Name: 使用骨髓源性巨噬细胞巨噬细胞极化的调查 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学习使用小鼠骨髓来源巨噬细胞建立体外极化模型，通过流式细胞术和实时PCR分析M1/M2表型激活反应。该方法为研究免疫应答和开发相关疾病治疗策略提供可靠工具。

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本工作由美国心脏协会资助（资助号 BGIA 7850037，授予周 Beiyan 博士）。

1. 骨髓细胞的分离
<ol>
	<li>取6-8周龄小鼠的股骨和胫骨，冲洗去毛后切开骨组织。</li>
	<li>使用21G针头和10 ml注射器，用预冷的含2%热灭活胎牛血清（FBS）的PBS冲洗骨髓（每只小鼠3-5 ml）。</li>
	<li>将骨髓细胞通过21G针头反复吹打4-6次，以充分分散细胞。</li>
	<li>将细胞悬液通过70 μm细胞滤网，去除细胞团块、骨碎片、毛发及其他组织成分。</li>
	<li>加入3倍体积的NH4Cl溶液（0.8% NH4Cl溶液，Stemcell Technology），冰上孵育10分钟，以去除红细胞。</li>
	<li>在4 °C下以500 x g离心5分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>用冷PBS+2%FBS重悬细胞沉淀（体积为20-50 ml，根据细胞数量调整）。</li>
</ol>
2. 诱导BMDM形成
<ol>
	<li>用BMDM生长培养基重悬分离的骨髓细胞（2×106 个细胞/mL）。</li>
</ol>
BMDM 生长培养基：
Iscove 改良的 Dulbecco 培养基（IMDM）+ 10% 胎牛血清（FBS）+ 15% 过滤（0.2 μm）的 L-929 细胞（ATCC, CCL-1）培养上清液（含单核细胞集落刺激因子，M-CSF）或 10 ng/ml M-CSF。
注意： L-929 细胞上清液含有 M-CSF18。为确保条件培养基的有效活性，将 5 × 105 个 L-929 细胞接种于 T75 cm2 培养瓶中，培养 6–7 天后收集培养上清，经 0.45 μm 滤器过滤后使用。分装的培养基可立即使用，或于 -80 °C 保存 1–2 个月。
<ol start="2">
	<li>将细胞接种于6孔或12孔组织培养板中（根据实验设计而定）（Corning Costar）。</li>
	<li>第3天更换新鲜的BMDM生长培养基。</li>
	<li>第7天，通过流式细胞术分析评估成熟BMDM的形成，并使用荧光素标记的抗体检测表达CD11b和F4/80的细胞。</li>
</ol>
3. BMDM 极化激活
<ol>
	<li>第7天更换为新鲜的刺激培养基：对于M1活化，使用含有10% FBS以及100 ng/ml LPS，或100 ng/ml LPS联合50 ng/ml IFNγ的IMDM；对于M2活化，使用含有10% FBS以及10 ng/ml IL-4和/或10 ng/ml IL-13的IMDM。</li>
	<li>通过使用温热的0.05%胰蛋白酶将刺激后的BMDM从培养皿上解离下来，随后用含10% FBS的PBS洗涤细胞两次。</li>
</ol>
注意： 分化完成后，为解离并重悬成熟的巨噬细胞，可使用含0.48 mM EDTA的0.05%胰蛋白酶溶液（Invitrogen）或无钙、无镁的PBS或Hank's平衡盐溶液（HBSS）中含2–5 mM EDTA的溶液。若使用含胰蛋白酶的消化液，细胞在37 °C处理时间应少于10分钟，以避免因过度消化导致表面蛋白丢失。
<ol start="3">
	<li>使用抗体通过标准流式细胞术染色程序，在不同时间点检测细胞表面抗原（包括 CD11b、F4/80、CD11c、CD206、CD69、CD80 或 CD86）的表达。</li>
	<li>采用 qRT-PCR 检测活化的 M1 和 M2 巨噬细胞特征性基因的表达，如 IL-1β、TNF-α 和 IL-6（M1 活化）或 IL-10、IL-13、arginase1 和 PPARγ（M2 活化）。通过 Western 印迹分析检测参与 M1 或 M2 巨噬细胞活化的细胞信号通路的激活情况。</li>
</ol>

