Name: 由可逆连接的运动素提供动力的分子穿梭机的组装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 了解利用运动素驱动蛋白推动微管组装分子穿梭机的方法。该技术通过全内反射荧光显微镜实时观察微管动态组装与解聚过程，为纳米生物物理学研究提供新工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者们谨此感谢美国国家科学基金会（NSF）项目 NSF-DMR 1807514 提供的经费支持。作者们感谢 G. Bachand 和 V. Vandelinder 提供 GFP-驱动蛋白（GFP-kinesin）蛋白。本工作部分在综合纳米技术中心完成，该中心是美国能源部（DOE）科学办公室下属的科学用户设施，由洛斯阿拉莫斯国家实验室（合同号 DE-AC52-06NA25396）和桑迪亚国家实验室（合同号 DE-AC04-94AL85000）运营。作者们感谢 Jennifer Neff 博士及 AllVivo Vascular 惠赠 NTA 功能化的 PEG-PPG-PEG。

1. 溶液配制
警告：本实验方案中使用的三种试剂（甲苯、二甲基二氯硅烷和二硫苏糖醇）具有高毒性。使用前请查阅相关的材料安全数据表（MSDS）。此外，本实验的部分操作需要在更高防护级别下进行，并按要求佩戴安全护目镜和两副防护手套。除非另有说明，实验可在实验台面上进行，但必须使用所有适当的人体防护装备（安全护目镜、手套、实验服、长裤和封闭式鞋履）。
注意：本方案中所用 ATP、驱动蛋白和微管的浓度可根据每个实验的具体需求进行调整。但若进行调整，请确保其他试剂的最终浓度与下文所述保持一致。所有实验均在室温下进行（约 25 °C）。
<ol>
	<li>储备溶液的制备 
	注意：请预先配制并分装以下溶液。所有分装步骤均可在室温（约25 °C）下进行。
	<ol>
		<li>BRB80缓冲液 
		注意：本实验方案中大多数溶液所用的缓冲液为BRB80。BRB80可大量配制，并储存于-20 °C冰箱中。
		<ol>
			<li>将24.2 g哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)（PIPES）和3.1 g氢氧化钾（KOH）溶解于800 mL去离子水中，配制成800 mL的100 mM PIPES溶液。加入100 mL 10 mM氯化镁（MgCl2）和100 mL 10 mM乙二醇四乙酸（EGTA），最终定容至1 L。使用氢氧化钾（KOH）将pH调至8，有助于PIPES和EGTA的溶解。 
			注意：BRB80缓冲液中各化学成分的终浓度为80 mM PIPES、1 mM MgCl2和1 mM EGTA。</li>
			<li>使用KOH和盐酸（HCl）将缓冲液的pH调节至6.9。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>ATP
		<ol>
			<li>用超纯水配制1 mL 100 mM ATP溶液。用移液器将溶液分装为每份10 μL。将分装后的样品储存于-80 °C冰箱中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>GTP
		<ol>
			<li>用超纯水配制500 μL 25 mM GTP溶液。用移液器将溶液分装为每份5 μL。将分装后的样品储存于-80 °C冰箱中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>MgCl2
		<ol>
			<li>用超纯水配制1 mL 100 mM MgCl2溶液。用移液器将溶液分装为每份10 μL。将分装后的样品储存于-20 °C冰箱中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>酪蛋白
		<ol>
			<li>称取1 g干燥酪蛋白，转移至50 mL锥形离心管中。向管中加入35 mL BRB80缓冲液以溶解酪蛋白粉末。</li>
			<li>将溶液置于冷室中的旋转混合仪上过夜溶解。此时溶液将呈现浓稠且黏滞的状态。</li>
			<li>将离心管直立放置于4 °C冰箱中，使未溶解的大块沉淀沉降。将上清液转移至新管中。</li>
			<li>在离心机中以1,000 x g离心，进一步沉淀残留物。再次将上清液转移至新管中。</li>
			<li>使用0.2 μm（最大压力7 bar）滤器反复过滤溶液。由于溶液较黏稠，滤器易堵塞，需重复此步骤直至滤器通畅无阻。</li>
			<li>使用紫外/可见光分光光度法测定所得溶液中酪蛋白的浓度，采用酪蛋白在280 nm处的消光系数19 mM-1∙cm-120。假设酪蛋白的分子量为23 kDa，用BRB80缓冲液将溶液稀释至20 mg∙mL-1的浓度。</li>
			<li>用移液器将溶液分装为每份20 μL，并将分装样品储存于-20 °C冰箱中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>D-葡萄糖
		<ol>
			<li>用超纯水配制1 mL 2 M D-葡萄糖溶液。用移液器将溶液分装为每份10 μL。将分装后的样品储存于-20 °C冰箱中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>葡萄糖氧化酶
		<ol>
			<li>用BRB80缓冲液配制1 mL 20 mg∙mL-1葡萄糖氧化酶溶液。用移液器将溶液分装为每份10 μL。将分装后的样品储存于-20 °C冰箱中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>过氧化氢酶
		<ol>
			<li>用BRB80缓冲液配制1 mL 0.8 mg∙mL-1过氧化氢酶溶液。用移液器将溶液分装为每份10 μL。将分装后的样品储存于-20 °C冰箱中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>二硫苏糖醇（DTT） 
