Name: 比较方法来表征景观的宿主 - 病原体蛋白 - 蛋白相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: 学习比较病原体与宿主蛋白相互作用的方法，通过酵母双杂交和高通量Gaussia princeps蛋白互补实验，系统分析不同毒株变体的相互作用谱，识别基因型特异性生物标志物和治疗靶点。

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本工作部分得到了巴斯德研究所的资助，以及法国抗癌联盟（Ligue nationale contre le Cancer）（资助号 R05/75-129 和 RS07/75-75）、法国癌症研究协会（Association pour la Recherche sur le Cancer）（资助号 ARC A09/1/5031 和 4867）和法国国家研究署（Agence Nationale de la Recherche）（资助号 ANR07 MIME 009 02 和 ANR09 MIEN 026 01）的资助。M.M. 获得了法国教育部科研与技术部（M.E.N.R.T）的博士奖学金。

1. 酵母双杂交筛选
<ol>
	<li>配制以下所需溶液
	<ol>
		<li>完全合成缺陷型（SD）培养基：将26.7 g含葡萄糖的最低限度SD基础培养基溶解于1 L水中。加入2 g按如下比例配制的氨基酸混合物：2 g硫酸腺嘌呤半盐、2 g盐酸精氨酸、2 gHistidine HCl、2 g异亮氨酸、4 gLeucine、2 g盐酸赖氨酸、2 g甲硫氨酸、3 g苯丙氨酸、2 g L-丝氨酸、2 g L-苏氨酸、3 gTryptophan、2 g酪氨酸、1.2 g尿嘧啶、9 g缬氨酸。</li>
		<li>选择性缺陷型SD-L/-W/-H培养基：SD培养基中包含所有必需氨基酸，唯独缺少指定的氨基酸（-L：缺亮氨酸；-W：缺色氨酸；-H：缺组氨酸）。</li>
		<li>YPGLU培养基：配制1 L时，称取10 g酵母提取物、10 g胰蛋白胨和20 g葡萄糖。若制备固体培养基，则加入25 g琼脂粉。</li>
		<li>YCM培养基：成分与YPGLU相同，但pH值调节至4.5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酵母杂交与涂布
	<ol>
		<li>使用预先转化的Y187酵母菌株（交配型α）的冻存 aliquot，该菌株含有克隆在pACT2载体中的cDNA文库。通过在SD-L平板上进行系列稀释涂布，检测细胞活力。</li>
		<li>将病原体ORF克隆至pGBKT7载体中，并通过标准方法将重组质粒转化至AH109酵母菌株（交配型a）中。</li>
		<li>将转化pGBKT7的AH109酵母涂布于SD-W平板上。在湿润培养箱中30 °C下培养至少两天。平板可在4 °C保存，直至进行双杂交筛选。</li>
		<li>使用3-氨基三唑（3-AT）——一种HIS3酶的竞争性抑制剂——以抵消病原体蛋白对HIS3报告基因可能产生的自激活作用。通过测定能够阻止转化pGBKT7的酵母在SD-W/-H平板上生长的3-AT浓度，进行自激活测试。</li>
		<li>在30 ml SD-W液体培养基中接种少量转化pGBKT7的AH109菌落。30 °C振荡培养30小时。</li>
		<li>在200 ml SD-W培养基中加入上述30 ml AH109培养物，30 °C振荡培养约20小时。</li>
		<li>将解冻的含cDNA文库的Y187酵母接种于20 ml YPGLU培养基中，30 °C振荡培养10分钟。</li>
		<li>取相当于含cDNA文库的Y187酵母细胞数量的pGBKT7转化AH109培养液体积，在20 °C下以3,500 rpm离心5分钟。小心吸弃上清液，并将沉淀重悬于10 ml YPGLU培养基中。</li>
		<li>将重悬的AH109酵母与含文库的Y187酵母混合，转移至50 ml离心管中。在20 °C下以3,500 rpm离心5分钟，小心吸弃上清液（沉淀较脆弱）。</li>
		<li>用YPGLU培养基重悬沉淀，总体积为1.5 ml。</li>
		<li>将酵母混合液涂布于3块150 mm YCM-琼脂平板上，每板0.5 ml。30 °C培养4.5小时。</li>
		<li>用玻璃刮铲从YCM平板上收集杂交后的酵母，加入10 ml SD-L/-W/-H培养基中。再用5 ml SD-L/-W/-H培养基冲洗平板两次，合并所有液体。</li>
		<li>在20 °C下以3,500 rpm离心5分钟，弃去上清液，将酵母沉淀重悬于5 ml SD-L/-W/-H培养基中。</li>
