单分子荧光显微镜在平面支持双层膜

在本视频中，我们将展示如何制备和表征生物功能化平面支持的脂质比拉。我们还将详细描述具有单分子检测能力的全内反射显微镜的结构。我们将测量脂质的激发功率密度、流动性和蛋白质密度。

让我们从简短的介绍 To planar glass supported lipid blay.当小的单柱状囊泡遇到干净的玻璃表面时，它们会破裂并扩散形成连续的脂质双层。在水垫上，我们通常选择手掌材料。

Ole 磷酸胆碱或 POPC 具有主要脂质，因为它在室温和 37 摄氏度下产生液体脂质双层。为了实现功能化，我们添加了安氧镍，这是一种具有镍螯合头基的合成脂质，可结合多聚组胺标签蛋白。例如，共刺激分子 B seven one、粘附分子 ICAM 1 和用于 T 细胞识别的荧光标记肽负载 MHC 分子，如图所示，然而，这种双层系统原则上可用于解决各种生物系统中完全不同的过程。

由于平面系统的性质，可以在全内反射模式下监测荧光事件，这大大降低了细胞背景，非常适合单分子荧光显微镜检查对于脂质制备，需要脂质、POPC 和镍安氧氯仿，以及一个干净的圆底烧瓶以所需的比例溶解脂质和氯仿，并在真空下干燥它们，如图所示。经过一夜的高真空处理后，脂质在培养瓶内部形成一层薄膜。对于脂质再水化，使用 10 毫升 Degas PBS 的 Degas PBS 加入干燥的脂质混合物中。

请勿混合。现在为避免脂质氧化，请在烧瓶中加入惰性气体（如氮气或氩气），旋转烧瓶。脂质形成乳白色的悬浮液。

取一小份样品作为分光光度计的空白样品，以防止在下一步中进行气体交换。正确密封装有脂质悬浮液的培养瓶非常重要。使用热稳定的胶带，例如，高压灭菌胶带，在物理形成过程中使用封闭的超声波浴进行空气保护。

安装烧瓶后，以最大 170 瓦的功率开始超声处理程序。Sonic Cade 60 分钟。由于物理形成，浊度已显着下降。

这可以通过 550 纳米的分光光度法来验证。使用超声处理前取的等分试样作为空白。230 纳米的光密度，表示脂质量应保持恒定。

在这里，我们用 1 毫升 visl 悬浮液填充小的超速离心管，并将它们放入台式超速离心机的固定角转子中。仅使用小的 uni laina 囊泡进行双层制备非常重要。更大、更致密的多 laina 囊泡也在超声处理过程中形成，会干扰双层流动性，因此必须通过离心去除和去除。

首先，我们在室温下以 150， 000 G 离心 1 小时。然后将所得 snat 在 288， 000 G 和 4 摄氏度下再离心 8 小时。玻璃灯必须非常干净，脂质囊泡才能在其上扩散以形成连续的流体双层。

为此，我们将盖玻片放入特氟龙堆中，然后将其放入玻璃容器练习中。在保护眼睛、防护手套和实验室外套并在化学柜中工作的地方要格外小心。我们加入一份 30% 的过氧化氢，然后加入三份浓硫酸，以产生非常反应性和氧化性的骨膜一硫酸。

这种混合物与有机物质发生剧烈反应，包括皮肤、眼睛和衣服中的有机物质。它立即升温。将玻片孵育 30 分钟。

用力抓住盖玻片 使用 W 蒸馏水或优质工会水彻底洗去干净盖玻片两侧的酸。然后将玻片放在特氟龙支架上，干燥不超过 10 分钟，以便能够一次产生几个单独的脂质双层。我们用快速硬化的方式粘合干燥的盖玻片。

将双组分环氧树脂胶水粘合到 8 孔或 16 孔 Lab Tech 腔室中。首先，小心地从框架中取出原来的 lept 载玻片。将两种胶水成分以 1 比 1 的比例混合。

将其均匀地铺开到腔室框架的底部凹槽中。将干净的盖玻片放在腔室框架的胶水覆盖底部。确保胶水均匀分布在载玻片和塑料框架之间。

让胶水硬化 30 分钟。在 PBS 1 到 10 中稀释脂质物理悬浮液，然后通过 0.2 微米过滤器以 120 微升这种稀释液过滤到 8 孔室的每个孔中，或 60 微升过滤到 16 孔室的每个孔中。确保整个玻璃表面被覆盖并等待 20 分钟。

