长期的嗅觉适应性的分子读数 C.线虫

本视频的总体目标是详细介绍描述 sea elgan 适应状态的长期嗅觉适应分子读数的开发和实施。这是通过用绿色荧光蛋白分子标记称为蛋 L 4 的蛋白激酶 G 并在 C 型或 A 型 WC 神经元中表达这种蛋白质融合作为第二步来实现的，在 A WC 神经元中表达蛋 L 4 的 GFP 标记形式的动物在含有细菌食物来源 OP 50 的线虫生长培养基板上培养。接下来，四天后，将一群动物从培养板上洗掉，并暴露于 A WC 感应气味 80 分钟，以促进长期嗅觉适应。

结果显示 GFP 标记的鸡蛋 L 4 在适应动物的 A WC 中的核定位与未适应对照动物的 GFP 标记的 ALE 4 的细胞质定位 通过创建 ALE 的功能拷贝 4 个字段，两个绿色荧光蛋白。我们可以追踪 A WC 中 ACO four 的亚细胞定位，并根据 GFP 定位描述动物的行为状态。这种分子工具使我们能够快速研究各种突变体或处理在持续神经元刺激后塑造细胞输出中的作用。

该方案从构建 GFP 标记的蛋 L 四种表达动物开始，如本视频随附的书面程序中所述。最终的整合线称为 I as 500，GFP 标记的蛋 L 四个分子作为 GFP 蛋 L 4 在 25 摄氏度下在标准 10 厘米 NGM 板上培养 IS 500 动物。第一天与 OP 50 大肠杆菌一起坐下，从在 25 摄氏度下培养的平板上挑选 4 到 500 只处于幼虫阶段的第四只动物，使用称为镐的小铂丝舀起并转移动物。

对四个额外的板重复此作。第四天在 25 摄氏度下孵育板。通过向板中添加基础缓冲液并轻轻旋转，从大型 NGM 平板上清洗 IS 500 动物的成年种群。

这会将动物从板表面移出并进入缓冲溶液。使用一次性玻璃移液器，将动物从板中吸出并转移到 1.5 毫升的 einor 管中。通过在罗勒中洗涤 500 只动物来开始易位测定，以去除细菌，不要离心。

动物在两次洗涤之间。而是让动物在重力作用下沉降在固定的 1.5 毫升微量离心管中。确保去除所有细菌并且 NGM 板不受污染至关重要，因为残留细菌会对易位测定的结果产生负面影响。

用罗勒重复洗涤两次。通过将 100 毫升 S 罗勒缓冲液添加到 100 毫升量筒中来配制适应溶液。如果进行醛适应，将 7.5 微升醛加入 100 毫升 ESP 罗勒中，使用一条参数密封圆筒。

轻轻倒置含有罗勒和气味的量筒 30 次。为了产生均匀的乳剂，向每个试管中加入动物，尽量将每个试管中的动物数量保持在 100 到 200 个之间。通过一些练习，可以在动物安顿下来后通过肉眼估计上颚中动物的大致数量。

S 罗勒洗涤后，从 epi 孤儿管中取出所有液体，将一个新管标记为阳性，另一个新管为阴性。然后将 1 毫升驯化混合物加入阳性适应微量离心管中，并将 1 毫升 S 罗勒加入阴性未适应对照微量离心管中。将 1.5 mL 微量离心管管盖保护器放在每根试管上，并将试管放在旋转器上 80 分钟。

80 分钟后，在 S 罗勒中清洗动物 3 次，让动物在每次洗涤之间通过重力沉淀。通过溶解凝胶电泳 aros 制备含有 5 毫摩尔叠氮化钠的 2%aros 垫。在蒸馏水中，将一滴含有叠氮化钠的 mol 和 aros 放在玻璃显微镜载玻片上，立即将另一张玻璃显微镜载玻片放在第一张载玻片上，以压平熔融的 agros 液滴。

静置 30 秒，然后轻轻梳理分离显微镜载玻片，留下一个带有约 1 毫米平坦 aros 垫的显微镜载玻片。此时，每个实验者都必须设计一个键来跟踪哪些玻片是阳性实验，哪些玻片是阴性对照。然后，在蠕虫从最后一次洗涤中沉淀下来后，作为罗勒去除所有液体，然后将动物滴加到几个显微镜载玻片的 aros 垫上。

将每张幻灯片的动物数量保持在 50 到 100 只之间很重要。每张幻灯片上的动物太多会使评分复杂化，并且通常会产生散射的光芒。蓝光激发后，使用小 kim 湿巾可以从 aros pad 中吸走多余的液体。

将 0.5 毫米的玻璃盖玻片放在垫子上，静置 2 分钟，让叠氮化钠固定动物。接下来，将幻灯片传递给另一个人，该人将盲目地对 GFP 蛋 L 4 定位模式进行评分。这将使用具有 10 x 40 x 和 63 x 放大倍率物镜和 G-F-P-R-F-P 滤光片的正置荧光显微镜，控制每张载玻片 50 到 100 只动物的任何实验或偏差评分。

首先，使用明场照明在 10 倍放大倍率下定位动物。其次，通过关闭明场照明并使用 RFP 滤光片来定位 A WC 神经元。促进剂气味。

一个 DS red 驱动 WB 和 A WC 神经元中的表达。与 WB 细胞体相比，A WC 神经元具有独特的椭圆形细胞体，而 WB 细胞体更小且呈圆形。一旦找到 A WC 细胞体，切换到 GFP 过滤器并记录 GFP 卵 L 4 的定位为细胞核或细胞质。

使用计数器可以让实验者在对载玻片进行评分时继续观察目镜。此过程在不同的日期至少重复 3 次，以产生具有统计意义的数据。在长时间气味暴露之前，显示了 GFP 蛋 L 4 在 A WC 中定位模式的一个例子，在长时间暴露于气味之前。

GFP 卵 L 4 在气味暴露 80 分钟后定位于 A WC 的胞质溶胶中。GFP 卵 4 在行为水平上定位于 A WC 的细胞核。WC 中具有胞质 GFP 蛋 4 的动物会被气味的点源所吸引。

该图是根据未适应动物的趋化性测定的代表性结果生成的。请注意，CHEMOTAXIS 指数接近 1。在 A WC 中表现出核 G-F-P-E-L 4 的动物不会被适应气味的点源所吸引。

该图是根据收养动物的 CHEMOTAXIS 测定的代表性结果生成的。请注意，CHEMOTAXIS 指数接近于零。一旦 L 卵 4 进入 A WC 神经元的细胞核，它会导致 A WC 生理学发生稳定和持久的变化，即使 L 4 卵不再在细胞核中，这种变化也会持续存在。

暴露于气味 80 分钟后，动物会忽略适应气味的一个点源，即使在恢复 120 分钟后，这种适应也会持续存在。暴露异味 80 分钟后。在 A WC 的核中观察到 GFP Egle 4。这种 NU 核进入对于诱导 A WC 的长期适应既必要又充分。恢复 120 分钟后，这些动物不再表现出核 GFP Eagle four，但仍会在行为层面忽略适应气味醛的一个点源，不包括培养次数。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在几个小时内完成。