		<li>将杂交后的酵母涂布于10块添加了适当浓度3-氨基三唑（3-AT）的SD-L/-W/-H琼脂平板上（每板0.5 ml，3-AT浓度依据自激活测试结果确定）。在湿润环境中30 °C培养6–10天。</li>
		<li>为评估杂交效率，测定二倍体（2n）比例：将杂交后酵母悬液进行系列稀释（10-4至10-6），取250 μl涂布于SD-L/-W平板上。30 °C培养两天后，计数SD-L/-W平板上生长的菌落数，推算初始杂交酵母体积中的总二倍体数量。将该二倍体数量与含文库的可育酵母数量进行比较，计算二倍体比例，其值应在10–25%之间。</li>
		<li>在30 °C培养6–10天后，挑取杂交酵母菌落接种至新鲜的SD-L/-W/-H + 3-AT平板上。[提示：可将酵母按8行×12列的布局排列，模拟96孔板形式，便于后续测序操作]。在湿润环境中30 °C培养4–5天，使酵母菌落充分生长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过PCR与测序筛选his3阳性克隆 
	目标是扩增在选择性SD-L/-H/-W平板上生长的酵母菌落中pACT2载体所含的ORF。
	<ol>
		<li>将96孔PCR板置于冰上。</li>
		<li>为裂解酵母细胞，每孔加入50 μl Zymolase 20T溶液（2.5 mg/ml，溶于10 mM HEPES缓冲液，pH 7.7）。</li>
		<li>每孔轻轻重悬一个菌落。</li>
		<li>37 °C孵育15分钟，随后95 °C孵育15分钟。</li>
		<li>将PCR板放回冰上，每孔加入50 μl蒸馏水，用移液器反复吹打混匀。</li>
		<li>在4 °C下以3,500 rpm离心5分钟。</li>
		<li>取10 μl进行PCR扩增，以检测插入片段。使用与pACT2载体中cDNA来源ORF两侧互补的引物。以下为使用ExTaq聚合酶扩增96个裂解酵母样本的反应体系配制方法：525 μl 10× ExTaq缓冲液、420 μl dNTP混合液（2.5 mM）、10.5 μl正向引物（1 μg/μl）、10.5 μl反向引物（1 μg/μl）、31.5 μl ExTaq酶（5 U/μl）和3202.5 μl H2O。将40 μl反应混合液分装至96孔PCR板的每孔中，再向每孔加入10 μl裂解后的酵母样本。PCR程序如下：94 °C预变性3分钟；随后进行35个循环（94 °C变性30秒、60 °C退火1分钟、72 °C延伸4分钟），最后72 °C延伸7分钟。取3 μl PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，以鉴定PCR阳性克隆。建议使用预铸的96孔琼脂糖凝胶。 
		[提示：PCR板可在-20 °C保存数月，并可重复用于新的PCR反应]</li>
		<li>对从HIS3阳性克隆中扩增出的PCR片段进行测序。进行BLAST分析以鉴定细胞来源的ORF。排除低置信度比对结果（E值&gt;10-10、序列一致性&lt;80%、肽段长度&lt;20个氨基酸）以及存在移码突变或提前终止密码子的序列。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用于高通量基因型-表型关联分析（HT-GPCA）的矩阵构建
HT-GPCA 是一种基于哺乳动物细胞的检测方法，其中病原体和宿主蛋白被瞬时表达，并分别与分裂的Gaussia princeps荧光素酶的互补片段融合。当这两个蛋白相互作用时，荧光素酶得以重建，从而可检测其酶活性。因此，相互作用的强度可通过标准化发光比值（见下文及图1）推断得出。
<ol start="4">
	<li>宿主细胞配对的选择
	<ol>
		<li>在酵母双杂交筛选中选择被鉴定超过三次的蛋白质，用于在哺乳动物细胞中进一步验证，以提高数据集的可信度9。</li>
		<li>将病原体蛋白已知的相互作用伴侣作为阳性对照加入。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转入高通量GPCA兼容载体
	<ol>
		<li>将每个病原体蛋白的ORF克隆至pSPICA-N2载体中，以生成在其N端融合了人源化Gaussia princeps荧光素酶氨基酸110至185位的病原体蛋白（GL2-病原体蛋白融合体）。</li>
		<li>直接从酵母双杂交阳性克隆或其他ORF资源（人类ORFeome <a href="http://horfdb.dfci.harvard.edu/" target="_blank">http://horfdb.dfci.harvard.edu/</a>）中通过PCR扩增细胞蛋白ORF，并将其转入pSPICA-N1载体中，以生成在N端融合了人源化Gaussia princeps荧光素酶氨基酸18至109位的蛋白（GL1-宿主蛋白融合体）。 
