Name: 跟踪和量化的发育过程℃。线虫使用开源工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 了解如何使用开源工具跟踪和量化秀丽隐杆线虫的发育过程。本方法涵盖三维细胞形状重建、亚细胞结构手动追踪及皮质收缩流分析，为发育生物学研究提供定量数据支持。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者无任何利益冲突需要披露。

1. 准备 秀丽隐杆线虫 使用微珠进行延时显微成像的胚胎制备
<ol>
	<li>使用线虫挑针（铂金丝）将带有卵的成虫转移至一滴 M9 缓冲液中，先剧烈振荡以去除细菌，然后使用固定在牙签/移液器吸头上的睫毛或将尖头玻璃毛细管移至相邻的 M9 缓冲液滴中进行清洗。</li>
	<li>用 M9 缓冲液将含有直径为 20 µm 聚苯乙烯微球的分散液稀释 10 倍（1 L M9 缓冲液包含 3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4、5 g NaCl，经高压灭菌（20 分钟，120 °C）后，再加入 1 ml 1 M MgSO4 溶液）。</li>
	<li>使用任意类型的细玻璃毛细管（例如，熔点测定毛细管或用于拉制注射针的毛细管）、一段长约 0.5 m 的橡胶、硅胶或类似材质的透明软管、一个 200 µl 移液器吸头、一个 200 µl PCR 管盖、一个小注射器用疏水滤膜（例如，孔径为 0.2–0.45 µm、直径为 15–50 mm 的尼龙、PTFE 或类似材料滤膜）以及一个 1000 µl 移液器吸头，制作一个口控移液装置。此类口控移液装置可确保实验人员不会接触到任何生物材料。</li>
	<li>将 200 µl 移液器吸头尖端朝前插入软管中，并用带有中心穿孔的 PCR 管盖封堵，穿孔直径需与所用毛细管匹配。可使用非常尖锐的锥子或解剖针来制作穿孔。</li>
	<li>将细玻璃毛细管拉细后插入穿孔中，将滤膜插入软管另一端，并将一个 1000 µl 移液器吸头作为吹吸口（图 1）。</li>
	<li>用洁净的剃须刀片或解剖刀在阴门处横向切割带有卵的成虫以进行解剖。 
	注意：通常切割后会释放出大量胚胎。然而，若需要早期胚胎，有时需使用睫毛或尖针从尸体中进一步释放。</li>
	<li>将一滴稀释后的聚苯乙烯微球分散液（约 4 µl）用移液器滴加到 24×60 mm 盖玻片上，并使用口控移液装置将胚胎转移至该液滴中。</li>
	<li>小心地将一小块（例如，&#160;18×18 或 20×20 mm）盖玻片覆盖在液滴上，确保液滴已完全铺展。 
	注意：液滴应足够小，以免接触小盖玻片的边缘。</li>
	<li>用液化的凡士林密封装片，在 24×60 mm 盖玻片一侧滴加一滴浸油，然后进入“延时显微镜”部分。</li>
</ol>
2. 成年个体的制备 秀丽隐杆线虫 使用纳米珠进行活体成像时间序列显微观察的动物模型
注意：通常情况下，成年动物的制片方案是参考文献18中方案的改进版本。利用该方案，可对成年动物进行长期的共聚焦显微镜延时成像。
<ol>
	<li>在M9缓冲液中配制1.5% (w/v) 琼脂糖溶液，煮沸（1分钟，100 °C，水浴或微波炉）。不建议使用更高浓度的琼脂糖，因为这可能导致肠道和/或部分性腺被挤出。</li>
	<li>在两张载玻片上各粘贴2-3层胶带。将一张无胶带的载玻片置于两张带胶带的载玻片之间。</li>
	<li>用移液器吸头取一滴热琼脂糖溶液，置于中间载玻片的中央。迅速将另一张载玻片盖在液滴上，使其两侧由胶带层支撑。这样可形成一个直径约10 mm的圆形平坦琼脂垫。</li>
	<li>在琼脂垫上滴加一滴100 nm微球溶液（未稀释，即2.6% (w/v)）。用线虫挑取工具将1-10条清洗干净的成虫转移至液滴中。按照方案1所述，用18×18 mm盖玻片和凡士林密封。</li>
</ol>
3. 时间序列显微镜观察
<ol>
	<li>在显微镜载玻片或盖玻片夹层上滴加一滴镜油。使用明场照明和低倍物镜（5x 或 10x）定位样品。 
	注意：尽可能减少蓝光暴露（尤其是对于 秀丽隐杆线虫 胚胎） 例如， 不要使用落射荧光显微镜寻找或聚焦样本，而应使用明场显微镜。</li>
	<li>切换至更高倍数物镜（40x 或 60x），调节焦距使样品清晰成像（根据采集软件的不同，可对准样品的中央平面或顶部/底部平面）。</li>
