组装由可逆附着驱动蛋白驱动的分子穿梭器

本方案具有重要意义，因为它为设计处于动态平衡状态的纳米级生物系统进一步研究打开了大门。该技术填补了人工设计结构与天然结构之间的一部分空白，因为它能够研究我们称之为“自修复”或分子组分的动态替换现象。首次尝试该技术时最重要的建议是，确保实验人员严格遵守所有安全操作规程。

首先，按照文本方案中的说明配制储备液。取21.8 µL BRB80缓冲液加入一个小的微量离心管中。然后加入1 µL氯化镁储备液、1 µL GTP储备液和1.2 µL DMSO储备液，完成微管生长缓冲液的配制。

为启动微管聚合，将6.25微升微管生长缓冲液直接加入20微克冻干微管蛋白中；该微管蛋白标记为在647纳米处激发。以40 RPS涡旋振荡5秒。将样品置于冰上冷却5分钟。

然后，在 37 °C 下孵育 45 分钟。为开始微管稳定化，向 490 µL BRB80 缓冲液中加入 5 µL 分装的紫杉醇溶液。将溶液以 30 RPS 涡旋振荡 10 秒。

微管孵育45分钟后，取5微升该溶液加入BRB80和紫杉醇混合液中，配制成MT100溶液。首先，将9.0微升分装的酪蛋白溶液加入291微升BRB80缓冲液中。用移液器将83微升BRB80酪蛋白溶液转移至一个新的6毫升微量离心管中。

加入1 µL的D-葡萄糖、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、DTT、磷酸肌酸和肌酸磷酸激酶。然后，向运动缓冲液中加入1 µL的ATP储备溶液。轻轻振荡或涡旋混匀，使化学物质均匀分布。

接下来，向运动溶液中加入1 µL已配制的驱动蛋白溶液，使其终浓度为20 nmol/L。向运动溶液中加入10 µL的MT100溶液。对于流动池，需同时使用大片和小片盖玻片。

将所有盖玻片用乙醇冲洗两次，再用超纯水冲洗两次。将清洗后的盖玻片在超纯水中超声处理5分钟。然后，在50至75摄氏度的烘箱中干燥盖玻片。

使用紫外臭氧清洗仪，在室温及正常大气条件下处理每个盖玻片的一侧，持续15分钟。用镊子将每个盖玻片翻面，再用紫外臭氧处理未处理过的另一侧。将处理后的盖玻片在超纯水中超声处理5分钟。

然后，在烘箱中以50至75摄氏度的温度将它们干燥。接着，按照文本方案中所述穿戴防护装备。将每块盖玻片浸入生理盐水溶液中15秒。

将盖玻片用甲苯洗涤两次，再用甲醇洗涤三次。使用加压氮气干燥盖玻片。待盖玻片干燥后，剪取一段双面胶，尺寸为2厘米×2.5厘米。

将此样品沿纵向切成两半，形成两个1厘米×2.5厘米的条状片段。将大号盖玻片置于精细操作擦拭纸上，再将胶带条沿边缘纵向粘贴在盖玻片上，使两段胶带之间形成一个1厘米×2.5厘米的区域。最后将小号盖玻片贴在胶带条上方，完成流动池的组装。

首先，将约20微升的PEG-PPG-PEG溶液注入已组装的流动池中。让溶液在表面吸附5分钟，然后通过注入缓冲液的方式，用20微升BRB80缓冲液置换三次。最后，将20微升运动性溶液注入流动池中。

此后，如果计划进行的实验超过一小时，需用封片油脂密封流动池的边缘，以防止蒸发。使用物镜型全内反射荧光显微镜进行成像。在物镜上滴加一滴浸油。

接下来，将流动池放置在显微镜载物台上，并升起物镜，直至物镜上的油与流动池接触。使用显微镜的联锁盖系统，阻止所有激光逸出。

然后，打开激光器，使用642纳米激光聚焦到流动池的下表面以成像微管，同时使用488纳米激光成像GFP标记的驱动蛋白马达。记录感兴趣的图像或视频。只要流动池中存在运动活性，即可持续进行图像采集。

本研究介绍了一种活性纳米级系统，该系统通过自组装弱结合的结构单元来构建自身的运动轨道。利用全内反射荧光显微镜（TIRF），可将滑行的微管与驱动蛋白马达分别成像。当使用647纳米激光激发时，微管可见。

当使用488纳米激光激发时，GFP标记的驱动蛋白可见。激发与红绿光信号出现之间的时间间隔小于一秒。如图所示，滑动的微管从溶液中富集驱动蛋白马达，并将其沉积在表面。

驱动蛋白马达在微管后方停留短暂时间，随后返回溶液中。在运动溶液的抗荧光淬灭剂中，试剂的浓度必须准确，否则光漂白会导致实验失败。该技术为蛋白质马达在纳米工程系统中的更高效应用奠定了基础。

从而实现更复杂纳米结构的设计与研究。