		[提示：对于大规模克隆，建议使用Gateway克隆系统。在此情况下，PCR扩增应使用含有Gateway兼容位点的引物]。</li>
		<li>对所有表达载体进行测序。pSPICA-N1和pSPICA-N2载体的序列可在参考文献8中找到。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
请注意，质粒构建体可以互换，即将病原体蛋白插入 pSPICA-N1，宿主蛋白插入 pSPICA-N2。
3. 基于Gaussia princeps荧光素酶的高通量蛋白质互补分析法（HT-GPCA）
<ol start="6">
	<li>细胞转染
	<ol>
		<li>将293T细胞以350,000个细胞/ml的密度接种于含10%胎牛血清（FBS）但不含抗生素的DMEM培养基中。每孔加入100 μl，分装至无菌白色培养板中。单次实验不要超过10块板。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。 
		[提示：由于pSPICA质粒含有SV40复制起点，使用293T细胞可使其在转染细胞中复制，从而实现两种荧光素酶片段的过表达。]</li>
		<li>次日，采用任何合适的转染方案对细胞进行转染。请注意，对于某些转染试剂，可能需要调整接种的细胞数量。每孔使用100 ng的病原体和宿主ORF质粒构建体。同时每孔共转染10 ng的CMV-萤火虫荧光素酶质粒，用于校正转染效率。每个样本设三个重复孔。 
		[提示：DNA混合物可在转染前一天配制，并用封口膜密封后于-20 °C保存。]</li>
		<li>将转染混合物转移至培养有293T细胞的培养板中。加入DNA混合物时应轻柔操作，避免剧烈冲击，因为293T细胞贴壁较弱，容易从孔底脱落。将细胞置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育24–30小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<ol start="7">
	<li>细胞裂解与Gaussia荧光素酶检测
	<ol>
		<li>用PBS洗涤细胞（每孔100 μl），加入40 μl 1× Renilla裂解缓冲液，室温振荡孵育30分钟。</li>
		<li>将10 μl细胞裂解液转移至另一白色酶标板中，用于后续Firefly荧光素酶活性检测。4 °C保存，或密封后在-20 °C保存。</li>
		<li>向剩余的30 μl细胞裂解液中加入100 μl Renilla荧光素酶检测试剂，用发光仪检测10秒的发光信号，以测定Gaussia活性。一个96孔板的检测约需半小时。请使用新鲜制备的细胞提取物进行检测，因为冻存或长期储存可能影响由相互作用介导的Gaussia活性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<ol start="8">
	<li>萤光素酶活性的测定
	<ol>
		<li>向保存的10 μl细胞裂解液中加入50 μl萤光素酶检测试剂，测定萤光素酶活性，发光信号计数时间为10秒。一块96孔板的检测大约需要半小时。[提示：萤光素酶活性检测可在细胞裂解液冻存后的第二天进行。]</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<ol start="9">
	<li>NLR 计算
	<ol>
		<li>对于每种相互作用，计算Gaussia荧光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性的比值，以获得标准化的Gaussia发光值，该值可校正转染效率和细胞活力。计算三个重复样本的平均值。</li>
		<li>为监测相互作用，针对每对病原体-宿主组合估算一个标准化发光比值（NLR）。具体方法是：将检测到的同时存在病原体和宿主蛋白条件下的标准化Gaussia发光活性，除以对照孔中测得的活性之和（图1，改编自参考文献8）。阳性相互作用的NLR阈值 cutoff 值估计约为3.5 8。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<ol start="10">
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>使用 R 统计软件包进行层次聚类分析。首先将 NLR 数据分组归类，然后采用完全连接法（complete linkage method）计算相互作用树状图。利用 JavaTreeView 软件10对树状图进行可视化。通过皮尔逊相关系数（pearson correlation coefficient）计算相互作用树状图与系统发育树之间的距离。</li>