		注意：由于DTT具有轻微挥发性和毒性，请在通风橱内进行以下操作。
		<ol>
			<li>用超纯水配制1 mL 1 M DTT溶液。用移液器将溶液分装为每份10 μL。将分装后的样品储存于-20 °C冰箱中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>紫杉醇
		<ol>
			<li>用DMSO配制1 mL 1 mM紫杉醇溶液。用移液器将溶液分装为每份10 μL。将分装后的样品储存于-20 °C冰箱中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>二甲基亚砜（DMSO） 
		注意：本实验中使用的DMSO为纯品。
		<ol>
			<li>将1 mL纯DMSO用移液器分装为每份10 μL。将分装后的样品储存于-20 °C冰箱中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>磷酸肌酸
		<ol>
			<li>用超纯水配制1 mL 0.2 M磷酸肌酸溶液。用移液器将溶液分装为每份10 μL。将分装后的样品储存于-20 °C冰箱中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>肌酸磷酸激酶
		<ol>
			<li>用超纯水配制1 mL 200 units·L-1肌酸磷酸激酶溶液。用移液器将溶液分装为每份10 μL。将分装后的样品储存于-20 °C冰箱中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>硫酸镍(II)
		<ol>
			<li>用超纯水配制500 mL 50 mM硫酸镍(II)溶液。将溶液在室温（约25 °C）下储存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)（PEG-PPG-PEG）溶液
		<ol>
			<li>在称量纸上称取2 mg PEG-PPG-PEG（数均分子量：14,600 g∙mol-1）-NTA粉末。PEG-PPG-PEG-NTA是一种带有亚氨二乙酸（NTA）基团的功能化三嵌段共聚物。有关PEG-PPG-PEG-NTA的更多细节，请参见材料表。</li>
			<li>将粉末转移至1.5 mL微量离心管中。向管中加入1 mL储备的硫酸镍(II)溶液。涡旋振荡直至粉末完全溶解且无可见团块残留。</li>
			<li>可在室温下储存长达一个月。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验开始前的准备
	<ol>
		<li>准备一个装有冰块的桶。</li>
		<li>从上述第1.1.1至1.1.13节所述的13种试剂中各取一份分装样品，放入冰桶中保持低温。使用前使其完全解冻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微管的制备 
	注意：微管由20 μg冻干的荧光标记微管蛋白分装样品聚合而成。所用荧光染料的激发波长为647 nm。
	<ol>
		<li>微管生长缓冲液的配制
		<ol>
			<li>将21.8 μL BRB80缓冲液加入一个小（0.6 mL）微量离心管中。加入1 μL MgCl2储备液、1 μL GTP储备液和1.2 μL DMSO储备液。 
			注意：因此，BRB80缓冲液中各试剂的终浓度为4 mM MgCl2、1 mM GTP和5%（v/v）二甲基亚砜。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>微管聚合
		<ol>
			<li>将6.25 μL微管生长缓冲液直接加入20 μg冻干标记微管蛋白分装样品中。以30 rps的速度涡旋振荡5秒。</li>
			<li>将样品在冰上冷却5分钟后，于37 °C孵育45分钟，随后进入第1.3.3节操作。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>微管稳定化
		<ol>
			<li>将5 μL分装的紫杉醇溶液加入490 μL BRB80缓冲液中。以30 rps的速度涡旋振荡10秒。</li>
			<li>微管孵育45分钟后，将5 μL聚合后的微管溶液加入BRB80/紫杉醇溶液中。 
			注意：此100倍稀释后的稳定微管溶液此后将称为MT100。该溶液可在5天内使用，也可进一步稀释以获得每次实验所需的微管密度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运动溶液
	<ol>
		<li>酶法抗荧光淬灭系统、ATP再生系统及ATP
		<ol>
			<li>将9.0 μL分装的酪蛋白溶液加入291 μL BRB80缓冲液中。</li>
			<li>若实验所需的ATP浓度低于1 mM，则取83 μL BRB80/酪蛋白溶液加入新的0.6 mL微量离心管中；否则取85 μL该溶液加入新的0.6 mL微量离心管中。</li>
			<li>向该管中加入1 μL D-葡萄糖、1 μL葡萄糖氧化酶、1 μL过氧化氢酶和1 μL DTT。 
			注意：这些化学物质构成一种酶法抗荧光淬灭混合液21，可通过去除溶解氧和淬灭活性自由基来减少光漂白。这可降低荧光成像过程中激发光引起的光漂白和微管解聚22,23。</li>
			<li>对于选择ATP浓度显著低于1 mM的实验，向溶液中加入以下试剂以构建ATP再生系统：1 μL分装的磷酸肌酸溶液和1 μL分装的肌酸磷酸激酶溶液。</li>
			<li>向运动溶液中加入1 μL ATP储备液。轻弹或涡旋振荡以使化学物质均匀分布。 