双层现已形成 为了去除残留的 les，用 30 毫升 PBS 冲洗每个孔。不惜一切代价避免玻璃表面暴露在空气中。这将立即破坏双层，以确保每个孔都包含相同体积的缓冲液 对于以下蛋白质修饰步骤，完全填充每个孔并去除液体圆顶。

取出 330 微升。这将在每个中留下大约 350 微升。为了用蛋白质装饰双层，准备含有所选多聚组胺技术蛋白的预混液，并向每个孔中加入 50 微升。

蛋白质与深色脂质的镍抗头部基团结合，以确保结果的可重复性，充分但仔细地混合，并始终孵育 60 分钟以去除未结合的蛋白质。用 30 毫升 PBS 再次洗涤。现在让我们关注显微镜硬件。

首先，我们将说明全内反射显微镜对基于目标的草坪显微镜的要求。需要具有高数值孔径的油浸物镜。入射激光激发光束被二向色镜反射，并通过一组两个或三个透镜聚焦到物镜的后焦平面上。

然后，激光以镀膜光束的形式沿光轴引导物镜。这样，荧光标本的整个深度都被照亮。当您垂直于光轴移动光束时，光束保持排列，但以倾斜的方式离开物镜。

如果继续移位，您将在某个点达到光束在玻璃盖玻片和样品之间的界面上完全反射的临界角。产生的倏逝波的强度呈指数衰减，只有靠近界面的 4 层（最接近数百纳米）被激发。现在，我们说明如何手动将激光束聚焦到物镜的后焦平面上。

使用三个或两个透镜和前两个透镜，激光束的直径会增加。它们的焦距比决定了标本平面上照明点的大小。为确保光束保持匀定，请调整这些透镜之间的距离，使其等于两个焦距的总和。

第三个透镜用于将加宽光束聚焦到物镜的后焦平面中。因为这个镜头的焦距需要适应显微镜主体和相关潜望镜的尺寸，所以在我们的例子中，它必须长得多，变化 75 厘米。透镜 2 和 3 之间的距离对光束属性没有影响。

因此，中间的无限空间可用于以定义的方式修改光束，而不会发生变形。例如，您可以插入一个孔径并精确投影到标本平面上。从本质上讲，您可以使用两个镜头而不是三个镜头来实现相同的效果。

双透镜系统不太明确，但引入的透镜像差较少。简单的功能，如孔径 仍然可以很好地实现 temporal Modulation。气体、铁或固态激光器应放置在毫秒距离快门的前面，例如机械快门或铝光调制器。

一个很好的选择是二极管激光器，它可以进行电子调制，不需要外部关闭。两个镜子足以将光束对准任何地方和任何方向。如前所述，这两个透镜用于加宽光束并将其聚焦在显微镜的后焦平面上。目的。

我们可以通过在光学导轨上移动潜望镜的下镜来移动光束以进行草皮配置。对于图像检测，我们使用高灵敏度的相机。例如，可以将不同波长的电子倍增电荷耦合器件或 em CCDA 第二激光束对准光束路径。

使用镜子和二向色覆盖层。为了同时进行双色检测，我们在发射路径中放置了一个市售的分束装置。对于实验，拥有两条独立的激发光束路径非常有用。

例如，一个用于草坪成像，另一个用于靶向光漂白或活化。这可以通过实施一组 2 50 50 分束器来轻松实现。如图所示，两种不同的透镜和反射镜调节系统将产生两个单独的光束轮廓和光束角。

例如，用于草坪成像的加宽模型，以及用于非草坪中漂白或活化的更聚焦的模型。可以在非草坪光束中放置一个孔，以精确塑造漂白或活化点。两个额外的百叶窗，每个光路一个 在激光束上启用独立控制开关，使物镜保持在笔直的非倾斜路径上。