		<li>为构建相互作用网络，从 HT-GPCA 数据集中筛选出阳性相互作用，并使用 Cytoscape 软件1进行分析。提取宿主蛋白的连接度（degree），并绘制其分布图以评估网络的局部动态特性。可将宿主-病原体相互作用网络叠加到宿主相互作用组（host interactome）上，以评估病原体蛋白对宿主细胞网络的整体影响。</li>
		<li>利用 DAVID 生物信息学数据库12提取与靶向细胞因子相关的 GO（Gene Ontology）术语，以评估数据集的功能富集情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+viruses+hijack+cell+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">How viruses hijack cell regulation.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).</li>
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<li>Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoscape+2.8%3A+new+features+for+data+integration+and+network+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization.</a> Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+genotype+comparison+of+human+papillomavirus+E2-host+interaction+networks+provides+new+insights+for+e2+molecular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions.</a> PLoS Pathog. 8, e1002761(2012).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

酵母双杂交和哺乳动物相互作用检测方法（如GST下拉、LUMIER或MAPPIT）各自已被证明是检测蛋白质-蛋白质相互作用的有效工具，但这些技术存在较高的假阳性和假阴性相互作用率，因而受到限制15。此外，越来越多的证据表明，联合使用正交方法可提高所获得相互作用数据集的可靠性7。本文所述的高通量GPCA（HT-GPCA）技术的最新发展，不仅提高了在哺乳动物细胞中检测二元蛋白质-蛋白质相互作用的灵敏度，还实现了对大量相互作用的并行处理。
本文所述策略通过检测多种菌株变体的相互作用，提高了单个酵母双杂交筛选的覆盖范围。此外，采用正交检测方法重新验证相互作用，可克服双杂交技术固有的局限性并避免实验假象，从而获得更为严格的比较性相互作用数据集。事实上，由于高通量GPCR阵列（HT-GPCA）在哺乳动物细胞中进行，蛋白质的翻译后修饰和天然亚细胞定位均不受影响。因此，与主要依赖酵母双杂交进行相互作用检测的方法相比，我们的方法能够在一步操作中生成质量更高的相互作用图谱4。
尽...

为构建蛋白质-蛋白质相互作用图谱而收集的大量数据，为进一步理解病原体感染提供了新的视角。随着对病原体感染的全局性认识逐步形成，研究人员得以了解病原体蛋白在与人类蛋白质组连接时所引发的各种扰动1。这为理解病原体如何操控宿主细胞机制提供了途径。特别是，多个病毒-宿主相互作用网络的绘制揭示，病毒蛋白倾向于靶向细胞网络中连接度较高的宿主蛋白（即“枢纽”蛋白），或在网络多条通路中处于中心位置的蛋白（即“瓶颈”蛋白）2-4。这些相互作用使病毒能够操控关键的细胞过程，从而实现自身复制并产生具有感染性的子代病毒。近期，研究人员对相关病毒开展了比较性相互作用图谱研究，旨在提取与致病机制相关的信息4。此外，对宿主-病原体相互作用格局的研究已扩展至多种病原体5。靶向宿主细胞因子的鉴定有助于揭示病原体感染细胞所采用的策略，并为发现潜在的致病标志物提供线索。
