定量测定的免疫反应和睡眠模式果蝇

以下实验的总体目标是评估果蝇的睡眠和免疫功能。首先通过记录受感染果蝇的运动活动来实现，以测量睡眠和存活率，这是在感染果蝇均质化、稀释并扩散到 LB 琼脂平板上的第二步。生长的菌落形成单位的数量表明苍蝇清除感染的能力。

接下来，将表达含有 NF κ b 荧光素酶报告基因的转基因的感染果蝇加入到含有荧光素酶底物荧光素的 96 孔板中。kappa b 荧光素酶的实时测量表明感染期间 NF kappa B 信号通路的激活完全是睡眠生存结果。细菌清除率和 NF KB 报告基因活性是提供免疫功能和行为之间分子联系的机制见解的测量。

一般来说，这种方法的新手或很挣扎，因为学习如何一致地手动感染果蝇需要时间和练习。与 QPCR 等现有方法相比，Lucifer 报告的技术的主要优点是可以在活体中实时连续测量 NF Kappa B 活性。果蝇 首先将晚瞳分期果蝇培养物孵化 3 到 4 天，以便成虫适应环境条件。

在这里，苍蝇被置于恒定的光照下，以消除生物钟对免疫反应和行为的影响。接下来加载 1 到 4 天大的苍蝇进入活动。监测员在感染前至少 3 天记录他们的活动，即计划感染前 1 天。

用无菌移液器吸头挑选单个 SIA 菌落，然后将吸头浸入含有 5 毫升 LB 培养基的培养管中，以验证无菌技术。不要忘记制作没有细菌的对照模拟培养物。细菌生长过夜，直到第二天达到指数生长期。

测量培养物在 600 纳米处的吸光度。包括第二个 Q vet 作为空白。当浓度在 0.5 到 1 吸光度单位之间时，即可进行传代培养，或根据需要延长培养时间。

现在准备细菌溶液来感染苍蝇。用 PBS 稀释细菌至 600 纳米处的预期吸光度为 0.1。然后为注射对照添加食用色素。

用 LB 培养基替换细菌。将两种溶液都储存在冰上。接下来，使用微量移液器拉拔器，在解剖显微镜下制作带有细尖的注射针。

使用细镊子折断每根针头的尖端，使开口足够大，以便使用抽吸填充注射液，但也要足够小，以尽量减少对苍蝇的损坏。使用注射器将玻璃针头连接到具有一定长度管路的 3 cc 塑料注射器上。注射介质的流量是手动控制的。

避免注射液污染橡胶管，因为注射器装置用于感染注射和对照注射。使用 Kim 擦拭纸巾验证注射介质的流动。成功注射的两个关键细节是使用最佳针头尺寸以及针头和注射器之间的安全密封。

注射系统完全准备好后，使用最小流量的二氧化碳麻醉果蝇，迅速进行，以免苍蝇麻醉超过 5 分钟。现在通过将玻璃针戳入背胸斜颌上方的区域来注射苍蝇。注射培养基进入果蝇的过程通过食用色素进行验证，这可以看作是注射液的扩散。

在开始之前，请确保用于此程序的所有材料也至少提前一天进行了高压灭菌。用 LV 琼脂培养基准备 10 厘米的培养皿。在实验当天，麻醉并将果蝇放入 1.5 毫升离心管中。

每个实验条件至少准备两组，每组 10 只果蝇。还要准备一组没有感染的果蝇，特别是当使用没有抗生素耐药性的细菌菌株时。将所有加载的试管存放在冰上。

接下来，向每个装载飞蝇的试管中加入 400 微升 LB 培养基。使用小果蝇均质化，并在火焰附近进行以防止污染。现在使用切割的移液器吸头，以 200 微升的体积将匀浆连续稀释 10 倍。

如果在感染 sia 后立即制备匀浆，则稀释至 1 至 1000，但在 24 小时内，感染后匀浆稀释至 1 至 100， 000。下一个种子，最大的两个 dilu 放在 10 厘米的板上，使用玻璃球确保均匀分布，将板孵育过夜。第二天，通过直接观察或通过菌落计数软件计算平板上的菌落数量。