打开功率计并将其调整到相应的激光波长。测量物镜处激光的功率并写下来。现在，将镜子移位到显微镜后面，将物镜处的激光束倾斜到草皮位置。

切勿直视激光。在右下角，您可以看到激发激光的强度分布，通过发射荧光蛋白装饰的双层来可视化。在这里，我们使用假色表示来突出显示不同强度的区域。

测量足够大的感兴趣区域内背景的平均强度。该值取决于特定的相机设置，例如 EM 增益和读出速度，并且必须从所有测量强度中减去。确定整个照明区域内的平均强度。

选择足够大的直径，以使外围的强度值与相机背景的强度值相似，以测量中心区域的平均强度。该区域定义了稍后将进行显微镜实验的感兴趣区域。现在，从消除区域和中心区域的强度中减去平均背景强度值。

接下来，将背景校正后的强度与区域大小的相应像素数相乘，以得到积分强度。将照明区域的积分强度设置为 1，并计算中心区域的分数。使用功率计测得的功率。

在我们的例子中，5 毫瓦与整个照明区域的积分强度成正比。将此值与中心区域的功率分数相乘，以确定中心区域内的功率。在我们的示例中，1.15 毫瓦，将像素数转换为平方微米的因子取决于相机芯片的实际像素大小和发射路径的放大倍率。

它可以很容易地用千分尺载玻片确定。在我们的示例中，中心区域对应于 170.8 平方微米。功率密度是指测得的功率除以面积，因此等于 1.15 毫瓦除以 170.8 平方微米或每平方微米 0.007 毫瓦。

即每平方厘米 0.7 千瓦。为了确定双层的流动性，我们在包装实验的光漂白后进行荧光恢复。如左下角的电影所示，我们在低功率密度下对荧光双层进行成像。

在右下角的电影中，您可以在显微镜上看到相应的实验室技术室。然后，我们用短的高功率密度脉冲漂白一个圆形区域，并监测低功率密度下的恢复情况。同样，蒙太奇提供了不同时间点的实验概述，其中零时间是漂白脉冲。

我们定量标记圆圈内的平均背景校正荧光强度，并将所有测量的强度标准化为实验开始时的强度。在漂白脉冲之前，我们绘制了随时间的标准化强度值。饱和值代表移动分数，在我们的例子中超过 90%首先，拍摄低激发功率密度下的双层图像。

例如，通过放置对数衰减值为 2 的光密度滤波器，这会将功率降低 100 倍。在整个过程中，曝光时间应该是恒定的，并且足以在非衰减功率密度下对单个流体力进行成像，在我们的例子中为 10 毫秒/平方厘米 0.7 千瓦。使用伪彩色表示来突出显示不同强度的区域。

选择一个感兴趣的区域，稍后将进行单分子测量，以及一个相同大小的区域。对于背景减去，计算背景减去的积分强度。现在从激发光束路径上移除光密度滤光片，漂白该区域并拍摄图像。

您将看到单个流感力量在漂白区域扩散。单流感力是 2 到 3 个像素的典型直径，在每个单分子信号周围取一个 7 x 7 像素的区域，第二个区域靠近。对于背景扣除，仅定量单个 Fluor 力的信号很重要。

因此，最好在 BI 层上以小于 1 的蛋白质与蛋白质比率对蛋白质进行成像，或者对于 SAT 特异性标记的蛋白质。如我们的示例所示，饮食与蛋白质的比率更高，测量两个区域的综合强度，并从信号中减去背景，以不采用我们示例中显示的最后观察到的事件，因为漂白可能发生在暴露平均值期间。这里更正的信号，我们对 4 次流感执行此作，我们在 9 帧中观察到。

但是，此过程应至少针对数百个单分子事件执行。让我们回到在衰减激发功率密度下观察到的原始双层图像。分子密度是通过乘以 100 并除以平均单分子强度和面积来校正低激发功率密度的感兴趣区域的积分强度来确定的。

我们正在处理每平方微米 421.4 Fluor 力的密度。在我们的示例中，饮食与蛋白质的比例为 1，这等于每平方微米的分子数相同。观看本视频后，您应该能够使用单分子荧光显微镜制备和表征蛋白质功能化脂质双层。

此外，您应该熟悉为此目的修改和升级标准显微镜的基本原则。我们稍后将使用这种方法来确定双层结合抗原与细胞结合的 T 细胞受体的结合动力学，但基于此的许多其他应用肯定是可行的。