	<li>将采样间隔设置为每1分钟记录一次，共30个层面，层间距为1 µm。若具备自动xy或xyz载物台，可在一次实验中记录多个位点。切换至荧光成像模式，并再次检查焦距。 
	注意：尽量避免使用高激光功率，而应采用较低强度并适当延长曝光时间。图像采集后应立即在图像采集软件或 ImageJ 中进行测量，以避免信号饱和；信号饱和会压缩动态范围，同时也意味着过量的辐射暴露。</li>
	<li>开始记录延时成像序列。 
	注意：为避免分析伪影，应从较长的（3-10 分钟）时间间隔开始对样品进行扫描，并逐步增加时间采样频率至所需的时间间隔。在进行统计分析时，两种情况下的发育时间进程及终点应保持相似。此外，通常有必要评估光毒性及存活率。因此，在长时间延时显微成像后，应将样品从载片上回收，并检查其是否能够继续发育或存活。</li>
</ol>
4. 使用 IMOD 重建三维细胞形态模型
注意：IMOD 软件可从 IMOD 官方网站获取：http://bio3d.colorado.edu/imod/。该网站提供了软件安装说明。在使用 Windows 操作系统时，需安装 Unix 工具包，该工具包也可在 IMOD 网站上作为独立软件包获取。此外，IMOD 网站上还提供了一份详尽编制的 3dmod 入门指南（http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html）。
<ol>
	<li>打开 Unix 命令行终端并输入 &#34;imod&#34;IMOD 窗口将打开。从中选择包含原始数据的文件（理想情况下为堆叠的 tif 文件或类似格式），以生成三维模型。</li>
	<li>使用信息窗口（上）在ZaP窗口中定位物体的底部和顶部&amp;#38;向下滚动工具。</li>
	<li>开始描画细胞轮廓。重要的是，确保每个细胞为一个独立对象。从每个细胞的最顶层开始，利用信息窗口创建第一个轮廓。然后在z轴方向逐层下移，为每一z层创建新的轮廓。</li>
	<li>根据三维建模所需，对尽可能多的细胞进行相同操作。&#160; 开始处理新细胞时，务必创建一个新对象。 
	注意：轮廓追踪有多种不同方法，并有若干有用的插件可供选择。详情请访问 IMOD 官方网站及在线教程。在本示例中，采用的是默认设置。</li>
	<li>打开 &#34;模型视图&#34; 用于观察物体及其轮廓的窗口。</li>
	<li>在 &#34;模型视图&#34; 工具栏选择 &#34;编辑&#34; -&#34;物体&#34;相应的编辑窗口将打开。</li>
	<li>为了将细胞建模为充满且封闭的对象，请选择 &#34;网孔&#34; 作为 &#34;绘制数据类型&#34; 和 &#34;填充&#34; 作为 &#34;绘图风格&#34;. 点击 &#34;网格划分&#34; 在窗口左下角的可滚动选择区域中。勾选该选项 &#34;帽&#34; 在右下角的选择框中，根据需要勾选多个对象，然后单击 &#34;网格 全部&#34;程序将根据轮廓堆栈生成三维实体。可通过更改z轴采样因子进行调整 &#34;Z轴尺度&#34; 在 &#34;查看&#34; 窗口</li>
	<li>移动/旋转三维对象&#34;编辑&#34; - &#34;查看&#34;）并保存快照或视频（&#34;文件&#34; -&#34;快照 TIFF 为……&#34; 或 &#34;视频/图像序列&#34;).</li>
</ol>
5. 使用 Endrov 跟踪荧光标记的结构
注意：为了追踪细胞分裂残留物，应使用带有细胞核或质膜标记的菌株以进行细胞识别（例如， H2B、PH-PLC-d1）以及细胞分裂残留标记物（例如， NMY-2、ZEN-4）。细胞核或质膜标记物对于确定哪个子细胞继承了细胞分裂残余物至关重要。
<ol>
	<li>为实现快速加载和便于使用，原始数据必须转换为 TIFF 文件（例如， 在 ImageJ 中）。接着，打开 Endrov，通过选择要分析的文件并加载 &#34;加载文件&#34; 从文件菜单中选择该选项。单击 &#34;2D 观察器&#34; 工具栏上的图标。</li>