			注意：因此，溶液中各化学物质的终浓度为10 μM紫杉醇、0.5 mg·mL−1酪蛋白、20 mM D-葡萄糖、200 μg·mL−1 葡萄糖氧化酶、8 μg·mL−1 过氧化氢酶、10 mM二硫苏糖醇、2 mM磷酸肌酸（如添加）、2 units·L−1肌酸磷酸激酶（如添加）和1 mM ATP。此溶液此后将称为运动溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>驱动蛋白 
		注意：本实验所用的驱动蛋白储备液由Sandia国家实验室集成纳米技术中心的G. Bachand制备，并根据用户协议提供（https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php）。所用缓冲液包含40 mM咪唑、300 mM NaCl、0.76 g·L-1 EGTA、37.2 mg·L-1 EDTA、50 g·L-1蔗糖、0.2 mM TCEP和50 μM Mg-ATP。本系列实验使用rkin430eGFP驱动蛋白构建体。该驱动蛋白由大鼠驱动蛋白重链的前430个氨基酸与eGFP融合，并在尾部结构域带有C端His标签24。该蛋白在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达，并通过Ni−NTA柱纯化。通过紫外/可见光分光光度法测定GFP-驱动蛋白储备液的浓度为1.8 ± 0.3 μM，采用GFP在489 nm处的消光系数55 mM-1·cm-125，并考虑驱动蛋白为二聚体。
		<ol>
			<li>确定实验所需的驱动蛋白浓度或表面密度。对于典型检测，该浓度为20 nM。若驱动蛋白需稀释超过100倍，应将其稀释于含0.5 mg·mL-1酪蛋白的BRB80溶液中。</li>
			<li>向运动溶液中加入1 µL驱动蛋白溶液，以获得约20 nM的终浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>微管
		<ol>
			<li>将第1.3节制备的10 μL MT100溶液加入运动溶液中。 
			注意：该运动溶液可在3小时内使用。超过此时间后，由于溶液中的葡萄糖被酶促反应耗尽，抗荧光淬灭系统将失去效果。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组装流动池
<ol>
	<li>清洗盖玻片
	<ol>
		<li>对于流动池，使用一片大盖玻片（尺寸：60 mm × 25 mm）和一片小盖玻片（尺寸：22 mm × 22 mm）19。</li>
		<li>用乙醇冲洗所有盖玻片两次，再用超纯水冲洗两次。将盖玻片在超纯水中超声处理5分钟，然后在50–75 °C的烘箱中干燥。</li>
		<li>使用紫外/臭氧清洗仪（参见材料表及制造商说明书），对每片盖玻片的一面处理15分钟。此步骤可在室温（约25 °C）和常压（1 atm）条件下进行。</li>
		<li>小心地用镊子将每片盖玻片翻转至另一面，并同样进行紫外/臭氧处理。</li>
		<li>再次将盖玻片在超纯水中超声处理5分钟，然后在50–75 °C的烘箱中再次干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理盖玻片以实现 PEG-PPG-PEG 涂层 
	注意：本实验步骤中使用的二甲基二氯硅烷和甲苯具有高毒性，所有操作必须在通风橱中进行，并采取以下防护措施：佩戴两层防护手套，实验服内穿长袖衬衫。将手套边缘塞入衬衫袖口内，以防化学品泄漏时前臂皮肤直接接触。佩戴护目镜。
	<ol>
		<li>将25 mL纯二甲基二氯硅烷溶于475 mL甲苯中。将每片盖玻片浸入该二甲基二氯硅烷-甲苯溶液中15秒。</li>
		<li>用甲苯清洗盖玻片两次，再用甲醇清洗三次。使用加压氮气吹干盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将盖玻片组装成流动池
	<ol>
		<li>盖玻片干燥后，将一块2 cm × 2.5 cm的双面胶带沿纵向剪成两条1 cm × 2.5 cm的胶带条。</li>
		<li>将大盖玻片放置在洁净擦拭纸上，沿盖玻片边缘纵向粘贴两条胶带条，使两条胶带之间形成一个1 cm × 2.5 cm的区域。</li>
		<li>将小盖玻片贴在胶带条上方，完成流动池的组装。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 将溶液注入流动池
<ol>
	<li>将约 20 μL 的 PEG-PPG-PEG 溶液注入已组装的流动池中。注入的体积必须足够充满整个腔室。在后续步骤中更换溶液时，应使用相同的体积。</li>
	<li>让 PEG-PPG-PEG 溶液在表面吸附 5 分钟。用 BRB80 缓冲液以流动方式更换溶液 3 次。随后将运动性溶液注入流动池中。</li>
	<li>若计划进行的实验超过一小时，需用封片油脂密封流动池边缘，以防止蒸发。 
	注意：此时流动池已准备好用于成像。</li>
</ol>
4. 成像流动池
<ol>
	<li>使用物镜型全内反射荧光（TIRF）装置对微管和驱动蛋白马达进行成像（参见材料表）。 
	注意：此处我们使用配备100倍/1.49数值孔径物镜的显微镜，结合两种激光器，一种波长为642 nm，最大功率为140 mW，另一种波长为488 nm，最大功率为150 mW。</li>
	<li>在物镜上滴加一滴浸油。</li>
	<li>将流动池放置在显微镜载物台上，并升起物镜，直至物镜上的油与流动池接触。</li>
	<li>使用显微镜的联锁盖系统，防止激光泄漏。</li>
	<li>打开激光器，并对焦至流动池的下表面。微管经荧光标记，激发波长为647 nm。成像时使用642 nm激光对微管进行激发，而GFP标记的驱动蛋白马达则使用488 nm激光进行成像。</li>
	<li>记录所需的图像或视频。通常情况下，两种激光通道的激光功率约为30 mW，曝光时间为50 ms。只要流动池中存在运动现象，即可持续进行图像采集。 
	注意：激光照射对裸眼有害，可能导致不可逆损伤。请确保照射区域完全覆盖不透明遮盖物。</li>
</ol>

