利用骨髓来源巨噬细胞研究巨噬细胞极化

为进行极化分析，制备骨髓来源的巨噬细胞。从小鼠中分离股骨和胫骨，收集骨髓细胞。随后将细胞在含有生长因子的培养基中培养，以诱导巨噬细胞的形成。

培养七天后，对骨髓来源的巨噬细胞施加不同的刺激以诱导其极化为巨噬细胞。通过流式细胞术、实时PCR和Western blot分析检测活化反应，结果表明骨髓来源的巨噬细胞纯度较高，并可被极化为M1或M2型，产生相应的活化反应。刺激因素如下。

该技术的意义在于其可用于治疗或诊断多种相关疾病，包括胰岛素抵抗和慢性炎症性疾病，因为浸润性T细胞巨噬细胞在这些病理过程中发挥着关键作用。本方法的可视化演示至关重要，因为骨髓细胞的加速分离具有一定难度，且细胞得率对于获得足够数量的细胞以诱导巨噬细胞形成尤为关键。在无菌操作台中开始本方案，使用组织培养皿收集6至8周龄小鼠的股骨和胫骨。用PBS冲洗骨骼，然后使用剪刀小心剪开骨骼两端，操作时用镊子夹住骨骼，注意不要切除过多骨段。

将装有含2%热灭活FBS的冷PBS的10毫升注射器连接21号或23号针头，插入骨的一端。推动针栓，将骨髓冲入新的组织培养皿中。随后，将骨髓通过同一针头反复吹打4至6次，以解离细胞。

然后将细胞倒入70微米细胞筛中，以去除细胞团块、骨组织、毛发及其他细胞或组织。用50毫升锥形管收集滤过液。待溶液完全通过滤器后，在滤过液中加入三倍体积的0.8%氯化铵，并在冰上孵育10分钟。

孵育结束后，于4°C条件下以500 × g离心5分钟，以去除红细胞。离心后，将细胞沉淀重悬于20至50毫升含2% FBS的冷PBS中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。

在4°C条件下，以500 × g离心5分钟。倒去上清液后，按照本方案下一节所述方法诱导BMDM的形成。为诱导BMDM形成，将分离得到的骨髓细胞重悬于BMDM生长培养基中，浓度为2×。

将每毫升含1×10⁶至2×10⁶个细胞的悬液接种到6孔或12孔组织培养板的每个孔中，每孔接种6个细胞，并在37°C条件下培养细胞。以该浓度接种将有助于在三天后进行流式细胞术分析时细胞的脱落。在第7天更换为新鲜的BMDM生长培养基。

通过流式细胞术分析及荧光标记的抗体检测表达 CD11b 和 F4/80 的细胞，以评估成熟 BMDM 的形成。在确认成熟 BMDM 形成后，更换为新鲜的含 10% FBS 的 IMDM 培养基，并加入 LPS 或 LPS 与干扰素-γ 以诱导 M1 型活化，或加入 IL-4 或 IL-13 以诱导 M2 型活化。将细胞在 37°C 条件下孵育 24 小时。

通过将刺激后的bMDM从培养皿上分离来收集细胞。操作时，先移除细胞培养基，并用不含钙和镁的PBS洗涤。随后加入预热的含0.48毫摩尔EDTA的0.05%胰蛋白酶，于37°C孵育不超过10分钟，以避免因消化过度导致表面蛋白丢失。

然后用含10% FBS的PBS洗涤细胞两次，并将其转移至1.2毫升样品管中。在不同时间点使用抗体检测细胞表面抗原的表达，包括CD11b、F4/80、CD11c、CD206、CD69、CD80或CD86。采用标准的流式细胞术染色程序结合定量PCR进行检测。

检测 IL-1β、TNF-α 和 IL-6 的表达水平以评估 M1 型活化，或检测 IL-10、IL-13、精氨酸酶-1 和 PPARγ 的表达水平以评估 M2 型活化。最后进行蛋白质印迹实验，检测参与 M1 或 M2 巨噬细胞活化的细胞信号通路的激活情况，以评估成熟 BMDM 的纯度。诱导后，采用针对 CD11b、F4/80、CD11c 和 CD206 的抗体进行流式细胞术分析。BMDM 首先根据 FSC 和 SSC 设门，以排除碎片和聚集体。

成熟的骨髓来源巨噬细胞（MDMs）被定义为CD11b阳性、F4/80阳性的亚群，该亚群位于此图的右上象限，占设门细胞群体的95%至99%，用于评估巨噬细胞的极化状态。随后进行进一步分析。首先设门以鉴定组织浸润的巨噬细胞，即CD11b阳性、F4/80阳性的细胞。

在这些M1型巨噬细胞中，CD11C阳性且CD206阴性的细胞出现在第二象限，而M2型巨噬细胞（CD11C阴性且CD206阳性）则出现在第四象限。为评估巨噬细胞的活化状态，细胞分别与LPS共同孵育以诱导M1型活化，或与IL-4孵育以诱导M2型活化。活化后，巨噬细胞的体积增大，表现为刺激后24小时M1或M2巨噬细胞的FSC-A值相较于未处理的M0巨噬细胞发生前移。

刺激后还分析了与巨噬细胞活化相关的表面标志物。早期应答标志物 CD 69 在刺激后 5 小时或 24 小时进行评估，而 CD 80 和 CD 86 标志物则在刺激后 48 小时分析。如图所示，经刺激的巨噬细胞中表面 CD 69、CD 80 和 CD 86 的表达量增加，用于评估巨噬细胞的经典活化和替代活化状态。

经 LPS 或 IL-4 刺激 24 小时后收集细胞，并提取总 RNA，用于此处所示的定量实时 PCR 分析。与未处理的巨噬细胞相比，M2 巨噬细胞中精氨酸酶 1 和 PPARγ 的表达升高。促炎细胞因子白细胞介素 1β 和 TNFα 在 M1 巨噬细胞中增加，为评估 LPS 诱导的 NF-κB 通路激活，采用针对 P65 及磷酸化 P65 的抗体进行 Western 印迹分析，结果如图所示。

经LPS处理后，可见针对磷酸化P65的条带更强。综上所述，这些数据表明，骨髓来源的巨噬细胞对M1或M2刺激物具有极化激活反应。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备骨髓来源的巨噬细胞，并进行极化激活分析。

在进行该实验操作时，重要的是要记住，在检测巨噬细胞反应之前，需先评估所分化巨噬细胞的纯度。完成该操作后，可进一步开展诸如基因瞬时转染或SHRA等方法，以回答更多问题，例如：基因如何参与调控巨噬细胞的活化？