	<li>通过单击直方图进行调整 &#34;拟合范围&#34; 图标（Endrov 屏幕右下角的蓝色图标）。通过前往设置 XYZ 分辨率 &#34;数据&#34; -&#34;文件名&#34;-&#34;图像集&#34; -&#34;通道&#34;-&#34;设置XYZ分辨率&#34;输入 X、Y 和 Z 的值， 例如， 5、5、1，当X和Y方向分辨率为0.2 µm且Z方向每1 µm采样一次时。</li>
	<li>为标记细胞核，请移动到目标层面并点击 &#34;2D 观察器&#34;选择 &#34;谱系&#34; 从下拉菜单中选择 &#34;新谱系&#34;.</li>
	<li>通过点击并拖动细胞核，可对其进行标记。要命名细胞核，请右键单击并选择 &#34;重命名颗粒&#34; 从下拉菜单中选择。要增大或减小圆的直径，请拖动标记圆左侧出现的箭头图标。要标记细胞核的中央平面，请点击右侧图标。使用细胞膜标记物时，可绘制一个较大的球体，以覆盖大部分细胞。</li>
	<li>要继续进行时间和平面的选择，请选择 &#34;框架&#34; 和 &#34;Z&#34; 底部工具栏中的选项。转到下一个时间点后，相应地调整标记细胞核的圆圈的位置或大小。重复此操作，直至被追踪的细胞分裂。</li>
	<li>当发生细胞分裂时，标记子代细胞核并切换至 &#34;谱系观察器&#34;。可通过单击来选择 &#34;Windows&#34; 顶部工具栏上的图标。同时标记所有三个细胞核，然后前往 &#34;谱系&#34; 顶部工具栏中的选项并选择 &#34;关联父级&#34;.</li>
	<li>细胞追踪完成后，切换至标记细胞分裂残余物的通道进行追踪。切换通道时，点击工具栏左下角的文件名。细胞分裂残余物（或任何其他结构）的追踪方法与上述细胞核的追踪方法相同。</li>
	<li>关闭后重新打开软件时，必须前往 &#34;2D 观察器&#34; -&#34;谱系&#34;-&#34;编辑&#34; 并点击将要编辑的谱系编号。</li>
</ol>
6. 使用 PIVlab 分析皮层肌动球蛋白流
注意：PIVlab 是一款可免费获取的软件，来源为：&#160;http://pivlab.blogspot.de/；可通过在 Matlab 命令行环境中输入 PIVlab_GUI 来启动。使用 PIVlab 时，建议将图像序列保存在单独的文件夹中。
<ol>
	<li>从&#34;文件菜单&#34;启动一个新会话。点击&#34;加载图像&#34;按钮以加载图像文件。</li>
	<li>选择序列顺序 1-2、2-3、……，然后导航至包含目标图像序列的目录。选中图像后，点击&#34;添加&#34;按钮并导入。</li>
	<li>进入&#34;分析设置&#34;，选择&#34;排除区域（ROI，掩膜）&#34;。或者，按下&#34;Ctrl + E&#34;。使用&#34;为当前帧绘制掩膜&#34;按钮，使图像中不需要的部分失效（例如胚胎外部区域）。</li>
	<li>从&#34;分析设置&#34;菜单中选择&#34;PIV 设置&#34;。或者，按下&#34;Ctrl + S&#34;。选择&#34;FFT 窗口变形&#34;作为所需的 PIV 算法。 
	注意：快速傅里叶变换（FFT）可降低计算成本，但仅建议在信号远高于噪声、且所研究粒子的位移不超过分析区域一半时使用（见 6.5）。</li>
	<li>为三次扫描输入以下值，这些值表示连续图像之间强度互相关的 interrogation 区域：第一次扫描：interrogation 区域为 64 像素，步长为 32；第二次扫描：interrogation 区域为 32 像素，步长为 16。从窗口变形下拉菜单中选择&#34;线性&#34;。选择高斯 2*3 点法进行亚像素位移估计。</li>
	<li>从分析菜单中选择&#34;开始分析！&#34;，然后使用&#34;分析所有帧&#34;按钮开始分析。</li>
	<li>进行后处理时，从&#34;后处理&#34;菜单中选择&#34;矢量验证&#34;，并将标准差（Stdev）滤波阈值设为 7，应用到所有帧。</li>
	<li>从&#34;绘图&#34;菜单中选择&#34;导出参数/修改数据&#34;。从下拉菜单中选择&#34;矢量 [px/帧]&#34;。调整矢量的平滑度和高通滤波器，并应用到所有帧。</li>
	<li>为计算所有帧的平均矢量，将&#34;使用帧&#34;设置为 1:end，然后点击&#34;计算平均矢量&#34;按钮。</li>
</ol>

