人类单核双梯度离心法和其分化为巨噬细胞的特富龙涂层的细胞培养袋隔离

该程序的总体目标是使用标准实验室设备产生高数量和高质量的人类巨噬细胞。这是通过首先在 FI 调用梯度上离心 Buffy 外壳中的血液以收集 P BMCs cs 来实现的。接下来，在每次调用梯度上，将单核细胞与淋巴细胞分离。

然后将单核细胞接种在 Teflon 包被的细胞培养袋中并分化。六天或七天后，收获巨噬细胞并接种用于后续研究。获得的细胞应表达成熟巨噬细胞的典型标志物，并对各种刺激做出反应，例如与肿瘤细胞共培养或用 LPS 刺激，该技术相对于现有方法（如逆流、离心或磁激活细胞分选）的主要优点是可以用标准 LIP 设备生成人巨噬细胞，而无需昂贵的试剂或仪器。

虽然这种方法易于执行，但刚接触这种方法的个体可能难以在密度梯度中可视化和分离不同的细胞群。因此，这些步骤的可视化演示将有助于克服这些困难。该方案一式二份执行，以便于平衡转子。

首先从分层血液中消毒两袋血沉棕黄层部分。然后将 Buffy 涂层转移到每层 Buffy 涂层的两个 50 毫升管中。用 15 毫升室温 FI call 溶液制备三支 50 毫升试管，浓度为 1.077 克/毫升。

现在慢慢而小心地，在每管 FI call 上涂上 30 到 35 毫升的蓬松外套。各层不应混合，将这些试管在 400 G 下离心半小时而不破裂。在室温下，两个阶段之间会形成一个外周血单核细胞的白色环。

用塑料移液管去除这些层。将来自每个供体的三个试管层合并成每个供体的两个 50 毫升试管。加入 1 毫摩尔 P-B-S-E-D-T-A 至 40 mL线，洗涤收集的细胞，然后在室温下以 300 G 离心 10 分钟，不要破裂。

现在吸出并丢弃上清液。然后重复洗涤和 P-B-S-C-D-T-A，重悬并汇集来自每个供体的沉淀和 20 毫升 RPMI 加不含酚红的 FCS。现在每个供体应该有一管细胞。

现在制备第二次密度梯度混合物：每次调用溶液 23.13 mL室温，在 50 mL试管中加入 1.87 mL的 10 XPBS。为每两个样品准备一管混合物。接下来，将 23 毫升混合物转移到新的 50 毫升试管中。

然后加入 27 毫升 RPMI 加含酚红的 FCS。结果是每次调用溶液的 ISO 渗透压为 46%。现在，对于每次供体转移，将 25 毫升 46% 溶液加入 50 毫升试管中，并小心地分层在细胞混合物上。

这两个阶段应该可以通过它们的颜色来区分，而不会中断。在室温下将细胞离心半小时，在 550 G.A 的白色单核细胞环将在两个面之间聚集。用塑料移液管将这些细胞收集到 50 毫升的试管中。

用 1 毫摩尔的 P-B-S-E-D-T-A 洗涤单核细胞，填充至 50 毫升标记。然后在室温下以 400 G 离心 10 分钟而不破裂，弃去上清液，将沉淀的单核细胞重悬于 20 mL 培养基中。然后继续下一部分。

该方案使用 FEP 特氟龙涂层培养袋作为培养室。首先估计收集的单核细胞的数量。单核细胞很大，通常形状不规则。

不要计数较小的淋巴细胞。如果一个供体有 100 到 1.5 亿个细胞可用，则准备 180 毫升补充的 RPMI。如果细胞较少，则为每 30 至 5000 万个细胞制备 30 毫升体积的培养基。

以 20 mL 等分试样，小心地将细胞混合到 180 mL 制备的培养基中。然后用连接到培养袋塞子上的 50 ml perfu 注射器将细胞装入培养袋中。取出注射器，推出剩余的空气，然后用锥体盖住塞子。

现在将袋子与 5% 二氧化碳一起孵育 6 到 7 天。孵育 6 到 7 天后，将培养袋转移到冰中以收获细胞，将培养袋完全浸入冰中，让它们冷却 1 到 3 小时以分离细胞。接下来，轻轻地将袋子拉过边缘约 10 次。

然后对袋子的外部进行彻底消毒。用 50 毫升注射器更换塞锥。然后抽出细胞悬液并将其转移到 50 毫升试管中。

收集完所有试管后，以 400 G 离心 10 分钟在室温下，吸出上清液并将所有细胞汇集到 10 mL RPMI 加 FCS 中。然后像以前一样对细胞进行计数。仅计算巨噬细胞，因为可能存在残留的淋巴细胞。

然后将细胞用于感兴趣的应用，以重复使用培养袋。用 70% 乙醇洗涤两次。然后用 50 毫升 70% 乙醇填充它们，第二天在室温下孵育过夜，用无菌 PBS 冲洗袋子 3 次。

然后用灭菌纸包裹并高压灭菌。一个袋子可以很容易地重复使用 10 倍的密度梯度。离心产生含有淋巴细胞和单核细胞的白色界面。

在这里，我们检查第一个密度梯度。梅·格伦瓦尔德。这些细胞的染色显示高细胞核质比率（典型的淋巴细胞）和豆形或环状细胞核（典型的单核细胞）。

这些污渍显示第二个梯度的结果。每个血沉棕黄层产生约 1.5 亿个单核细胞，这些单核细胞可以分化为约 7000 万个巨噬细胞。在 20 种制剂中，47% 的单核细胞变成巨噬细胞。

纯化的巨噬细胞可以通过粘附在塑料表面来进一步富集，这是污染细胞所不具备的特征。铺板后，大多数巨噬细胞呈现煎蛋形态，而其他巨噬细胞则具有拉伸的纺锤体样表型。细胞的特征是几个标志物的表达。

典型为成熟巨噬细胞。CD 11 B 的表达反对树突状分化，CD 2 0 9 表达的缺乏也是如此。分化后，细胞在功能和代谢上保持活跃 5 到 7 天。

活细胞的钙染色显示它们能够吸收从肿瘤细胞脱落的红色标记细胞外囊泡。此外，巨噬细胞可以被激活，例如，用脂多糖刺激导致几个促炎基因的表达。按照此程序，分离的巨噬细胞可以进行大量的功能测定，以回答有关健康和疾病中巨噬细胞生物学的基本问题。

看完这个视频，你应该对如何产生大量的人类巨噬细胞有了很好的了解。但是，重要的是要记住，您使用的是人类血液样本，这可能具有潜在的传染性。