<ol><li>Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microrna+circuitry+links+macrophage+polarization+to+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis.</a> Circulation. , (2012).</li>
<li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+induces+a+phenotypic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).</li>
<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+death+and+defective+inflammation+resolution+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).</li>
<li>Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-specific+pparg+controls+alternative+activation+and+improves+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance.</a> Nature. 447, 1116-1120 (2007).</li>
<li>Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+m2+activation+of+kupffer+cells+by+ppard+ameliorates+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance.</a> Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).</li>
<li>Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+metabolism+and+pgc-1%5Bbeta%5D+attenuate+macrophage-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation.</a> Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).</li>
<li>Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ikk-b+links+inflammation+to+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance.</a> Nat. Med. 11, 191-198 (2005).</li>
<li>Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cell-specific+deletion+of+toll-like+receptor+4+ameliorates+hepatic+and+adipose+tissue+insulin+resistance+in+high-fat-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice.</a> Cell Metab. 10, 419-429 (2009).</li>
<li>Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-derived+th2+cytokines+and+myeloid+ppard+regulate+macrophage+polarization+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity.</a> Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).</li>
<li>Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pparg+activation+primes+human+monocytes+into+alternative+m2+macrophages+with+anti-inflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties.</a> Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).</li>
<li>Bronte, V., Zanovello, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immune+responses+by+l-arginine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of immune responses by l-arginine metabolism.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).</li>
<li>Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+regulator+of+macrophage+activation%3A+Mir-223+in+obesity-associated+adipose+tissue+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation.</a> Circulation. 125, 2892-2903 (2012).</li>
<li>Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+and+ultrastructural+analysis+of+alveolar+macrophage+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation.</a> J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).</li>
<li>Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+4+potently+enhances+murine+macrophage+mannose+receptor+activity%3A+A+marker+of+alternative+immunologic+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation.</a> J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).</li>
<li>Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+murine+mononuclear+phagocyte+inflammatory+products+by+macrophage+colony-stimulating+factor.+Lack+of+il-1+and+prostaglandin+e2+production+and+generation+of+a+specific+il-1+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor.</a> J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).</li>
<li>Biswas, S. K., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+interaction+with+lymphocyte+subsets%3A+Cancer+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm.</a> Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+In+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

我们在此报告一种简单且易于调整的方法 体外 诱导骨髓来源前体细胞分化获得的巨噬细胞活化的操作步骤。该方法可用于研究巨噬细胞极化相关机制。采用本方案获得的成熟巨噬细胞纯度平均为95%至99%，无需额外的纯化步骤。为研究特定目的基因在巨噬细胞极化过程中的功能，可在细胞培养第7天转染后进行外源性基因表达或基因特异性敲低。本方案还提供了为期7天的培养窗口，可用于研究某些因素或基因对巨噬细胞形成、成熟及表型的影响。
活化的巨噬细胞在不同刺激下表现出复杂的细胞和分子特征，并具有高度可塑性3, 9, 19。例如，脂多糖（LPS）可诱导强烈的促炎性M1型反应，该反应在干扰素γ（IFNγ）或肿瘤坏死因子（TNF）存在时可进一步增强；而白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-13（IL-13）均可刺激M2型活化；然而，这些活化特征并不完全重叠3, 4, 9, 15, 19, 20。本实验方案中呈现的结果仅代表通过流式细胞术、定量RT-PCR和蛋白质印迹法分析骨髓来源巨噬细胞的典型实验结果。与巨噬细胞活化相关的表面抗原表达及细胞信号通路在巨噬...

与经典的炎症反应不同，浸润组织的巨噬细胞通常表现出极化的活化状态，在调控宿主组织生理功能中发挥关键作用1-8。在受到刺激后，巨噬细胞的活化可分为经典活化（M1）和替代性活化（M2）2, 4, 9。M1型巨噬细胞的活化依赖于Toll样受体（TLRs）以及核因子κB（NFκB）/c-Jun氨基末端激酶1（JNK1）的激活，从而促进炎症性细胞因子（如TNF-α和IL-1β）的产生，并激活诱导型一氧化氮合酶（iNOS），导致活性氧物质（如一氧化氮，NO）的生成增加10, 11。相比之下，M2型巨噬细胞的活化则涉及PPARγ、PPARδ或IL-4-STAT6信号通路，引发具有抗炎特性的替代性活化（M2），其特征是甘露糖受体CD206和精氨酸酶1（Arg1）的表达上调6, 12-14。
骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）是一种理想的 体外 用于理解调控活化巨噬细胞极化机制的模型15具体而言，M1型巨噬细胞的活化可通过脂多糖（LPS）刺激诱导，而M2型巨噬细胞的极化则可由IL-4和/或IL-13诱导。成熟的骨髓来源巨噬细胞及活化的巨噬细胞可通过流式细胞术检测其表面抗原（如CD11b、F4/80、CD11c、CD206、CD69、CD80和CD86）的表达来进行鉴定。9, 16, 17此外，可通过定量RT-PCR和Western印迹分别检测与巨噬细胞极化相关的细胞因子产生变化及细胞信号通路的变化。总之，小鼠骨髓来源的巨噬细胞可作为研究巨噬细胞极化的相关模型 体外