<ol><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+cell+lineages+originate+in+the+gastrula+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish.</a> Science. 231 (4736), 365-368 (1986).</li>
<li>Nishida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+in+ascidian+embryos+by+intracellular+injection+of+a+tracer+enzyme.+III.+Up+to+the+tissue+restricted+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage.</a> Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+plant+growth+in+4D%3A+robust+tissue+reconstruction+and+lineaging+at+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution.</a> Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).</li>
<li>Olivier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+reconstruction+of+early+zebrafish+embryos+using+label-free+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy.</a> Science. 329 (5994), 967-971 (2010).</li>
<li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146 (4), 568-581 (2011).</li>
<li>Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li>
<li>Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+inference+of+systems-level+mechanistic+models+of+development+from+live-imaging-based+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis.</a> Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).</li>
<li>Amat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+accurate+reconstruction+of+cell+lineages+from+large-scale+fluorescence+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data.</a> Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).</li>
<li>He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+constriction+drives+tissue-scale+hydrodynamic+flow+to+mediate+cell+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation.</a> Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).</li>
<li>Singh, D., Pohl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+rotational+cortical+flow%2C+asymmetric+midbody+positioning%2C+and+spindle+rotation+mediates+dorsoventral+axis+formation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans.</a> Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).</li>
<li>Singh, D., Pohl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+function+for+the+midbody+remnant+in+embryonic+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A function for the midbody remnant in embryonic patterning.</a> Commun. Integr. Biol. 7, e28533(2014).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endrov%3A+an+integrated+platform+for+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Endrov: an integrated platform for image analysis.</a> Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).</li>
<li>Thielicke, W., Stamhuis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIVlab+-+Towards+User-friendly%2C+Affordable+and+Accurate+Digital+Particle+Image+Velocimetry+in+MATLAB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Open+Research+Software%22%5BJournal%5D)">PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB.</a> Journal of Open Research Software. 2 (1), e30(2014).</li>
<li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS One. 8 (1), e53419(2013).</li>
<li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li>
<li>Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+GTPase-activating+proteins+RGA-3+and+RGA-4+are+required+to+set+the+initial+size+of+PAR+domains+in+Caenorhabditis+elegans+one-cell+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).</li>
<li>Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+the+novel+RhoGAP+proteins+RGA-3+and+RGA-4+in+the+germ+line+and+in+the+early+embryo+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans.</a> Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).</li>
<li>Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+torque+generation+by+the+actomyosin+cell+cortex+drives+left-right+symmetry+breaking%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking.</a> Elife. 3, e04165(2014).</li>
<li>Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+specification+of+the+embryonic+lineage+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).</li>
<li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cell+sorting+in+the+C.+elegans+embryo+defines+a+new+mechanism+for+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation.</a> Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).</li>
<li>Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lineaging+of+fluorescently-labeled+Caenorhabditis+elegans+embryos+with+StarryNite+and+AceTree%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).</li>
<li>Giurumescu, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).</li>
<li>Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan+defines+precise+spindle+orientation+by+modulating+Wnt+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans.</a> Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).</li>
<li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope%3A+variability+of+development+and+regional+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).</li>
</ol>