酵母双杂交系统是鉴定二元相互作用最常用的方法，因为遗传筛选是一种高效且灵敏的高通量蛋白质-蛋白质相互作用作图工具。本文提出的方法通过评估多种病原体菌株变体的同一蛋白质，进一步改进了单个酵母双杂交筛选，从而提供病原体-宿主蛋白质相互作用的比较性概览。此外，酵母双杂交筛选的一个主要局限在于假阴性率较高，因其仅能检测到约全部相互作用的20%6。这意味着仅在部分病原体变体中检测到的相互作用可能在其他变体中未能被发现。因此，从所有双杂交筛选中获得的单个互作蛋白伙伴将进一步接受与所研究全部菌株变体相互作用的验证，从而生成可比较的相互作用数据集。由于已有研究证明，结合不同方法可显著提高蛋白质-蛋白质相互作用数据集的可靠性7，该验证步骤在哺乳动物细胞中通过一种新开发的蛋白质片段互补检测法（HT-GPCA）进行8。该基于细胞的系统利用Gaussia princeps分裂荧光素酶的互补反应来检测蛋白质相互作用，并设计为适用于高通量实验格式。得益于其基于发光的技术以及相较于其他基于荧光的检测方法更低的背景噪声，HT-GPCA表现出极高的灵敏度。
总体而言，该方法是一种高效工具，可用于全面绘制宿主-病原体相互作用图谱，这是实现对宿主细胞劫持机制全局理解的第一步。

<table><tbody><tr><td>酵母菌株</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>最小SD培养基基础</td><td>美国生物</td><td>D9500</td><td></td></tr><tr><td>氨基酸</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）</td><td>Acros Organics</td><td>264571000</td><td></td></tr><tr><td>Zymolase</td><td>Seikagaku</td><td>120491</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>海肾荧光素酶检测</td><td>Promega</td><td>E2820</td><td></td></tr><tr><td>白色培养皿</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>96孔PCR板</td><td>4titude</td><td>4t-i0730/C</td><td></td></tr><tr><td>培养箱（30 &amp;deg;C)</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱（37 &amp;deg;C)</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光度计</td><td>贝特霍尔德</td><td>Centro XS-LB 960</td><td></td></tr></tbody></table>

宿主-病原体蛋白质-蛋白质相互作用图谱的比较研究方法

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

人们已投入大量努力来构建大规模、全面的蛋白质-蛋白质相互作用网络图谱。这对于理解病原体与宿主之间的关系至关重要，早期主要通过酵母双杂交系统中的遗传筛选来实现。近年来，基于Gaussia荧光素酶的片段互补检测技术显著提升了蛋白质-蛋白质相互作用的检测能力，现为发展整合性比较互作组学方法提供了契机，从而能够严格比较不同病原体菌株变体的蛋白质与一组共同细胞因子之间的相互作用谱。
本文重点探讨结合两种正交方法生成蛋白质-蛋白质相互作用数据集的实用性：酵母双杂交（Y2H）和一种新方法——在哺乳动物细胞中进行的高通量Gaussia princeps蛋白质互补分析（HT-GPCA）。
通过基于交配的酵母双杂交筛选，利用多种病原菌株变体对cDNA文库进行大规模鉴定，以识别病原体蛋白的细胞互作伙伴。根据高置信度统计评分选出一部分互作伙伴后，进一步在哺乳动物细胞中使用HT-GPCA技术，针对全套病原体变体蛋白进行成对互作验证。这两种互补方法的结合提高了互作数据集的可靠性，并可实现严格的比较性互作分析。此类比较互作组学研究构成了剖析任何病原体-宿主相互作用的可靠而强大的策略。

HT-GPCA 的一个主要优势在于其高灵敏度，这一点通过 图2 中人乳头瘤病毒（HPV）E2 蛋白的假阳性率和假阴性率评估结果得以体现（改编自参考文献13）。为确定假阴性率，使用 HT-GPCA 检测了 HPV16 E2 蛋白的已知相互作用（图2A）。在18个已知相互作用中，有4个未被检测到（对应22%的假阴性率）。通过将12种 HPV E2 蛋白与一组随机的细胞蛋白进行测试，测得假阳性率为5.8%（图2B）。此外，该方法的高特异性在 图2C 中得到进一步体现，结果显示，一个已知会干扰 E2 与其细胞伴侣 BRD4 结合的单点突变完全消除了 NLR 比值（图2C）。
这种大规模比较相互作用组学方法最近已成功应用于人乳头瘤病毒（HPV）的三种早期蛋白：E2、E6 和 E7，这些蛋白来源于代表HPV在嗜性与病理学上自然多样性的不同基因型。 13,14对于每种早期蛋白，其相互作用谱的层次聚类在很大...

