一直是荧光成像的主要工具，但在观测单个分子所需高光子通量条件下，它们的荧光信号不稳定，通常在数秒内即发生信号完全淬灭。乳胶微球及染料标记的微球虽可提供更稳定的信号，但其流体力学尺寸显著增大，可能不利地改变被研究分子的扩散行为和生物学特性。
量子点（QDs）在上述两种存在问题的体系之间提供了一种平衡。这些纳米颗粒由半导体材料组成，可通过工程设计获得流体动力学尺寸紧凑且对光降解具有极强抗性的特性5。因此近年来，量子点在实现对单个分子水平上复杂大分子行为的长期观测方面发挥了关键作用。然而，这些颗粒在分子拥挤的环境中（如细胞质和神经元突触间隙）仍被发现表现出扩散受阻的现象，因其尺寸仍然过大4,6,7。
近期，我们对量子点（QD）的核结构和表面涂层进行了工程化设计，以实现最小的流体力学尺寸，同时平衡了过去阻碍紧凑型量子点应用的胶体稳定性、光稳定性、亮度以及非特异性结合等问题8,9。本文旨在展示这些优化纳米晶体的合成、修饰与表征过程，其结构由合金化的HgxCd1-xSe核组成，外层包覆绝缘的CdyZn1-yS壳，并进一步修饰以带有短聚乙二醇（PEG）链的多齿聚合物配体（图1）。与传统的CdSe纳米晶体相比，HgxCd1-xSe合金具有更高的荧光量子产率，可在红光和近红外波长范围发射荧光，从而在细胞中实现更高的信噪比，且可被非细胞毒性的可见光波长激发。多齿聚合物涂层以闭合且扁平的构象结合于纳米晶体表面，以最小化流体力学尺寸，而PEG则中和表面电荷，以减少与细胞及生物分子的非特异性结合。最终获得的纳米晶体荧光亮度高，发射波长范围为550–800 nm，总流体力学尺寸接近12 nm。这一尺寸与细胞内许多可溶性球状蛋白质相当，显著小于传统的PEG化量子点（25–35 nm）。

图2展示了CdSe纳米晶体、经阳离子交换后的HgxCd1-xSe纳米晶体，以及壳层生长后的HgxCd1-xSe/CdyZn1-yS纳米晶体的代表性吸收光谱和荧光光谱。核心CdSe纳米晶体的荧光量子产率接近15%（包含长波长深陷阱发射），但在汞交换后，该效率降至1%以下，这可能是由于表面原子结构破坏引入了载流子陷阱所致9。然而，生长一层薄的CdyZn1-yS壳层可使该效率提升至70%以上，在转移至水中后仍能保持大部分效率（典型值为50%）。相比之下，不含汞的核心纳米晶体CdSe/CdyZn1-yS在水中会损失大量量子产率，除非生长较厚的壳层。因此，通过在核心纳米晶体中引入汞，可在不牺牲亮度的前提下保持纳米晶体的小尺寸（参见图3中的透射电子显微镜图像）。需要注意的是，使用CdyZn1-yS进行...

我们描述了一种制备具有最小流体动力学尺寸的胶体量子点的方法，用于单分子荧光成像。与传统量子点相比，这些纳米粒子的尺寸与球状蛋白质相似，并在单分子亮度、抗光降解稳定性以及抵抗与蛋白质和细胞的非特异性结合方面进行了优化。