CP 实验室的研究工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，EXC 115；FOR 1756）和黑森州卓越计划（LOEWE）泛素网络研究集群资助。CP 还获得欧盟第七框架计划（Marie Curie Actions 项目 326632）的支持。

通过在发育过程中对物体（特别是细胞核）的追踪，已有可能阐明中心模式形成的机制 秀丽隐杆线虫 胚胎发生1,23,24将该策略扩展至更高通量，近期已有可能揭示更多模式形成规律，并提出一种推导模式形成规律的方法。 从头合成10然而，对于许多突变体而言，其精确的图式形成缺陷仍然未知。本文所述方法可成为阐明这些缺陷的重要工具。值得注意的是，近年来已逐渐明确，尽管许多其他模式系统并不遵循像 秀丽隐杆线虫，对象追踪及对定量追踪数据的分析是识别发育机制和疾病机制的关键工具。
本文所示方法特别适用于以下情况：实施更复杂和/或自行开发的软件解决方案过于困难，或实施商业软件工具成本过高的情形。重要的是，此处讨论的工具使研究人员能够独立加载和分析数据，而无需考虑数据是在何种仪器上记录的。此外，如果使用专有的图像采集软件，ImageJ 提供了 Bio-Formats 插件，可加载专有格式的数据并将其保存为标准格式（jpeg、tiff）。
所有依赖延时显微镜...

随着荧光蛋白、基因组编辑、光学显微镜以及计算机软硬件的持续进步，如今已能够以前所未有的时空分辨率记录多种模式生物的发育过程。这使得研究人员能够提出过去无法解答的科学问题，或重新审视已知的发育过程，以发现可能被忽视的方面。这一进展推动了定量发育生物学领域的发展，其目标是通过对发育过程进行系统测量和统计分析，将定性的、非正式的模型转化为定量模型。
对细胞和亚细胞结构的示踪使得建立胚胎发育、神经系统活动或细胞分裂的定量模型成为可能1-12。通过对秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎早期发育过程中细胞分裂残余物的追踪，我们最近发现这些残余物遵循一种模式化的路径，并作为重要的极性因子发挥作用13,14。
本文介绍了一些使非专业人士也能轻松开展定量发育生物学研究的实验方案。重点介绍三种简单易行且可免费获取的工具，这些工具可在任何具备常规共聚焦显微镜和计算机的实验室中实施。具体包括：生成三维细胞形态的方案、追踪细胞分裂残留物的方案，以及对皮层肌动球蛋白动力学进行定量描述的方案。以线虫 C. elegans 作为示例模型，但本文讨论的方法和工具同样适用于其他多种生物体系中的广泛问题，e.g. 培养细胞、组织外植体、类器官或球状体、其他胚胎等。
通常，此处展示的一些分析也可以使用流行的开源工具 ImageJ（http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html；或 FIJI，即包含完整功能套件的 ImageJ 版本，http://fiji.sc/Fiji）来完成，该工具拥有大量可用于不同定量分析的插件。然而，本文讨论的程序旨在解决特定问题。
首先，IMOD 是一个图像处理、建模与显示软件套件，可用于对电子显微镜或光学显微镜的连续切片进行三维重建15。IMOD 还包含可从任意方向查看三维数据的工具。其次，Endrov 是一个基于扩展插件架构设计的 Java 程序，用于执行图像分析、数据处理以及对网络或轨迹等进行标注，并兼容 ImageJ 插件16。该程序包含超过 140 种图像处理操作，以及一个可扩展的用户界面，可在其中分别显示模型数据和原始数据。其源代码可在 https://github.com/mahogny/Endrov 获取。第三，PIVlab 是一个用于数字粒子图像测速的 MATLAB 工具，允许用户对粒子流动场进行定性和定量分析17。使用该程序需要具备包含图像处理工具箱的 MATLAB 许可证（http://mathworks.com）。PIVlab 是一种用于定量描述流动的程序，可计算图像对或图像序列中的速度分布、速度大小、涡度、散度或剪切。为此，它通过对图像对中的小区域（在方案部分称为“pass”）进行互相关分析，以推导出最可能的粒子位移。该互相关运算生成一个相关矩阵，可在空间域或频率域中进行分析，分别采用直接互相关法或快速傅里叶变换（FFT）。
此处使用的设备为配备Nipkow（“旋转”）盘、EMCCD、488 nm和561 nm标准固态激光器，以及20倍空气镜、40倍或60倍平场/复消色差油浸或水浸物镜的倒置显微镜。然而，也可使用其他成像方式执行延时成像，例如，基于激光的点扫描、线扫描或片层扫描显微镜、多光子显微镜，以及结合去卷积或结构照明显微技术的落射荧光显微镜。使用Nipkow盘系统的优势在于极快的图像采集速度，尤其是在具备流式扫描模式（在z轴方向连续移动并扫描样本）的情况下。此外，为提高分辨率，可在EMCCD前使用1.5倍的放大延长镜。