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30259.01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>StemCell Technologies</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>L-929</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>10 x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>AP-9009-10</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11b-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 F4/80-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD69-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0691-81</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD86-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0862-81</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr></tbody></table>

利用骨髓来源巨噬细胞研究巨噬细胞极化

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

本文描述了一种简便且易于调整的体外模型，用于研究巨噬细胞极化。在GM-CSF/M-CSF存在条件下，骨髓来源的造血干细胞/祖细胞被诱导向单核细胞分化，随后经M1或M2刺激。细胞的活化状态可通过细胞表面抗原、基因表达以及细胞信号通路的变化进行追踪。

骨髓来源巨噬细胞（BMDM）制备流程的示意图如（图1）所示。在第7天可观察到成熟巨噬细胞的高纯度，此时它们占CD11b+F4/80+细胞的95%至99%（图2）。可通过使用抗CD11b、F4/80、CD11c和CD206抗体进行流式细胞术分析，以检测极化巨噬细胞。如（图3）所示，M1型巨噬细胞表现为CD11b+F4/80+CD11c+CD206-细胞（Q2区），而M2型巨噬细胞为CD11b+F4/80+CD11c-CD206+细胞（Q4区）。BMDM的活化状态可通过细胞体积增大（图4A，FSC-A向右偏移）以及巨噬细胞表面活化标志物CD69、CD80或CD86表达水平升高（设门：CD11b+F4/80+）来确认，如（图4B）所示。M1或M2型巨噬细胞中的细胞因子分泌、基因表达及细胞信号通路活化情况，可通过定量RT-PCR或蛋白质印迹法（western blotting）进行评估。如（图5）所示，在10 ng/ml IL-4刺激下，M2型...

本文描述了一种简便易行的自适应方法 体外 用于研究巨噬细胞极化的模型。在存在GM-CSF/M-CSF的条件下，骨髓来源的造血干细胞/祖细胞被诱导向单核细胞分化，随后接受M1或M2极化刺激。细胞的活化状态可通过细胞表面抗原的变化、基因表达以及细胞信号通路的变化进行追踪。

