由可逆连接的运动素提供动力的分子穿梭机的组装

该协议意义重大，因为它为进一步研究处于动态平衡的纳米级生物系统的设计打开了大门。这项技术填补了工程结构与自然结构之间的部分空白，因为它能够研究我们可以称之为"自我修复"或分子成分的动态替代。首次尝试这种技术最重要的建议是确保实验者遵循所有安全规程。

首先，准备文本协议中概述的库存解决方案。将BRP80缓冲器移液器21.8微升放入小型微型离心管。加入 1 微升氯化镁库存溶液、1 微升 GTP 库存溶液和 1.2 微升的 DMSO 库存溶液，完成微管生长缓冲液的制备。

要开始微管聚合，将6.25微升微管生长缓冲液直接加入20微克的冻干管状曲;标注在647纳米时兴奋。40 RPS 的漩涡 5 秒。冷却冰上的等分 5 分钟。

然后，在37摄氏度下孵育45分钟。要开始微管稳定，在BRBR80缓冲液的490微升中加入5微升的分石塔塞尔溶液。在 30 RPS 下旋转溶液 10 秒。

微管的45分钟孵育时间上升后，在BRBR80和paclitaxel混合物中加入5微升，以创建MT100溶液。首先，在 291 微升的 BRB80 缓冲器中添加 9.0 微升的等分卡明溶液。将BRP80卡明溶液的移液器83微升放入新的6毫升微离心管中。

加入1微升D-葡萄糖、葡萄糖氧化酶、乳酸酶、DTT、磷酸肌酸和磷酸激酶。然后，在动力解决方案中添加 1 微升的库存 ATP 溶液。轻拂，或涡流等分，以均匀分布的化学物质。

接下来，在动力溶液中加入1微升的已准备激酶溶液，使最终浓度为20纳米摩尔。向动力解决方案添加 10 微升 MT100 解决方案。对于流动单元，请使用大盖玻片和小盖玻片。

用乙醇冲洗所有盖玻片两次，用超纯水冲洗两次。在超纯水中对洗涤的盖玻片进行声波处理 5 分钟。然后，在 50 至 75 摄氏度的温度下将盖玻片干燥在烤箱中。

使用紫外线臭氧清洁剂在室温和正常大气条件下处理每个盖玻片的一侧 15 分钟。使用钳子，翻转每个盖玻片，并使用紫外线臭氧治疗未经处理的一面。在超纯水中对经过处理的盖玻片进行声波处理 5 分钟。

然后，在50至75摄氏度的温度下在烤箱中干燥。接下来，请使用文本协议中概述的保护装备。将每个盖玻片浸入盐水溶液中 15 秒。

用甲苯清洗盖玻片两次，用甲醇清洗三次。使用加压氮气干燥盖玻片。盖玻片干燥后，切一块 2 厘米或 2.5 厘米的双面胶带。

将这块垂直切成两块 1 厘米，由 2.5 厘米条状。将大盖玻片放在精致的任务刮水器上，将胶带贴到它上，沿着边缘长度，在胶带片之间形成 1 厘米 2.5 厘米的面积。将小盖玻片贴在胶带条上，以完成流动单元组件。

首先，将PEG-PPG-PEG溶液的约20微升液流入组装的流单元。让溶液在表面上吸收5分钟，然后，通过将缓冲液流入三次，用20微升BRBR80缓冲液交换该溶液。将运动溶液的20微升流入流动单元。

在此之后，用润滑脂密封流动单元的边缘，以防止蒸发，如果计划的实验时间超过一小时。使用目标型总内花光显微镜执行成像。在目标上放置一滴浸入油。

接下来，将流动单元放在显微镜平台上。并提出目标，直到目标上的油与流动单元之间接触。使用显微镜的联锁盖系统阻止所有激光逸出。

然后，打开激光，使用 642 纳米激光对流单元的下表面进行聚焦，对微管进行成像，使用 488 纳米激光对 GFP Kinesin 电机进行成像。录制感兴趣的图像或视频。只要流动细胞中具有活动性，就可以记录图像。

本研究提出了一个主动纳米尺度系统，它自组装弱结合的构建基块来构建自己的轨道。使用 tirf 显微镜，滑翔微管与激宁电机分开成像。使用 647 纳米激光激发时，微管可见。

当使用 488 纳米激光兴奋时，GFPkinesin 是可见的。激发与红绿灯之间的时间不到一秒。可以看到，滑翔微管从溶液中积累激辛电机，并沉积在表面上。

在返回溶液之前，Kinesin电机在微管的后，会保持一小段时间。在运动溶液的抗淡度中具有正确的试剂浓度是非常重要的，否则，光漂白会导致实验失败。该技术为在纳米级工程系统中更有效地使用蛋白质电机铺平了道路。

因此，能够设计和研究更复杂的纳米结构。