使用骨髓源性巨噬细胞巨噬细胞极化的调查

生成用于极化分析的骨髓衍生巨噬细胞。从小鼠中分离股骨和胫骨，并收集骨髓细胞。然后将细胞在含有生长因子的培养基中培养以诱导巨噬细胞形成。

培养 7 天后，用各种刺激和极化巨噬细胞处理骨髓衍生的巨噬细胞。通过流式细胞术实时 PCR 分析活化反应，并获得 western blos 分析结果，显示高纯度的骨髓来源巨噬细胞对 M1 或 M 2 具有极化活化反应。刺激撒谎。

该技术的含义是针对多种相关疾病的治疗或诊断，包括胰岛素抵抗和 CRO，因为 T 浸润巨噬细胞在这种情况下是主要参与者，这种方法的视觉演示至关重要，因为骨髓细胞的加速有些困难，并且产量对于获得足够的研究细胞制备以诱导巨噬细胞形成至关重要在无菌罩中工作。从组织培养皿中从 6 至 8 周龄小鼠中分离的股骨和胫骨开始此方案。在 PBS 中冲洗骨头，然后用剪刀切开骨头的两端，用镊子夹住骨头时注意不要去除太多。

将 21 对 23 号针头插入骨头的一端，该针头装有 10 毫升冷 PBS，含有 2% 加热活化的 FBS。按下柱塞，将骨髓冲洗到新的组织培养皿中。接下来，将骨髓穿过同一根针头四到六次以解离细胞。

然后将细胞倒入 70 微米细胞过滤器中，以去除细胞团块、骨骼、头发和其他细胞或组织。将流出物收集在 50 mL 锥形管中。溶液通过过滤器后，向流通液中加入 3 体积的 0.8% 氯化铵，并在冰上孵育 10 分钟。

要在孵育后去除红细胞，请在 4 摄氏度下以 500 倍 G 的速度离心细胞 5 分钟。离心后，将细胞沉淀重新悬浮在 20 至 50 毫升含 2% FBS 的冷 PBS 中。使用血细胞计数器对细胞进行计数。

在 4 摄氏度下以 500 倍 G 离心细胞 5 分钟。倒出旋后。按照方案下一节所述继续诱导 BMDM 形成 为了诱导 BMDM 形成 Resus，将分离的骨髓细胞以两倍的浓度悬浮在 BMDM 生长培养基中。

将每毫升种子的 6 个细胞居中 1 到 2 乘以 10 到 6 或 12 孔组织培养板的每个孔中的 6 个细胞，并在 37 摄氏度下孵育细胞。以该浓度接种将有助于三天后分离以进行流式细胞术。第七天更换为新鲜的 BMDM 生长培养基。

使用流式细胞术分析和氟偶联抗体评估成熟 BMDM 的形成，以检测表达 CD 11 B 和 F 4 80 的细胞。在验证成熟 BMDM 的形成后，改用新鲜的 cove 改良的 do echo 培养基，其中含有 10% FBS 和 LPS 或 LPS 和干扰素 γ（用于 M1 激活）或 IL 4 或 IL 13（用于 M 2 激活）。24 小时后，在 37 摄氏度下孵育细胞。

通过将刺激的 b MDM 从培养皿中取出来收集它们。为此，请从细胞中取出培养基，并用不含钙或镁的 PBS 洗涤。然后加入含有 0.48 毫摩尔的温热 0.05% 胰蛋白酶，EDTA 在 37 摄氏度下孵育不超过 10 分钟，以避免因过度消化而导致表面蛋白损失。

然后用含有 10% FBS 的 PBS 洗涤细胞两次，并将其转移到 1.2 毫升样品管中。使用抗体检测不同时间点细胞表面抗原的表达，包括 CD 11、BF、4、80、CD 11、C、CD 2、0、6、CD 69、CD 80 或 CD 86。使用使用定量 PCR 的标准流式细胞术染色程序。

确定 IL 1、β、TNF、α 和 IL 6 的表达水平以评估 M1 激活，或 IL 10、IL 13、精氨酸酶 1 和 PPAR γ 的表达水平以评估 M 2 激活。最后，进行蛋白质印迹以评估参与 M1 或 M 两个巨噬细胞激活的细胞信号通路的激活，以评估成熟 BMDM 的纯度。诱导流式细胞术分析后，使用抗 CD 11 BF、4 个、80、CD 11 C 和 CD 2、0、6 B.MDM 首先在 FSC 和 SSC 上设门以去除 DRI 和偶联物。

成熟 b MDM 被定义为 CD 11 B 阳性 F 四个 80 阳性亚群，见于该图的右上方，并损害了 95% 至 99% 的门控群体以评估巨噬细胞极化。进行了进一步的分析。首先进行设门以识别组织浸润的巨噬细胞，即 CD 11 B 阳性 F 4 个 80 阳性细胞。

在这些 M1 巨噬细胞中，CD 11 C 阳性和 CD 2 0 6 阴性出现在第二象限，而 M 两个巨噬细胞，即 CD 11 C 阴性和 CD 2 0 6 阳性出现在第四象限。为了评估巨噬细胞活化，将细胞与 LPS 一起孵育以诱导 M1 活化或 IL 4 以激活 M 2。激活后，巨噬细胞的大小增加，与未处理的 M zero 相比，刺激后 24 小时 M1 或 M 两个巨噬细胞的 FSCA 发生变化证明了这一点。

刺激后还分析了巨噬细胞活化相关的表面标志物。刺激后 5 小时或 24 小时评估早期反应标志物 CD 69，在刺激后 48 小时分析 CD 80 和 CD 86 标志物。如图所示，在受刺激的巨噬细胞中观察到表面 CD 69、CD 80 和 CD 86 的丰度增加，以评估巨噬细胞的经典和替代激活。

收集用 LPS 或 IL 4 刺激 24 小时的那些，并提取总 RNA 通过定量实时 PCR 进行分析，如图所示。与未经处理的促炎细胞因子的巨噬细胞表达相比，在 M 2 巨噬细胞中检测到精氨酸酶 1 和 PPAR γ 表达升高。白细胞介素一 β TNF α 在 M1 巨噬细胞中增加，以评估针对 P 65 和磷酸化相关 P 65 的 LPS 抗体对 NF kappa B 通路的激活，如下所示。

采用 LPS 处理后，可以看到针对磷酸化 P 65 的更强条带。总之，这些数据表明骨髓来源的巨噬细胞对 M1 或 M 两种刺激具有极化激活反应。看完这个视频，你应该对如何生成骨髓来源的巨噬细胞有一个很好的了解，然后进行极化激活分析。

在尝试此程序时，重要的是要记住在测试其反应之前评估分化巨噬细胞的纯度。按照此程序，可以执行基因瞬时转染或 SHRA 等方法，以回答其他问题，例如，基因如何参与调节巨噬细胞活化？