本文描述了一种简便易行的体外自适应模型，用于研究巨噬细胞极化。在存在GM-CSF/M-CSF的情况下，造血……

为进行极化分析而制备骨髓来源的巨噬细胞。从小鼠中分离股骨和胫骨，收集骨髓细胞。随后将细胞在含有生长因子的培养基中培养，以诱导巨噬细胞的形成。培养七天后，对骨髓来源的巨噬细胞施加不同的刺激物以诱导其极化为巨噬细胞。通过流式细胞术、实时 PCR 和 Western blot 分析检测活化反应，获得的结果显示骨髓来源的巨噬细胞纯度较高，并对 M1 或 M2 刺激物均表现出极化的活化反应。刺激物如下。该技术的应用意义在于其对多种相关疾病（包括胰岛素抵抗和耐药菌感染）的治疗或诊断具有潜在价值，因为组织浸润的T细胞巨噬细胞在这些疾病中起着关键作用。该方法的可视化演示至关重要，因为骨髓细胞的加速分离具有一定难度，且细胞得率对于获得足够数量的细胞以诱导巨噬细胞形成尤为关键。在无菌操作台中开始本实验流程，将6至8周龄小鼠的股骨和胫骨从组织培养皿中取出。用PBS冲洗骨骼，然后用剪刀剪开骨骼两端，操作时用镊子夹住骨骼，注意不要切除过多组织。将装有含2%热灭活FBS的冷PBS的10毫升注射器连接21号或23号针头，插入骨的一端。推动针栓，将骨髓冲入新的组织培养皿中。随后，将骨髓通过同一针头反复吹打4至6次，以解离细胞。然后将细胞倒入70微米细胞滤筛中，以去除细胞团块、骨组织、毛发及其他细胞或组织。用50毫升锥形管收集滤过液。待溶液完全滤过后，向滤过液中加入三倍体积的0.8%氯化铵，冰上孵育10分钟。孵育后，为去除红细胞，将细胞在4°C下以500 × g离心5分钟。离心后，用20至50毫升含2% FBS的冷PBS重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板对细胞进行计数。在4°C条件下，以500 × g离心5分钟，使细胞沉淀。倒去上清液后，按照本方案下一节所述方法诱导BMDM形成。为诱导BMDM形成，将分离得到的骨髓细胞重悬于BMDM生长培养基中，浓度为2 ×。在六孔或十二孔组织培养板的每个孔中，接种浓度为每毫升1×10⁶至2×10⁶个细胞，每孔接种六细胞/毫升。将细胞在37°C条件下培养。此接种浓度有助于在三天后进行流式细胞术前的细胞脱落。在第7天更换为新鲜的BMDM生长培养基。通过流式细胞术分析及荧光标记的抗体检测表达 CD11b 和 F4/80 的细胞，以评估成熟 BMDM 的形成。在确认成熟 BMDM 形成后，更换为新鲜的 IMDM 培养基（含 10% FBS），并加入 LPS 或 LPS 与干扰素-γ 以诱导 M1 型活化，或加入 IL-4 或 IL-13 以诱导 M2 型活化。将细胞在 37 摄氏度下孵育 24 小时。通过将刺激后的bMDMs从培养皿上解离来收集细胞。操作时，先移除细胞培养液，并用不含钙和镁的PBS洗涤。随后加入含0.48毫摩尔EDTA的预热0.05%胰蛋白酶，在37摄氏度孵育不超过10分钟，以避免因消化过度导致表面蛋白丢失。然后用含有10% FBS的PBS洗涤细胞两次，并将细胞转移至1.2毫升样品管中。在不同时间点使用抗体检测细胞表面抗原的表达，包括CD11b、F4/80、CD11c、CD206、CD69、CD80和CD86。采用标准流式细胞术染色程序结合定量PCR进行检测。通过检测 IL-1β、TNF-α 和 IL-6 的表达水平以评估 M1 型活化，或检测 IL-10、IL-13、精氨酸酶-1 和 PPAR-γ 的表达水平以评估 M2 型活化。最后进行 Western 印迹分析，以检测参与 M1 或 M2 型巨噬细胞活化的细胞信号通路的激活情况，从而评估成熟 BMDM 的纯度。诱导分化完成后，采用针对 CD11b、F4/80、CD11c 和 CD206 的抗体进行流式细胞术分析。BMDM 首先根据 FSC 和 SSC 进行设门，以排除碎片和聚集体。成熟的骨髓来源的巨噬细胞（MDMs）被定义为 CD11b 阳性、F4/80 阳性的亚群，该亚群位于该图右上象限，占设门后群体的 95% 至 99%，用于评估巨噬细胞的极化状态。随后进行进一步分析。首先设门以鉴定组织浸润的巨噬细胞，即 CD11b 阳性、F4/80 阳性的细胞。在这些M1型巨噬细胞中，CD11c阳性且CD206阴性的细胞出现在第二象限，而M2型巨噬细胞（CD11c阴性且CD206阳性）则出现在第四象限。为评估巨噬细胞的活化状态，细胞分别与LPS共同孵育以诱导M1型活化，或与IL-4孵育以诱导M2型活化。活化后，巨噬细胞的体积增大，表现为刺激后24小时M1或M2巨噬细胞的FSC-A值相较于未处理的M0巨噬细胞发生前移。刺激后还分析了与巨噬细胞活化相关的表面标志物。在刺激后5小时或24小时检测早期应答标志物CD69，而在刺激后48小时检测CD80和CD86标志物。如图所示，刺激后的巨噬细胞表面CD69、CD80和CD86的表达量增加，用于评估巨噬细胞的经典活化和替代性活化。用 LPS 或 IL-4 刺激 24 小时的细胞被收集，并提取总 RNA，用于定量实时 PCR 分析，结果如图所示。与未处理的巨噬细胞相比，M2 巨噬细胞中精氨酸酶 1 和 PPARγ 的表达升高。促炎性细胞因子白介素 1β 和 TNFα 在 M1 巨噬细胞中表达增加。为评估 LPS 诱导的 NF-κB 通路激活，采用针对 P65 和磷酸化 P65 的抗体进行 Western 印迹分析，结果如图所示。经LPS处理后，可见针对磷酸化P65的条带更强。综上所述，这些数据表明骨髓来源的巨噬细胞对M1或M2刺激物具有极化激活反应。观看本视频后，您应能充分理解如何制备骨髓来源的巨噬细胞，并进行极化激活分析。在进行该实验操作时，重要的是要记住，在检测巨噬细胞反应之前，需先评估已分化巨噬细胞的纯度。完成该操作后，可进一步采用基因瞬时转染或SHRA等方法，以回答其他问题，例如：基因如何参与调控巨噬细胞的活化？