<table><tbody><tr><td>体视显微镜</td><td>Motic/VWR</td><td>OT4005S</td><td>用于解剖和封片的体视显微镜</td></tr><tr><td>聚苯乙烯微球&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>18329</td><td>胚胎封片</td></tr><tr><td>20 &amp;micro;m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯微球&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>876</td><td>成年动物封片</td></tr><tr><td>0.1 &amp;micro;m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>631-0902</td><td>成年动物封片</td></tr><tr><td>盖玻片 18×18 mm</td><td>VWR</td><td>631-1331</td><td>胚胎/成年动物封片</td></tr><tr><td>盖玻片 24×60 mm</td><td>VWR</td><td>631-1339</td><td>胚胎封片</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>VWR</td><td>233-5455</td><td>胚胎解剖</td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>VWR</td><td>228-1501</td><td>口吸管用管路</td></tr><tr><td>30 mm 聚四氟乙烯（PTFE）膜过滤器</td><td>NeoLab</td><td>Jul-01</td><td>口吸管过滤装置</td></tr><tr><td>毛细管</td><td>VWR</td><td>621-0003</td><td>口吸管吸头</td></tr><tr><td>凡士林</td><td>Roth</td><td>E746.1</td><td>胚胎/成年动物封片</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Roth</td><td>5210.5</td><td>成年动物封片</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Roth</td><td>P018.2</td><td>M9 缓冲液</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Roth</td><td>P030.2</td><td>M9 缓冲液</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td>M9 缓冲液</td></tr><tr><td>VisiScope 转盘共聚焦成像系统</td><td>Visitron Systems</td><td>n/a</td><td>共聚焦显微镜</td></tr></tbody></table>

使用开源工具追踪和量化 c. elegans 的发育过程

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

定量捕捉发育过程对于建立机制模型以及识别和描述突变体表型至关重要。本文介绍了制备胚胎和成体的实验方案 秀丽隐杆线虫 用于短期和长期延时显微镜观察的动物模型，以及发育过程的追踪与定量分析方法。所介绍的方法均基于 秀丽隐杆线虫 来自秀丽隐杆线虫遗传学中心的菌株以及可在任何实验室独立于显微镜系统使用的开源软件。展示了使用建模软件 IMOD 重建三维细胞形态模型、利用多功能图像分析程序 Endrov 手动追踪荧光标记的亚细胞结构，以及使用 PIVlab（MATLAB 的时间分辨数字粒子图像测速工具）分析皮层收缩流的方法。文中讨论了这些方法如何也可用于定量捕捉不同模型中的其他发育过程。 例如， 细胞示踪与谱系追踪，囊泡流动的追踪

通过使用方案2、3和4，对野生型 C. elegans 成虫的性腺进行延时成像（菌株OD58 (unc-119(ed3) III; ltIs38[pAA1; pie-1::GFP::PH(PLC1delta1) + unc-119(+)]），该菌株表达来自生殖系启动子的膜标记物）。聚焦于性腺的弯曲区域，从显微镜数据生成生殖细胞的三维模型（图2）。该模型可用于分析细胞从远端向近端移动过程中细胞大小的变化，揭示合胞体轴丝（rachis）的组织结构以及单个细胞与轴丝接触区域的大小（另见 http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/germ%20line/Germframeset.html）。
接下来，使用方案1、3和5对秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎（菌株CHP52，该菌株是菌株RW10226（unc-119(ed3) III; itIs37[pie-1p::mCherry::H2B::pie-1 3'UTR + unc-119(+)]; stIs10226[his-72 p...

