使用开源工具追踪和量化 C. elegans 的发育过程

使用图像分析软件与发育生物学的总体目标是为生物过程的机制模型获取定量数据。该方法有助于回答发育生物学中的关键问题，例如：如何对突变体表型进行定量分析？该方法的主要优势在于能够使研究人员以无偏倚的方式识别生物过程和发育现象中的改变。

尽管该方法可用于研究海葵的发育与形态发生过程，但也适用于其他模式生物，例如乔氏丝蚓。细胞形态的三维重建操作将由我实验室的博士研究生西娜·勒曼（CINA Leman）演示。安装IM MOD程序后，打开阉人壳（eunuch shell），在IM mod窗口中输入Im mod。从包含原始数据的文件中选择合适的文件以生成三维模型，并利用信息窗口在zap窗口中定位物体的底部和顶部。

在信息窗口中，再次描画细胞轮廓，于每个细胞的顶层面创建第一个轮廓，并注意为每个细胞创建一个新的对象。然后在Z轴方向向下滚动，为每个Z平面创建新的轮廓，并依次为每个细胞创建新的对象。在为模型勾画完适当数量的细胞后，打开模型视图窗口以检查对象及其轮廓。

然后在模型视图工具栏中，选择编辑和对象。相应的编辑窗口将打开，用于将所有细胞建模为填充的闭合对象。选择网格作为绘制数据类型，填充作为绘图样式。

单击网格化并勾选“封口”选项。然后根据需要勾选多个对象，再单击生成网格。程序将根据轮廓序列生成相应的实体对象。

根据需要在视图窗口中调整Z轴比例，以改变Z轴采样因子。然后在编辑菜单下选择视图，旋转三维对象，并根据需要保存细胞的静态图像或视频，以追踪荧光延时记录中的目标物体。首先使用NDR将原始数据转换为TIFF文件。

然后打开文件。在末端滴加。选择二维查看器图标，并在数据菜单下点击适应范围图标以调整直方图。

选择文件、命名、图像、设置、通道，并设置 X、Y、Z 分辨率，输入 X、Y 和 Z 的数值。如需标注细胞核，请切换至目标层面，再次选择二维查看器，然后从下拉菜单中选择谱系，并选择新建谱系。

单击并拖动目标细胞核以标记。然后在细胞核上单击右键，选择“重命名粒子”。在下拉菜单中输入粒子名称，然后拖动箭头图标以调整圆圈的直径。

接下来，单击右侧图标以标记细胞核的中央平面。然后通过底部工具栏中的帧（frame）和 Z 选项前进至相应的时间点和层面，并相应调整标记细胞核的圆圈的位置或大小，直至被追踪的细胞发生分裂。当观察到细胞分裂时，标记子代细胞核，并单击窗口图标以切换至谱系模式。

观察者同时标记三个细胞核，并在线系选项下选择关联父代。当所有细胞均被追踪后，点击文件名并切换至相应通道。标记细胞分裂残余物，以利用粒子图像速度对称性软件定量分析皮层流。

在PIF实验室中加载新的图像文件，并选择测序方式：1、2、2、3。然后，导航至包含目标图像序列的目录。

选择图像并单击“添加”以导入图像。然后在分析设置下，选择排除项、ROI 掩模，并使用该按钮。

在分析设置下，为当前帧绘制掩膜，以屏蔽图像中不需要分析的部分。再次选择PIF设置，并选择快速傅里叶变换窗函数变形作为所需的PIF算法。在第一次处理中，输入64像素的 interrogation area（ interrogation 区域）值，步长为32像素，进行第二次处理。

输入询问区域值为32像素，步长为16。然后从窗口变形下拉菜单中选择线性，并选择高斯2×3点法进行亚像素位移估计。接着从分析菜单中选择分析，并选择分析所有帧的后处理；从后处理菜单中选择矢量验证，并从绘图菜单中对所有帧应用标准差滤波阈值为7。

选择衍生参数。修改数据，随后调整矢量、每帧像素，并调节矢量平滑度和高通滤波器。在将这些调整应用于所有帧后，将使用的帧数设置为1以结束。

最后，点击“计算平均向量”按钮，以测量所有图像帧的平均向量，重点关注如上所述成像的野生型秀丽隐杆线虫成虫性腺转弯区域。通过显微镜数据生成生殖细胞的三维模型，从而分析细胞从远端向近端输卵管移动过程中细胞大小的变化，该分析基于双色延时显微成像。利用线粒体组蛋白融合蛋白和非肌肉肌球蛋白在NDR中的标记所获得的模型，展示了细胞分裂残余物遗传的典型模式。

此外，根据该实验中的谱系数据，可以获得每个细胞L、细胞分裂残余物的运动轨迹，以及其与细胞分裂时间的相关性。通过高时间分辨率的短期延时显微镜观察皮层非肌球蛋白II，以评估野生型胚胎与rga-3（编码RhoGTP酶激活蛋白的基因）缺失胚胎之间皮层极化流动动力学的差异，结果符合预期。在野生型胚胎中，流动主要沿胚胎的长轴方向进行。

在RGA三重RNA干扰胚胎中，流动方向与该轴垂直，这一点从PIP分析中可以明显看出。一旦掌握了手动分割复杂物体和胚胎发育过程中的细胞追踪技术，若操作得当，可在数小时内完成细胞与物体的追踪。在尝试进行细胞和物体追踪时，重要的是要记住设置适当的时间分辨率，以免在使用此处所述三种工具进行分析时丢失目标物体。

还可以进行统计学分析，以回答有关变异性的各种问题，或仅用于比较不同的胚胎。采用定量图像分析软件，使我们以及与我们类似的发育生物学家能够以前所未有的精细程度探索发育过程中的形态发生机制。观看本视频后，您应能充分理解如何使用多种软件工具进行定量图像分析。