investigation-macrophage-polarization-using-bone-marrow-derived

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用骨髓源性巨噬细胞巨噬细胞极化的调查

巨噬细胞在多种组织的稳态和病理过程中发挥核心作用。本文介绍的方法包括在体内耗竭巨噬细胞、从小鼠骨髓穿刺物中诱导极化巨噬细胞，以及将巨噬细胞过继转移至小鼠体内。这些技术有助于明确极化巨噬细胞在健康与疾病中的作用。...

小鼠巨噬细胞的耗竭与重建

在本视频中，我们演示了一种诱导外周血来源的单核细胞分化并极化为M1或M2型巨噬细胞的方法。使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、脂多糖和干扰素-γ孵育可获得促炎性的M1型巨噬细胞，而使用巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4孵育则可诱导产生抗炎性的M2型巨噬细胞。...

单核细胞来源细胞向类巨噬细胞的分化与极化

单核细胞来源的巨噬细胞是先天免疫系统的重要细胞。本文介绍了一种易于使用的 体外...

一个 体外 研究人类巨噬细胞分化与极性异质性的模型

我们介绍一种简单高效的生成人巨噬细胞的方案。通过双密度梯度离心法处理血沉棕黄层，分离单核细胞，随后在特氟龙涂层细胞培养袋中将其分化为巨噬细胞。该方法可最大化巨噬细胞产量，并便于后续实验的细胞收获。...

通过双梯度离心法分离人单核细胞及其在特氟龙涂层细胞培养袋中向巨噬细胞的分化

双梯度离心法，人单核细胞，巨噬细胞分化，特氟龙涂层培养袋，细胞培养，外周血单个核细胞，Ficoll密度梯度，Percoll梯度，单核细胞分离，巨噬细胞

代谢重编程是M1和M2型巨噬细胞极化的特征及先决条件。本文描述了一种用于检测小鼠骨髓来源巨噬细胞糖酵解和线粒体功能基本参数的实验方法。该工具可用于研究特定因素如何影响巨噬细胞的代谢及其表型。...

利用实时细胞外通量分析对极化M1和M2型骨髓源性巨噬细胞进行代谢表征

我们提出了一种获取人类巨噬细胞蛋白质组特征的方案，并将其应用于研究低氧环境对巨噬细胞极化的影响。...

低氧环境下人巨噬细胞极化的蛋白质组学分析

本方案提供了一种研究结核分枝杆菌（Mycobacterium...

结核分枝杆菌感染后人单核细胞来源的M1和M2极化细胞的制备及流式细胞术分析

M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAM）与肿瘤进展及癌症患者的不良预后相关。本方案提供了一份详细指南，可在14天内可重复地将THP-1类单核细胞分化并极化为M2样巨噬细胞。该模型为研究肿瘤微环境中TAM的抗炎作用奠定了基础。...

利用人单核样THP-1白血病细胞系诱导巨噬细胞分化并极化为M2样表型

本实验方案描述了从小鼠中分离和培养骨髓来源巨噬细胞的方法。...

从小鼠中分离和培养骨髓来源的巨噬细胞

本文介绍了一种评估植入物表面免疫调节潜力的详细实验方案 体外旨在提高现有实验方案的可靠性和可重复性，并推动进一步研究。通过使用人外周血单核细胞来源的巨噬细胞，检测其在钛材料表面培养时的分泌性细胞因子谱、mRNA表达及细胞表面标志物，以研究巨噬细胞的极化状态。...

在植入物表面极化并表征人单核细胞来源的M1与M2型巨噬细胞

学习使用小鼠骨髓来源巨噬细胞建立体外极化模型，通过流式细胞术和实时PCR分析M1/M2表型激活反应。该方法为研究免疫应答和开发相关疾病治疗策略提供可靠工具。

利用骨髓来源巨噬细胞研究巨噬细胞极化

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