<ol><li>Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Novel+Force-Generating+Protein%2C+Kinesin%2C+Involved+in+Microtubule-Based+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility.</a> Cell. 42, 39-50 (1985).</li>
<li>Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+Follows+the+Microtubule%27s+Protofilament+Axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinesin Follows the Microtubule's Protofilament Axis.</a> Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).</li>
<li>Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+shuttles%3A+directed+motion+of+microtubules+along+nanoscale+kinesin+tracks%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks.</a> Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).</li>
<li>Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+bundle+formation+driven+by+ATP%3A+the+effect+of+concentrations+of+kinesin%2C+streptavidin+and+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Microtubule bundle formation driven by ATP: the effect of concentrations of kinesin, streptavidin and microtubules.</a> Nanotechnology. 21, 145603(2010).</li>
<li>Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+Expressed+in+Insect+Cells+Improves+Microtubule+in+Vitro+Gliding+Performance%2C+Long-Term+Stability+and+Guiding+Efficiency+in+Nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Nanobioscience%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 Expressed in Insect Cells Improves Microtubule in Vitro Gliding Performance, Long-Term Stability and Guiding Efficiency in Nanostructures.</a> IEEE Transactions on Nanobioscience. 15, 62-69 (2016).</li>
<li>Whitesides, G. M., Grzybowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+at+all+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Self-assembly at all scales.</a> Science. 295, 2418-2421 (2002).</li>
<li>Ringler, P., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+proteins+into+designed+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of proteins into designed networks.</a> Science. 302, 106-109 (2003).</li>
<li>Boncheva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+self-assembly+of+three-dimensional+surfaces+from+planar+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Magnetic self-assembly of three-dimensional surfaces from planar sheets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 3924-3929 (2005).</li>
<li>England, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissipative+adaptation+in+driven+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Dissipative adaptation in driven self-assembly.</a> Nature Nanotechnology. 10, 919(2015).</li>
<li>Fialkowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+Implementations+of+Dissipative+%28Dynamic%29+Self-Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Principles and Implementations of Dissipative (Dynamic) Self-Assembly.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110, 2482-2496 (2006).</li>
<li>Boncheva, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-healing+systems+having+a+design+stimulated+by+the+vertebrate+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition%22%5BJournal%5D)">Self-healing systems having a design stimulated by the vertebrate spine.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 42, 2644-2647 (2003).</li>
<li>Rubenstein, M., Cornejo, A., Nagpal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+self-assembly+in+a+thousand-robot+swarm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Programmable self-assembly in a thousand-robot swarm.</a> Science. 345, 795-799 (2014).</li>
<li>Plaisted, T. A., Vakil Amirkhizi, A., Arbelaez, D., Nemat-Nasser, S. C., Nemat-Nasser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-healing+structural+composites+with+electromagnetic+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+of+Photo-Optical+Instrumentation+Engineers%22%5BJournal%5D)">Self-healing structural composites with electromagnetic functionality.</a> Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. 5054, 372-381 (2003).</li>
<li>Ghosh, S. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGhosh%2C+SK+%22Self-Healing+Materials%22">Self-Healing Materials</a>. Ghosh, S. K. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim. 1-28 (2009).</li>
<li>Burnworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+healable+supramolecular+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optically healable supramolecular polymers.</a> Nature. 472, (2011).</li>
<li>Bachand, G. D., Spoerke, E. D., Stevens, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-Based+Nanomaterials%3A+Exploiting+Nature%27s+Dynamic+Biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microtubule-Based Nanomaterials: Exploiting Nature's Dynamic Biopolymers.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112, 1065-1073 (2015).</li>
<li>Gao, Y. W., Lei, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+scale+effects+on+the+mechanical+behaviors+of+protein+microtubules+based+on+the+nonlocal+elasticity+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Small scale effects on the mechanical behaviors of protein microtubules based on the nonlocal elasticity theory.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, 467-471 (2009).</li>
<li>Lam, A. T. -C., Tsitkov, S., Zhang, Y., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibly+Bound+Kinesin-1+Motor+Proteins+Propelling+Microtubules+Demonstrate+Dynamic+Recruitment+of+Active+Building+Blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Reversibly Bound Kinesin-1 Motor Proteins Propelling Microtubules Demonstrate Dynamic Recruitment of Active Building Blocks.</a> Nano Letters. 18, 1530-1534 (2018).</li>
<li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods in Cell Biology. 39, 137-147 (1993).</li>
<li>Huppertz, T., Fox, P. F., Kelly, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuppertz%2C+T+%22Proteins+in+Food+Processing+%28Second+Edition%29%22">Proteins in Food Processing (Second Edition)</a>. Yada, R. Y. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 49-92 (2018).</li>
<li>Wettermark, G., Borglund, E., Brolin, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regenerating+system+for+studies+of+phosphoryl+transfer+from+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A regenerating system for studies of phosphoryl transfer from ATP.</a> Analytical Biochemistry. 22, 211-218 (1968).</li>
<li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> Journal of Cell Biology. 107, 1011-1024 (1988).</li>
<li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).</li>
<li>Rogers, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF1D+is+a+fast+non-processive+kinesin+that+demonstrates+novel+K-loop-dependent+mechanochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry.</a> EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).</li>
<li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，我们展示了一种活性纳米系统，该系统能够通过自组装弱结合的构建单元来构建自身的运动轨道。如图1所示，滑动的微管从溶液中富集驱动蛋白马达，并将其沉积在表面。驱动蛋白马达在微管经过后短暂地保留在其尾迹中，随后重新回到溶液。因此，在本实验中，驱动蛋白马达在三种状态之间交替：
（1）微管单结合态：这是驱动蛋白首次与微管结合的状态，与状态（2）处于平衡。
(2) 双结合状态：在此情况下，一个与微管单边结合的驱动蛋白同时与表面结合 通过 其His标签。这种双结合状态能够实现微管的推动。
（3）一种表面结合状态：双结合的驱动蛋白走到了微管末端且尚未从表面解吸时即处于此状态。这些马达分子可在图1（合并图像与绿色通道）中观察到：它们在微管尾端后方延伸数微米，形成逐渐减弱的轨迹。
该方案中最关键的步骤是在载玻片上形成疏水表面。这一步骤不仅涉及危险化学品的使用，而且能使带有NTA基团修饰的PEG-PPG-PEG在表面形成包被，从而允许驱动蛋白可逆地结合到表面。另一个重要步骤是用封片脂密封流动池。这可以防止流动池中的液体蒸发，从而实现长时间成像。
对该技术的主要改进包括改变微管浓度、驱动蛋白浓度和ATP浓度。改变微管浓度会影响在表面滑动的微管数量。改变驱动蛋白浓度会影响能够与微管结合的驱动蛋白分子数量。然而，将驱动蛋白浓度提高到本实验已定义的水平以上可能会增加背景荧光，从而更难观察到滑动微管留下的驱动蛋白轨迹。同时，将ATP浓度降低至10 µM以下会显著降低微管滑动速度。如果需要实现这一效果，则必须使用由磷酸肌酸激酶和磷酸激酶组成的ATP再生系统。
该技术的一个可能局限性在于，由于系统中含有大量的活性驱动蛋白，ATP 可能被迅速消耗，导致实验在某些条件下持续时间不足一小时。例如，若驱动蛋白浓度比本方案中所述高出两倍，且微管浓度高出五倍，则可能出现这种情况。
在我们之前的研究18中，我们研究了驱动蛋白马达在微管上的空间分布，证明了滑动微管能够从溶液中富集驱动蛋白马达，导致微管长度方向上的马达密度增加。我们还发现，微管滑动的稳定性对溶液中驱动蛋白浓度和微管速度呈非线性依赖关系。
本方案为蛋白质马达在纳米级工程系统中的更高效应用以及对处于动态平衡的活性纳米系统设计的进一步研究奠定了基础。此外，该系统的动态特性使其可作为研究分子组分自修复和动态替换的模型系统，从而部分弥合了人工工程结构与天然结构之间的差距。