本文重点介绍利用两种正交方法相结合的策略，鉴定宿主与病原体蛋白质之间高可信度相互作用数据集：酵母双杂交系统，随后进行一种称为高通量哺乳动物细胞相互作用检测（HT-GPCA）的高通量相互作用分析。

为构建大规模、全面的蛋白质-蛋白质相互作用网络图谱，人们付出了巨大努力。这对于理解……具有重要意义。

以下实验的总体目标是进行异源性研究，以比较不同病原体变异株的蛋白质与一组共同的细胞因子之间的相互作用特征。该目标通过基于酵母的cDNA双杂交筛选技术实现，用于鉴定来自不同病原体变异株的蛋白质的潜在相互作用伙伴。第二步，对鉴定出的相互作用伙伴的开放阅读框进行测序，并将其转入适用于进一步验证的载体中。接下来，从所有双杂交筛选中获得的一组独立互作蛋白被选出，并重新检测其与所研究的全部菌株范围之间的相互作用。该检测采用一种基于哺乳动物细胞的正交GIA——荧光素酶蛋白片段互补实验，以提供可靠的比较性相互作用数据集。实验结果根据测得的荧光素酶活性，显示出病原体蛋白与宿主细胞蛋白之间不同的相互作用强度，从而提供了病原体-宿主蛋白相互作用的比较性概览。通过层次聚类对相互作用谱进行分析，可将特定的宿主-病原体相互作用与病理特征相关联，并揭示病原体蛋白在致病过程中的作用。相较于其他用于绘制病原体-宿主蛋白相互作用的方法，该方法的主要优势在于能够提供多个菌株变体之间的严格比较性相互作用数据集。该技术不仅能够揭示病原体蛋白的相互作用网络，还可应用于其他系统，例如利用完整病毒和河流遗传学作为感染性分子的研究。请按照书面实验方案中的描述，从酵母细胞的交配和铺板开始本实验流程。30 毫升缺乏色氨酸的选择性缺陷型培养基，其中含有少量转化了表达病原体蛋白的 P-G-B-K-T 质粒的 AH 1 0 9 酵母菌株的菌落。在 30°C 下振荡培养 30 小时。随后，用 30 毫升的 AH 1 0 9 菌液接种 200 毫升缺乏色氨酸的选择性缺陷型培养基。培养物在30摄氏度下旋转孵育20小时。同时，将转化了cDNA文库的Y187菌株在20毫升YP培养基中于30摄氏度旋转孵育10分钟。随后，取相当于存活Y187酵母细胞数量的pGBKT7转化AH109菌液，于3,500 ×g离心5分钟，温度为20摄氏度。小心吸去上清液，并将沉淀物用 10 毫升 YP 胶重新悬浮。将重悬的 AH109 酵母与含有文库的 Y187 混合。转移至 50 毫升离心管中，在 20 摄氏度下以 3,500 转/分钟离心 5 分钟。仔细吸走上清液Resus后，将沉淀重悬于YP胶中，总体积为1.5毫升。接着，将酵母菌液均匀涂布于三块YCM琼脂培养板（直径150毫米），每板0.5毫升，并在30°C下孵育4.5小时。用玻璃刮刀从YCM平板上刮取交配后的酵母菌，收集至10毫升选择性缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸的dropout培养基中。用五毫升相同培养基将平板冲洗两次，随后在3,500 RPM、20摄氏度条件下离心五分钟，收集菌体。弃去上清液并重复此步骤。将酵母菌体沉淀重悬于五毫升不含亮氨酸、色氨酸和组氨酸的选择性缺陷培养基中。然后将交配后的酵母涂布于10个缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸并添加适当浓度的3-氨基三唑（3-AT）的选择性 dropout 琼脂平板上，3-AT 的浓度依据自激活试验结果确定。在30°C、湿润环境中培养6至10天后，按照书面实验方案所述方法计算二倍体率。挑取酵母菌落，并转移至新制备的缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸但添加3-AT的选择性 dropout 琼脂平板上。将酵母按照8行12列的布局排列，以模拟96孔板的格式，便于后续测序操作。将酵母菌落在30摄氏度、湿润的环境中培养4至5天。本部分的目标是通过PCR扩增从在缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸的选择性 dropout 琼脂平板上生长的酵母菌落中裂解释放出的PA ct2载体所含的cDNA。首先将一个96孔PCR板置于冰上，每孔加入50 µL xmal 20 T溶液以裂解酵母细胞。每孔轻柔重悬一个菌落。将PCR板在37 °C孵育15分钟，随后在95 °C孵育15分钟。将培养板放回冰上后，每孔加入50微升蒸馏水，用移液器吹打混匀，随后在4摄氏度、3,500转/分钟条件下离心5分钟。