单分子成像技术是理解生物分子功能机制以及可视化其空间和时间动态的重要工具……

本实验的总体目标是制备具有优化亮度和稳定性，并且尺寸小、非特异性结合少的荧光量子点，用于单分子成像。该目标的实现首先通过制备小尺寸的硒化镉量子点核心；第二步是将这些核心与汞进行合金化，以使其荧光红移至红光光谱区域并提高其亮度。接下来，在纳米晶体上生长一层薄合金壳，以稳定其荧光发射。最后一步是使用多齿聚合物将这些颗粒从有机溶剂转移至水相缓冲液中，该聚合物可修饰上生物惰性的聚乙二醇。最终，通过荧光光谱法、凝胶色谱法和凝胶电泳法证明，这些颗粒具有明亮的荧光、紧凑的流体力学尺寸和中性的静电电荷，这些特性非常适合用于生物学中的单分子荧光成像。与现有商用材料相比，这些量子点的主要优势在于其显著减小的流体动力学尺寸。尽管较小的量子点会受到荧光强度降低、荧光稳定性下降以及仅在蓝光谱范围内发光等不利影响，但我们通过汞阳离子交换工艺克服了这些效应。这些纳米晶体有助于通过在拥挤的生物环境中实现单个生物分子的动态成像，从而解答生物物理学和细胞信号传导领域中的关键科学问题。首先，在无水无氧条件下，将硒加入50毫升三颈烧瓶中，通过高真空对烧瓶进行抽气，并使用Schlenk管线用氩气填充。加入10毫升TOP，搅拌并加热至100摄氏度，持续一小时，得到澄清无色的溶液，从而制备出0.4摩尔的硒TOP溶液。将溶液冷却至室温，并将烧瓶放置一旁。同时，按照书面实验方案中列出的用量，在250毫升三颈烧瓶中配制氧化镉、TDPA和ODE的混合溶液。在本视频的指导下，一边搅拌一边使用旋蒸仪对溶液进行抽真空处理。将温度升至100摄氏度，并继续抽真空15分钟。在氩气氛围下除去低沸点杂质，将混合物加热至300摄氏度并保持一小时，使氧化镉完全溶解。溶液颜色将由红色变为无色透明，随后将溶液冷却至室温。接下来，将 HDA 加入镉溶液中，加热至 70 摄氏度并抽真空。当达到恒定压力后，升高温度并回流溶液 30 分钟。将 Schlenk 线的阀门切换至惰性气体，并将热电偶直接插入溶液中。在无空气条件下，将 DPP 加入镉溶液中，并将温度升至 310 摄氏度。然后使用连接 16 号针头的一次性塑料注射器吸取 7.5 毫升 0.4 摩尔的上层硒溶液。当温度稳定在 310 摄氏度后，将温度控制器设为 0 摄氏度，并迅速将上层硒溶液直接注入镉溶液中。溶液将从无色变为黄色、橙色，温度会迅速下降，随后再次升高至约 280 摄氏度。该步骤中最困难的部分是将注射器中的全部液体尽快注入镉溶液中，以确保颗粒均匀成核。反应一分钟后，将烧瓶从加热套上取下，并用气流快速冷却，直至温度低于200摄氏度。当温度降至约40摄氏度时，加入30毫升正己烷稀释，大部分剩余的镉前驱体会从溶液中析出。通过离心去除该沉淀物。在六个50毫升聚丙烯圆锥形离心管中，分别将12毫升所得的粗制纳米Krystal溶液用40毫升丙酮稀释。随后以相同参数离心，小心倾去并弃除上清液。接下来，将纳米Krystal沉淀溶解于己烷中。用等体积的甲醇萃取溶液，保留上层相。第三次萃取时再重复此步骤两次。甲醇的体积可调整至约15毫升，以获得浓度约为200微摩尔的纯硒化镉量子点的浓缩正己烷溶液。该反应的典型产率为三微摩尔的硒化镉晶体，直径为二至三纳米。通过测量紫外-可见吸收光谱来确定纳米晶体的直径和浓度，具体方法见书面实验步骤。可通过部分汞交换使纳米晶体的吸收和荧光发射发生红移。具体操作如下：在20毫升玻璃小瓶中加入搅拌子，混合正己烷和氯仿，然后加入硒化镉量子点溶液、油胺（OLA）和辛酸汞。按照书面实验步骤纯化纳米晶体并测定其浓度后，将纳米晶体在室温下静置至少24小时，以促进壳层生长。在50毫升三颈烧瓶中配制0.1摩尔的壳前驱体溶液，在真空条件下加热镉前驱体、锌前驱体和硫前驱体溶液，回流一小时，得到澄清溶液，然后向三颈烧瓶中通入氩气。加入TOPO（三辛基氧化膦）和已制备的汞镉硒量子点。通过侧管在室温下抽除己烷。将温度升至100摄氏度，回流15分钟。切换气路阀门至氩气，将热电偶插入纳米晶体溶液中。当温度升至120摄氏度后，加入0.5个单层或140微升的硫前驱体溶液，继续反应15分钟。将温度升至140摄氏度。加入0.5个单层或140 µL的镉前驱体溶液，使反应继续进行15分钟。然后向反应溶液中加入500 µL无水OLA。在160摄氏度下加入0.5个单层，或220微升硫前驱体溶液，随后在170摄氏度下加入等量的锌前驱体溶液，每次加入间隔15分钟。然后在180摄氏度下，以15分钟为间隔，分别加入0.25个单层，或150微升硫前驱体溶液和锌前驱体溶液。冷却至室温，并测定这些颗粒的新消光系数。