调控活性纳米系统行为的相互作用通常以长寿命、近乎不可逆的键合为特征1,2,3,4,5,6,7,8。一个被广泛研究的例子是微管-驱动蛋白系统，其中微管在表面固定且不可逆结合的驱动蛋白马达作用下发生滑动运动1,2,3,4,5。虽然组件之间可逆连接的系统已在理论上得到研究9,10，并在宏观尺度上实现11,12，但将其缩小至纳米尺度仍具挑战性。其主要难点之一在于，组件间键的断裂与重新形成通常需要环境条件发生较大变化。尽管此前已有研究实现了此类条件调控13,14,15，但这些方法依赖于对系统本身的修改，而非使其适应所处环境。设计能够在不干扰实验整体环境的前提下，持续自组装并重新组织形成结构的分子尺度系统，将为探索多种动态行为开辟新的途径16,17。
在此，我们介绍并演示构建一种在纳米尺度上动态组装与解离系统的详细方案。该系统及其基本行为此前已有介绍18：微管纤维由轨道驱动 可逆地 表面结合的驱动蛋白-1分子。这些驱动蛋白分子从溶液中被招募至表面，以推动微管向前运动，随后很快从表面解吸。一旦回到溶液中，它们可再次被招募以推动新的微管。在过去13,14,15，键的断裂与重新形成需要环境条件的改变；相比之下，我们的流动池环境保持不变，而驱动蛋白马达与表面发生相互作用。
本方案将帮助感兴趣的科研人员：（1）直观了解该方案的全部步骤，以及（2）协助解决此类检测中的问题。本方案源自 Howard 等人 1993 年描述的实验流程19。

