基因功能分析和可视化的纤毛产生的流体流动的在枯否囊泡中

该程序的目的是调节 Kavas 囊泡中的功能基因或斑马鱼胚胎中负责左右模式的 KV，并通过将荧光珠输送到 kv 中来分析 motil clia 产生的不对称流体流动。这是通过首先注射荧光形态寡核苷酸来实现的，这些寡核苷酸抑制了 Dilla 中期胚胎卵黄细胞中特定目标基因的表达，以便它们加载到产生 kv 的背侧前体细胞中。接下来，选择仅在卵黄细胞和 kv 中具有荧光形态的注射胚胎进行进一步分析。

然后将胚胎安装在抑制载玻片中，并将荧光珠注射到 kv 充满液体的囊泡腔中。最后，使用视频显微镜记录在 kv 内流动的珠子。最终，可以通过对珠子运动的定量分析获得确定 KV 中候选基因的组织特异性耗竭是否会改变不对称流体流动的结果。

本学期的病毒演示至关重要，因为特定阶段的 molino 注射和荧光珠注射很难学习，因为两者都取决于胚胎的提议和实验的发育时间。要进行整体形态或 MO 注射，请在受精后立即收集胚胎并将其加载到注射板中。使用经过我们移液器的火抛光剂将胚胎放入注射板中以固定胚胎。

折断注射针的尖端并调整注射设置，以创建体积为 1 纳升的注射液滴。使用解剖显微镜，将 1 纳升 MO 注射到一到四个细胞阶段之间的至少 50 个胚胎的轭中。对于 DFC，靶向 M mo 注射，受精后立即收集胚胎并在 28.5 摄氏度下孵育。

当胚胎达到 256 个细胞阶段时，迅速将它们加载到注射板中，并将 1 纳升荧光 MO 注射到卵黄中。在 256 到 1000 个细胞阶段之间注射至少 100 个胚胎，以进行卵黄靶向注射。在将受精卵孵化到圆顶阶段后，在圆顶和 30% 的层阶段之间的至少 100 个胚胎的轭中注射 1 纳升荧光 MO。

当 M mo 注射的胚胎达到 75%a 层阶段时。在解剖显微镜下去除未受精和死亡的胚胎以进行整体 MO 注射。选择活胚胎进行荧光均匀分布于所有细胞中。

对于 DFC 靶向 M mo 注射，选择荧光扩散到整个卵黄并集中在背喷砂真皮边缘的胚胎。用于蛋黄靶向 MO 注射。选择荧光均匀分布在整个蛋黄中，并且在 2 到 4 之间的任何胚胎细胞中均未观察到的胚胎。

所以螨虫阶段。选择仅在 KV 细胞和卵黄中表现出荧光的 DFC 靶向胚胎，并丢弃其余胚胎进行卵黄靶向注射。选择仅在卵黄中具有荧光的胚胎，以分析 MO 注射胚胎 KV 中的不对称流动，首先使用锋利的镊子小心地涂覆 4 到 6 个胚胎之间的大约 20 个胚胎。

阶段也可以将一个胚胎转移到玻璃凹陷载玻片上并尽可能多地去除水分。通过添加足够温暖的 1% 低熔点 aero 来固定胚胎，以便在 aero 凝固时覆盖它。使用镊子定位它，使 KV 朝上安装 10 个胚胎快速工作，以确保 10 个胚胎完成所有注射。

所以螨虫阶段。在无菌水中将直径为 0.5 微米的荧光微珠稀释至 1 至 50 后。彻底混合珠子，并使用用于 MO 注射的相同微量注射器将 3 微升加入毛细管针头中。

使用镊子折断针尖并调整注射设置以产生尽可能小的注射。落。接下来，在解剖显微镜下，将针头对准第一个安装胚胎的 KV 腔。然后将针头插入管腔并注入少于 0.5 纳升的珠子。

在 aros 上加入一滴无菌水，以避免胚胎在正置荧光显微镜下变干。使用 20 倍物镜筛选注射的胚胎，以成功为每个选定的胚胎递送珠子，KV 内的珠子在一滴无菌水中覆盖 aros。然后使用带有 63 x 水浸物镜的荧光复合显微镜进行观察。

使用安装在显微镜上的高速相机录制 10 秒的影片。使用荧光通道以每秒约 70 帧的速度记录微珠，并使用明场或微分干涉对比来记录 KV 流明。将电影导入 Image J.Create maximum projections 并使用该软件跟踪单个珠子的运动。

该图显示了荧光 MO 在成功阶段特异性活注射胚胎中的分布。此处显示了不成功的 MO 注射，其中溶液仍聚集在卵黄细胞中。可以在具有正常流珠的对照胚胎中定性或定量测量成功注射胚胎中的液体流量。

遵循逆时针路径，可以通过对荧光珠位置随时间进行最大投影或通过随时间跟踪单个磁珠来可视化。为了证明协调流动胚胎的损失，注射 MO 以分解行激酶 2 B 或岩石 2 B，这会破坏流动，结果，珠子以 kv 随机移动，来自对照和岩石两个 B mo 胚胎的 5 个珠子的平均速度在此处显示其发育后。这项技术为发育生物学领域的研究人员探索在斑马鱼中建立左右身体通路的基因和机制铺平了道路。