本文展示了如何追踪和量化 C. elegans 中的发育过程。所介绍的方法基于开源工具，可轻松实现。文中演示了如何重建三维细胞形态模型、如何手动追踪亚细胞结构，以及如何分析皮层收缩流。

使用开源工具追踪和量化 C. elegans 的发育过程

定量捕捉发育过程对于建立机制模型以及识别和描述突变体表型至关重要。此处……

使用图像分析软件与发育生物学的总体目标是为生物过程的机制模型获取定量数据。该方法有助于回答发育生物学中的关键问题，例如：如何对突变体表型进行定量分析？该方法的主要优势在于能够使研究人员以无偏倚的方式识别生物过程和发育现象中的改变。尽管该方法可用于研究海葵的发育与形态发生过程，但也适用于其他模式生物，例如乔氏丝蚓。细胞形态的三维重建操作将由我实验室的博士研究生西娜·勒曼（CINA Leman）演示。安装IM MOD程序后，打开阉人壳（eunuch shell），在IM mod窗口中输入Im mod。从包含原始数据的文件中选择合适的文件以生成三维模型，并利用信息窗口在zap窗口中定位物体的底部和顶部。在信息窗口中，再次描画细胞轮廓，于每个细胞的顶层面创建第一个轮廓，并注意为每个细胞创建一个新的对象。然后在Z轴方向向下滚动，为每个Z平面创建新的轮廓，并依次为每个细胞创建新的对象。在为模型勾画完适当数量的细胞后，打开模型视图窗口以检查对象及其轮廓。然后在模型视图工具栏中，选择编辑和对象。相应的编辑窗口将打开，用于将所有细胞建模为填充的闭合对象。选择网格作为绘制数据类型，填充作为绘图样式。单击网格化并勾选“封口”选项。然后根据需要勾选多个对象，再单击生成网格。程序将根据轮廓序列生成相应的实体对象。根据需要在视图窗口中调整Z轴比例，以改变Z轴采样因子。然后在编辑菜单下选择视图，旋转三维对象，并根据需要保存细胞的静态图像或视频，以追踪荧光延时记录中的目标物体。首先使用NDR将原始数据转换为TIFF文件。然后打开文件。在末端滴加。选择二维查看器图标，并在数据菜单下点击适应范围图标以调整直方图。选择文件、命名、图像、设置、通道，并设置 X、Y、Z 分辨率，输入 X、Y 和 Z 的数值。如需标注细胞核，请切换至目标层面，再次选择二维查看器，然后从下拉菜单中选择谱系，并选择新建谱系。单击并拖动目标细胞核以标记。然后在细胞核上单击右键，选择“重命名粒子”。在下拉菜单中输入粒子名称，然后拖动箭头图标以调整圆圈的直径。接下来，单击右侧图标以标记细胞核的中央平面。然后通过底部工具栏中的帧（frame）和 Z 选项前进至相应的时间点和层面，并相应调整标记细胞核的圆圈的位置或大小，直至被追踪的细胞发生分裂。当观察到细胞分裂时，标记子代细胞核，并单击窗口图标以切换至谱系模式。观察者同时标记三个细胞核，并在线系选项下选择关联父代。当所有细胞均被追踪后，点击文件名并切换至相应通道。标记细胞分裂残余物，以利用粒子图像速度对称性软件定量分析皮层流。在PIF实验室中加载新的图像文件，并选择测序方式：1、2、2、3。然后，导航至包含目标图像序列的目录。选择图像并单击“添加”以导入图像。然后在分析设置下，选择排除项、ROI 掩模，并使用该按钮。在分析设置下，为当前帧绘制掩膜，以屏蔽图像中不需要分析的部分。再次选择PIF设置，并选择快速傅里叶变换窗函数变形作为所需的PIF算法。在第一次处理中，输入64像素的 interrogation area（ interrogation 区域）值，步长为32像素，进行第二次处理。输入询问区域值为32像素，步长为16。然后从窗口变形下拉菜单中选择线性，并选择高斯2×3点法进行亚像素位移估计。接着从分析菜单中选择分析，并选择分析所有帧的后处理；从后处理菜单中选择矢量验证，并从绘图菜单中对所有帧应用标准差滤波阈值为7。选择衍生参数。修改数据，随后调整矢量、每帧像素，并调节矢量平滑度和高通滤波器。在将这些调整应用于所有帧后，将使用的帧数设置为1以结束。最后，点击“计算平均向量”按钮，以测量所有图像帧的平均向量，重点关注如上所述成像的野生型秀丽隐杆线虫成虫性腺转弯区域。通过显微镜数据生成生殖细胞的三维模型，从而分析细胞从远端向近端输卵管移动过程中细胞大小的变化，该分析基于双色延时显微成像。利用线粒体组蛋白融合蛋白和非肌肉肌球蛋白在NDR中的标记所获得的模型，展示了细胞分裂残余物遗传的典型模式。此外，根据该实验中的谱系数据，可以获得每个细胞L、细胞分裂残余物的运动轨迹，以及其与细胞分裂时间的相关性。通过高时间分辨率的短期延时显微镜观察皮层非肌球蛋白II，以评估野生型胚胎与rga-3（编码RhoGTP酶激活蛋白的基因）缺失胚胎之间皮层极化流动动力学的差异，结果符合预期。在野生型胚胎中，流动主要沿胚胎的长轴方向进行。在RGA三重RNA干扰胚胎中，流动方向与该轴垂直，这一点从PIP分析中可以明显看出。一旦掌握了手动分割复杂物体和胚胎发育过程中的细胞追踪技术，若操作得当，可在数小时内完成细胞与物体的追踪。在尝试进行细胞和物体追踪时，重要的是要记住设置适当的时间分辨率，以免在使用此处所述三种工具进行分析时丢失目标物体。还可以进行统计学分析，以回答有关变异性的各种问题，或仅用于比较不同的胚胎。采用定量图像分析软件，使我们以及与我们类似的发育生物学家能够以前所未有的精细程度探索发育过程中的形态发生机制。观看本视频后，您应能充分理解如何使用多种软件工具进行定量图像分析。