<table><tbody><tr><td>488 nm 激光器</td><td>Omicron Laserage</td><td>LuxX 488-150</td><td></td></tr><tr><td>642 nm 激光器</td><td>Omicron Laserage</td><td>LuxX&amp;nbsp;642</td><td></td></tr><tr><td>酪蛋白</td><td>Sigma</td><td>C7078-500G</td><td></td></tr><tr><td>牛肝过氧化氢酶</td><td>Sigma</td><td>C40-500MG</td><td></td></tr><tr><td>磷酸肌酸</td><td>Sigma</td><td>P-7936</td><td></td></tr><tr><td>肌酸磷酸激酶</td><td>Sigma</td><td>C3755-500UN</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G2133-50KU</td><td></td></tr><tr><td>二氯二甲基硅烷溶液</td><td>Sigma</td><td>40140-25ML</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma</td><td>34869-100ML</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>Eclipse TI</td><td>尼康仪器公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>eGFP rkin430</td><td>由 George Bachand 提供</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378-25G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma</td><td>G0543-10KU</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸鸟苷</td><td>Sigma</td><td>G8877-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 超细擦拭纸</td><td>Sigma Pharmaceuticals</td><td>8089</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Chemical</td><td>A412</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>Milli-Q 超纯水净化系统</td><td>默克密理博公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸镍</td><td>Sigma</td><td>656895-50G</td><td></td></tr><tr><td>紫杉醇</td><td>Sigma</td><td>T1912-5MG</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P-6757</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F108-NTA</td><td>由 Jennifer Neff 和 AllVivo Vascular 提供</td><td></td><td>PEG-PPG-PEG-NTA</td></tr><tr><td>泊洛沙姆&amp;nbsp;F-108</td><td>Sigma</td><td>542342-250G</td><td>PEG-PPG-PEG</td></tr><tr><td>赛默飞世尔科技 Snap Cap 低吸附微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-403-190</td><td></td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Fisher Chemical</td><td>T324</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>微管蛋白，HiLyte647标记</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>TL670M</td><td></td></tr><tr><td>UV臭氧Procleaner</td><td>BioForce 纳米科学</td><td>PC440</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&amp;nbsp;Puradisc 注射器滤器</td><td>Sigma</td><td>WHA67840402</td><td></td></tr><tr><td>Zyla 4.2 sCMOS 相机</td><td>Andor Technology</td><td>sCMOS 4.2</td><td></td></tr></tbody></table>