使用紫外-可见光谱，在假设纳米晶体数量未发生变化的前提下，将反应溶液作为粗产物混合物储存于冰箱中。在此阶段，可采用电子显微镜、紫外-可见吸收光谱法和荧光光谱法对纳米晶体进行表征。将纯化的核壳量子点加入50毫升三颈圆底烧瓶中，并在高真空条件下除去己烷。为获得干燥薄膜，向烧瓶中通入氩气。加入无水嘌呤至纳米颗粒薄膜中，并在1至2小时内将浆液加热至80摄氏度。纳米颗粒将完全溶解。向溶液中加入1毫升FIO甘油，在80摄氏度下搅拌2小时。将溶液冷却至室温后，加入0.5毫升三乙胺以使巯基甘油去质子化，并继续搅拌30分钟。由于极性纳米晶体在此溶剂混合物中溶解度较差，加入三乙胺后溶液可能变得浑浊。将量子点溶液转移至含有20毫升正己烷和20毫升丙酮混合液的50毫升锥形离心管中，充分混匀。通过离心分离析出的纳米晶体，随后用丙酮洗涤沉淀物，将量子点沉淀物溶于5毫升DMSO中，并使用水浴超声处理，然后进行离心。为去除可能存在的聚集体，再通过紫外-可见吸收光谱测定纳米粒子的浓度。纯量子点溶液应在三小时内使用，因为其表面的硫醇基团在空气环境中会缓慢氧化。用DMSO将量子点溶液稀释至10微摩尔或更低浓度，并转移至50毫升的烧瓶中。在搅拌条件下，将预先配制的5毫克/毫升聚丙烯酸DMSO溶液逐滴加入量子点溶液中，然后在室温下对溶液脱气处理五分钟。用氩气吹扫量子点聚合物溶液，并在80摄氏度下加热90分钟。将溶液冷却至室温后，逐滴加入等体积的50毫摩尔、pH为8的钠盐溶液，搅拌10分钟。按照书面实验步骤纯化量子点，并通过紫外-可见吸收光谱测定其浓度。在4毫升玻璃小瓶中（内含搅拌子），将1摩尔量子点与硼酸盐缓冲液混合，加入40,000倍摩尔过量的750道尔顿单氨基聚乙二醇。有关如何向纳米晶体添加特定化学功能的说明，可参见书面操作步骤。将新配制的活化剂溶液以25,000倍摩尔过量迅速加入量子点溶液中，并在室温下搅拌30分钟。重复此步骤四次，以使纳米晶体表面充分饱和地结合PEG。最后，加入200 µL的1摩尔Tris缓冲液以终止反应，随后通过透析离心滤器或超速离心进行纳米晶体的纯化。所得纳米晶体可通过液相色谱、凝胶电泳和荧光显微镜分析其单分散性、流体动力学尺寸和表面电荷。图中展示了硒化镉纳米晶体、经阳离子交换后的汞掺杂硒化镉纳米晶体，以及壳层生长后的核-壳结构汞镉硒化物/硫化锌纳米晶体的代表性吸收光谱和荧光光谱。其中，核部为硒化镉的纳米晶体荧光量子产率接近15%；然而，在汞交换后，该效率下降至1%以下，这可能是由于表面原子结构破坏引入了载流子陷阱所致。生长一层硫化镉锌薄壳可将量子效率提升至70%以上，且在转移至水中后仍能基本保持该效率。相比之下，不含汞的硒化镉核、硫化镉锌壳纳米晶体在水中会损失大量量子产率，除非生长出较厚的外壳。需要注意的是，由于电子载流子泄漏到壳层材料中，硫化镉锌包覆会导致光谱发生红移。对于核为镉的纳米晶体，这种红移约为20至30纳米，并随着核中汞含量的增加而增大。因此，通过将汞掺入纳米晶体核心，可以在不牺牲亮度的情况下保持纳米晶体的较小尺寸。这一较小尺寸在此处的透射电子显微图像以及汞-镉-硒核、镉-锌硫化物壳纳米晶体的粒径分布中得到证实，其平均直径为3.2±0.6纳米。采用两步相转移至水相的方法对于获得均一的纳米晶体群体至关重要，该方法无需进一步的尺寸筛选即可去除聚集体和团簇。此处所示的尺寸排阻色谱图证实，其尺寸与伴白蛋白相似。在分子量为75千道尔顿的基础上，经750道尔顿的氨基-PEG修饰后，尺寸仅增加至12纳米，与IgG抗体的尺寸相近。PEG 修饰可中和表面电荷，这一点已通过此处所示的琼脂糖凝胶电泳实验得到证实。图中以箭头标示加样孔，右侧标明电极极性，显示在偶联前，纳米晶体以带电粒子形式迁移，而经 PEG 修饰的纳米晶体则呈静电中性。图中所示为将这些纳米晶体沉积于玻璃盖玻片上，并用 545 纳米可见光激发后获得的落射荧光显微图像。利用电子倍增 CCD 相机，可在每秒 30 帧的速率下轻松观察到单分子水平的这些纳米晶体。该图显示，在持续激发下，每帧中观察到的荧光颗粒数量随时间发生波动。这是由于闪烁和光降解共同作用所致。在前七分钟内，闪烁占主导地位，随后氧化性光降解逐渐显现。观看本视频后，您应能充分理解如何化学合成量子点、如何将其转移至水相缓冲液中，以及如何对其进行修饰以用于生物成像应用。请务必注意，使用含镉和汞的试剂可能具有极高危险性，应采取额外预防措施以避免个人接触。

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用于单分子成像的紧凑型量子点

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