tracking-quantifying-developmental-processes-c-elegans-using-open

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

跟踪和量化的发育过程<em&gt;℃。线虫</em&gt;使用开源工具

C. elegans 胚胎是研究细胞生物学和发育过程的有力体系。本文介绍一种利用常见的落射荧光显微镜和开源软件，通过微分干涉差（DIC）光学或荧光技术对 C. elegans...

使用落射荧光显微镜和开源软件对秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎进行成像

我们开发了一种视频速率追踪显微镜系统，能够以高分辨率和高速度记录并量化秀丽隐杆线虫（C.

C. elegans 追踪与行为学测量

本视频介绍了使用视频和追踪软件在实验区域内记录线虫运动的方法。...

C. elegans 运动追踪：一种评估线虫运动能力的方法

本文介绍了一种半自动化的微电液芯片方法，可按需诱导Caenorhabditis...

基于微流控的电趋性用于按需定量分析 秀丽隐杆线虫运动

蛋白质聚集体的朊病毒样传播最近被发现与多种神经退行性疾病相关。本实验方案的目的是介绍如何利用线虫 C. elegans...

利用多细胞模式生物 C. elegans 研究类朊病毒蛋白的扩散与毒性

本文介绍了一个将大范围饮食限制与基因表达及寿命关联起来的研究框架。我们描述了实施大范围饮食限制的实验方案，以及在此条件下对基因表达进行定量成像的技术流程。此外，我们还概述了用于揭示参与食物感知的遗传回路中潜在信息处理特征的计算分析方法。...

在 C. elegans 中通过基因表达水平编码的信息量化：广泛范围饮食限制下寿命调控过程中的研究

我们介绍了使用宽视场线虫追踪平台（WF-NTP）的实验方案，该平台可实现对大量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

大型动物自动化行为分析 秀丽隐杆线虫 使用宽视野追踪平台的群体研究

本文介绍了一种组合方法，结合高分辨率显微镜、计算工具以及活体秀丽线虫（C.

亚细胞分辨率下利用各向同性光片显微镜与自动化细胞谱系分析记录秀丽隐杆线虫胚胎发育

本研究描述了一种半高通量实验方案，可在一次过夜实验中同时对80–100个C.

一种用于分析的半高通量成像方法与数据可视化工具包 秀丽隐杆线虫 胚胎发育

本文介绍了一种制备和固定秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

4D显微技术：揭示 秀丽隐杆线虫 使用微分干涉差显微镜观察胚胎发育

本研究介绍了两种用于分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）复合体 I 疾病 gas-1(fc21) 蚓体运动活性的半自动化方法，分别为 ZebraLab（中通量检测）和...

动物活动量测定实验方法的比较分析 秀丽隐杆线虫 线粒体疾病模型

了解如何使用开源工具跟踪和量化秀丽隐杆线虫的发育过程。本方法涵盖三维细胞形状重建、亚细胞结构手动追踪及皮质收缩流分析，为发育生物学研究提供定量数据支持。

使用开源工具追踪和量化 C. elegans 的发育过程

探索更多视频