组装由可逆附着驱动蛋白驱动的分子穿梭器

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

本方案描述了如何构建由驱动蛋白驱动的分子穿梭系统，其中驱动蛋白与表面之间为弱结合且可逆的连接。与以往的方案不同，在该系统中，微管从溶液中招募驱动蛋白马达分子，并将其放置在表面上。这些驱动蛋白随后促进微管在表面滑动，之后再解吸回到主体溶液中，从而能够被再次招募。这种持续的组装与解离过程导致系统表现出显著的动态行为，例如滑动的微管形成短暂存在的驱动蛋白轨迹。
本实验将描述多种实验方法：采用紫外-可见光分光光度法（UV-Vis spectrophotometry）测定试剂储备溶液的浓度；盖玻片将首先经过臭氧和紫外（UV）处理，随后进行硅烷化，再安装至流动池中；利用全内反射荧光（TIRF）显微镜同时对驱动蛋白马达和微管纤维进行成像。

在这些实验中，我们使用了按第1.3.2节方法制备的微管，并将其稀释了1000倍。驱动蛋白浓度为20 nM，ATP浓度为1 mM。成像采用全内反射荧光显微镜技术。滑行微管与驱动蛋白马达分别成像：使用647 nm激光激发时，微管清晰可见。Figure 1, 红色），而 GFP-驱动蛋白在 488 nm 激光激发下可见（Figure 1，绿色）。红光与绿光激发之间的时间间隔小于1秒。帧间间隔为10秒。微管呈现稳定的滑移运动。微管平均滑移速度约为800纳米/秒。微管表面密度为400毫米。-2驱动蛋白（绿色）的轨迹似乎延伸至微管（红色）尾端之外数微米。
<img alt="丝状体动态延时显微成像；间隔拍摄的荧光图像，红绿通道合并。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59068/59068fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: Gliding microtubules propelled by weakly surface-bound kinesin motors. 随着微管向前移动，它们会从溶液中积累驱动蛋白马达。这些马达在两种状态之间交替：单结合于微管，以及双结合于微管与表面。当双结合的马达到达微管末端时，马达被留下并以约0.1 s⁻¹的解离速率从表面缓慢脱附。-1因此，驱动蛋白马达的轨迹残留在微管后方。顶行：红色（微管）通道。中行：绿色（驱动蛋白）通道。底行：合并的红色（微管）与绿色（GFP-驱动蛋白）通道。比例尺：20 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59068/59068fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

我们提出一种构建分子穿梭装置的方案，其中表面附着的驱动蛋白马达推动带有染料标记的微管。驱动蛋白与表面之间的弱相互作用使其能够可逆地附着于表面，从而形成一种纳米尺度系统，该系统在保持功能完整性的同时，展现出组分的动态组装与解聚行为。

本方案描述了如何构建由驱动蛋白驱动的分子穿梭系统，其中驱动蛋白以较弱且可逆的方式附着于表面。相比之下……

本方案具有重要意义，因为它为设计处于动态平衡状态的纳米级生物系统进一步研究打开了大门。该技术填补了人工设计结构与天然结构之间的一部分空白，因为它能够研究我们称之为“自修复”或分子组分的动态替换现象。首次尝试该技术时最重要的建议是，确保实验人员严格遵守所有安全操作规程。首先，按照文本方案中的说明配制储备液。取21.8 µL BRB80缓冲液加入一个小的微量离心管中。然后加入1 µL氯化镁储备液、1 µL GTP储备液和1.2 µL DMSO储备液，完成微管生长缓冲液的配制。为启动微管聚合，将6.25微升微管生长缓冲液直接加入20微克冻干微管蛋白中；该微管蛋白标记为在647纳米处激发。以40 RPS涡旋振荡5秒。将样品置于冰上冷却5分钟。然后，在 37 °C 下孵育 45 分钟。为开始微管稳定化，向 490 µL BRB80 缓冲液中加入 5 µL 分装的紫杉醇溶液。将溶液以 30 RPS 涡旋振荡 10 秒。微管孵育45分钟后，取5微升该溶液加入BRB80和紫杉醇混合液中，配制成MT100溶液。首先，将9.0微升分装的酪蛋白溶液加入291微升BRB80缓冲液中。用移液器将83微升BRB80酪蛋白溶液转移至一个新的6毫升微量离心管中。加入1 µL的D-葡萄糖、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、DTT、磷酸肌酸和肌酸磷酸激酶。然后，向运动缓冲液中加入1 µL的ATP储备溶液。轻轻振荡或涡旋混匀，使化学物质均匀分布。接下来，向运动溶液中加入1 µL已配制的驱动蛋白溶液，使其终浓度为20 nmol/L。向运动溶液中加入10 µL的MT100溶液。对于流动池，需同时使用大片和小片盖玻片。将所有盖玻片用乙醇冲洗两次，再用超纯水冲洗两次。将清洗后的盖玻片在超纯水中超声处理5分钟。然后，在50至75摄氏度的烘箱中干燥盖玻片。使用紫外臭氧清洗仪，在室温及正常大气条件下处理每个盖玻片的一侧，持续15分钟。用镊子将每个盖玻片翻面，再用紫外臭氧处理未处理过的另一侧。将处理后的盖玻片在超纯水中超声处理5分钟。然后，在烘箱中以50至75摄氏度的温度将它们干燥。接着，按照文本方案中所述穿戴防护装备。将每块盖玻片浸入生理盐水溶液中15秒。将盖玻片用甲苯洗涤两次，再用甲醇洗涤三次。使用加压氮气干燥盖玻片。待盖玻片干燥后，剪取一段双面胶，尺寸为2厘米×2.5厘米。将此样品沿纵向切成两半，形成两个1厘米×2.5厘米的条状片段。将大号盖玻片置于精细操作擦拭纸上，再将胶带条沿边缘纵向粘贴在盖玻片上，使两段胶带之间形成一个1厘米×2.5厘米的区域。最后将小号盖玻片贴在胶带条上方，完成流动池的组装。首先，将约20微升的PEG-PPG-PEG溶液注入已组装的流动池中。让溶液在表面吸附5分钟，然后通过注入缓冲液的方式，用20微升BRB80缓冲液置换三次。最后，将20微升运动性溶液注入流动池中。此后，如果计划进行的实验超过一小时，需用封片油脂密封流动池的边缘，以防止蒸发。使用物镜型全内反射荧光显微镜进行成像。在物镜上滴加一滴浸油。接下来，将流动池放置在显微镜载物台上，并升起物镜，直至物镜上的油与流动池接触。使用显微镜的联锁盖系统，阻止所有激光逸出。然后，打开激光器，使用642纳米激光聚焦到流动池的下表面以成像微管，同时使用488纳米激光成像GFP标记的驱动蛋白马达。记录感兴趣的图像或视频。只要流动池中存在运动活性，即可持续进行图像采集。本研究介绍了一种活性纳米级系统，该系统通过自组装弱结合的结构单元来构建自身的运动轨道。利用全内反射荧光显微镜（TIRF），可将滑行的微管与驱动蛋白马达分别成像。当使用647纳米激光激发时，微管可见。当使用488纳米激光激发时，GFP标记的驱动蛋白可见。激发与红绿光信号出现之间的时间间隔小于一秒。如图所示，滑动的微管从溶液中富集驱动蛋白马达，并将其沉积在表面。驱动蛋白马达在微管后方停留短暂时间，随后返回溶液中。在运动溶液的抗荧光淬灭剂中，试剂的浓度必须准确，否则光漂白会导致实验失败。该技术为蛋白质马达在纳米工程系统中的更高效应用奠定了基础。从而实现更复杂纳米结构的设计与研究。