然后计算每只苍蝇的菌落形成单位的数量。该测定在适当时使用携带 kappa b 荧光素酶报告基因的转基因果蝇。该检测还需要培养的细菌，例如制备用于注射的 SCIA，如上一节所述。

根据实验照明条件调整苍蝇。在这个例子中，将 1 至 4 天龄的 κ b 荧光素酶苍蝇饲养在含有 5% 蔗糖、2% 琼脂食品培养基的小瓶中，并在恒定光照下放置两天。现在为果蝇准备一个 96 孔微孔板。

在每个井中装满两层食物。首先，向每个培养基中加入 300 微升 5% 蔗糖、2% 琼脂溶液。用细网布盖住板，让板彻底干燥长达一个小时。

接下来，向每个孔中加入 50 微升顶层，其中含有 5% 蔗糖、1% 琼脂和 2 毫摩尔荧光素。因为 Lucifer 对光敏感，所以让板在黑暗中干燥并继续前进。尽量减少板的光照。

琼脂冷却后，用透明胶膜盖住板。然后用细针在每个孔上穿孔薄膜两次。这些孔允许空气交换和气体麻醉。

接下来，为了便于飞行加载，使用锋利的刀片和直尺在每根柱子之间引入切口。用二氧化碳麻醉果蝇，然后逐列将它们逐列加载到每个孔中。如果苍蝇卡在薄膜上，请在干预之前给它一个释放自己的机会。

将微孔板放回培养箱中，在恒定光照下放置 8 至 24 小时。要麻醉结合良好的果蝇，请使用连接到低压二氧化碳管路的微量移液器吸头。确保气体处于无害的低压下，并将微量移液器吸头直接放在通风孔上方，以 8 只为一组单独麻醉一只苍蝇。

将每只苍蝇转移到 CO2 垫上，并像以前一样用细菌感染它们。然后将每个苍蝇放回其原始孔中并重新密封微孔板。使用安装在温度控制室中的光度计在规定的照明时间表下测量每只果蝇的发光。

将板装入堆叠盒中，确保将含有果蝇的板堆叠在透明的空白板之间。根据制造商的规格对光度计进行编程，并每小时收集一次读数，至少持续 24 小时。在本例中，检测器被编程为读取每个孔 10 秒。

完成后，将数据文件导出到电子表格中，并执行标准分析，以绘制结果图。可以分析示例数据。每秒折扣平均来自每孔 3 个读数。

Canton S 野生型苍蝇和津津乐道。将缺乏 NF kappa B 基因的 E 20 突变果蝇在恒定光照下加载到两个活性监测器中，并感染 sia。在这个例子中，感染促进了睡眠。

很明显，津津有味的 E 20 突变体在感染后的睡眠时间比 Canton s. Control 苍蝇少。与以前的发现一致，与野生型果蝇相比，津津乐道的 E 20 突变体也迅速死于感染。

大多数果蝇在无菌对照注射中存活下来，表明果蝇死于感染，而不是注射造成的伤害。由于津津乐道突变体死亡得如此之快，因此仅使用 Canton s 果蝇来证明感染后的细菌载量。感染后 24 小时，Sia 继续在果蝇体内增殖。

Lucifer 的报告活动显示，单个果蝇之间和数据点的成功之间存在很大差异。尽管信号来自果蝇内的所有组织，但并不期望每个组织都会发出相同数量的信号，并且组织对检测器的可见性会随着果蝇的移动而变化。在此示例中，苍蝇被感染并与处理的对照组进行比较。

死亡的果蝇被排除在一组果蝇的分析之外。Kappa b 荧光素酶报告基因活性在感染后稳步上升。Kappa b 荧光素酶报告基因的活性在无菌性损伤后也稳步上升。

受伤后和感染后的峰值活动时间约为 12 小时。看完这个视频，你应该对感染后 SSO 中的免疫功能和睡眠有一个很好的了解。我们可以测量睡眠、存活、时间、细菌清除率和 un copy 转录报告基因的实时活性。