assembling-molecular-shuttles-powered-by-reversibly-attached-kinesins

Research

科研

JoVE Journal

Engineering

工程

由可逆连接的运动素提供动力的分子穿梭机的组装

由功能化微管在表面附着的驱动蛋白马达上滑行所构成的分子穿梭系统，可作为一种纳米级运输系统。本文描述了一种典型穿梭系统的组装方法。...

驱动蛋白动力分子穿梭车的货物装载

囊泡或细胞器等货物的细胞内运输由分子马达蛋白沿极性微管进行。本方案描述了神经元内单个货物颗粒运输方向性与其相关马达蛋白的种类和相对含量之间的关联分析方法。...

利用“货物定位图谱”分析法表征运动性轴突运输货物上分子马达的组成

本文介绍了一种鉴定驱动蛋白-1（Kinesin-1）货物分子的实验方案。驱动蛋白-1重链（KIF5B）的一种无马达功能突变体会在细胞质中形成聚集体，并诱导其货物分子共同聚集。通过荧光显微镜可同时检测到这两类聚集体。该策略同样可用于鉴定其他马达蛋白的货物分子。...

利用荧光显微镜鉴定驱动蛋白-1的货物分子

有丝分裂纺锤体的组装和定位依赖于微管动力学、马达蛋白和交联蛋白共同产生的作用力。本文介绍了我们近期开发的方法，该方法利用球形乳液液滴的几何限域，自下而上地重建基本的有丝分裂纺锤体。...

在球形乳液液滴中重建基础有丝分裂纺锤体

本实验方案的目的是在DNA折纸纳米结构上组装分子马达的集合体，并利用全内反射荧光显微镜观察该集合体的运动行为。...

在DNA折纸纳米结构上构建动力蛋白与驱动蛋白马达复合体用于单分子观测

双向有丝分裂驱动蛋白-5 Cin8 在运动过程中会聚集形成不断分裂和融合的簇状结构。聚集形成簇状结构还会改变 Cin8 的运动速度和方向性。本文介绍了一种利用纯化的 Cin8-GFP 进行运动性检测的实验方案，以及对 Cin8...

来自 S. cerevisiae 细胞的双向驱动蛋白-5 Cin8 单分子及分子簇的运动特性

此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外...

直接测量重建的活性微管束内部作用力

本研究详细描述了利用Sf9-杆状病毒表达系统纯化驱动蛋白-3家族成员KIF1A(1-393LZ)的方法。体外对这些纯化的马达蛋白进行单分子及多马达滑动分析，结果显示其运动特性...

单分子分析Sf9纯化的超进程性驱动蛋白-3家族马达

本文介绍了一种使用植物微管交联蛋白MAP65和聚乙二醇（PEG）作为拥挤剂，形成类 tactoid...

微管束状聚集体的自组装

本文介绍了可调控的三维共缠结肌动蛋白丝与微管复合网络的构建与表征方法。该复合材料在肌球蛋白II和驱动蛋白马达的驱动下发生主动重构和弹道运动，并可通过调节肌动蛋白、微管、马达蛋白和被动交联分子的相对浓度进行调控。...

重构与表征具有可调马达驱动动力学和力学性能的微丝-微管复合物

了解利用运动素驱动蛋白推动微管组装分子穿梭机的方法。该技术通过全内反射荧光显微镜实时观察微管动态组装与解聚过程，为纳米生物物理学研究提供新工具。

组装由可逆附着驱动蛋白驱动的分子穿梭器

探索更多视频