按照文字实验方案配制X tack混合液后，将40微升混合液分装至96孔PCR板的每孔中。每孔加入10微升裂解后的酵母溶液，并按照文字实验方案中列出的程序进行扩增反应。取3 µL PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，以检测PCR阳性克隆。对从这三个阳性克隆中分离出的PCR扩增片段进行测序。随后进行blast分析，以鉴定细胞中的开放阅读框，在进行细胞转染前剔除低置信度比对序列以及含有移码或提前终止密码子的序列。将病原体蛋白和细胞蛋白的开放阅读框分别转入相应的载体中，以生成与Gaussia荧光素酶片段融合的蛋白，具体操作详见文本方案。在含10%胎牛血清但不含抗生素的DMEM培养基中，以每毫升350,000个细胞的密度接种293T细胞。将100微升细胞悬液分配至无菌白色培养板的每孔中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。使用任何合适的转染方案进行转染，每孔加入100纳克的病原体和宿主开放阅读框质粒构建体，同时每孔加入10纳克的CMV萤光素酶质粒，用于校正转染效率。每个点均使用三份重复的转染混合物转移至培养有293T细胞的孔板中。注意将DNA混合物轻柔地加入细胞中，因为293T细胞贴壁较弱，容易从孔底脱落。在37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养箱中孵育24至30小时。用PBS洗细胞，每孔100微升。每孔加入40微升1×Vanilla裂解缓冲液，在室温下孵育30分钟。在震荡条件下，另取10 µL细胞裂解液保存于白色酶标板中，用于后续检测海肾荧光素酶活性，样品可储存于4 °C，或-20 °C条件下以备后续检测。将酶标板放入化学发光仪中，向每孔细胞裂解液中加入100 µL萤光素酶检测试剂，随后计数发光信号10秒。对一块96孔板进行剂量处理大约需要半小时。请始终使用新鲜提取物，因为冷冻或长期储存可能会影响剩余10微升细胞提取物中由相互作用介导的Gaia活性。使用化学发光仪向细胞裂解物中加入50微升萤火虫荧光素酶检测试剂，并计数10秒的发光信号。每种相互作用的96孔板剂量测定大约需要半小时。通过计算Gaia荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值，获得标准化的GAIA发光值，并考虑转染效率和细胞活力。计算三个重复样本的平均值以监测相互作用。为每种病原体-宿主配对估算归一化的发光比值（NLR）。具体方法是：将检测到的、在病原体和宿主蛋白同时存在条件下的归一化GAIA发光活性，除以对照孔中测得的活性之和。在之前的一项研究中，NLR 阳性相互作用的截断值估计约为 3.5。高通量 GIA 原理、蛋白质互补性检测（H-T-G-P-C-A）的主要优势在于其高灵敏度，这一点通过评估 HPVE 两种蛋白质的假阳性率和假阴性率以确定假阴性率得以说明。通过 H-T-G-P-C-A 检测了来自 HPV 16 的 E2 蛋白的已知相互作用，18 种相互作用中有 4 种未被检出，对应假阴性率为 22%。使用12种HPV E2蛋白与一组随机的细胞蛋白进行检测，测得假阳性相互作用的比例为5.8%。本图突出了该方法的高度特异性：一个已知会干扰E2蛋白与其细胞伴侣BRD4结合的单点突变完全消除了NLR比值。这种大规模比较性互作组学方法最近已成功应用于人乳头瘤病毒（HPV）的三种早期蛋白——E2、E6和E7，这些蛋白来源于不同基因型，代表了各类早期蛋白在嗜性与病理学方面的自然多样性。对相互作用谱进行的层次聚类在很大程度上重现了HPV的系统发育关系，证明了该方法的稳健性以及相互作用数据集的广泛适用性。该方法可用于将特定的病毒-宿主相互作用谱与病理特征相关联，从而为病毒蛋白的功能提供线索。在致病机制研究中，可提取出基因型特异性的相互作用，这些相互作用可能对应于组织嗜性或致病性生物标志物。如图所示，针对E6的六个相互作用伙伴，细胞靶点根据相互作用强度进行排序，并按相互作用的HPV类型进行分组。这种表示方法有助于识别特定生物标志物，例如fad，它仅与致癌型HPV的E6蛋白发生相互作用。此类靶向作用对于所有致癌型HPV的致癌特性至关重要，因此fad是作为HPV感染替代标志物或治疗靶点的良好候选分子。按照此方案，H-T-G-P-C-A 可以进行调整，用于与生物素标签融合表达的第三种蛋白质。这使得能够在链霉亲和素包被的孔板上捕获三种伴侣复合物，从而回答大分子蛋白质复合物形成的问题。观看本视频后，您应能充分理解如何通过以下方法表征病原体与宿主之间的相互作用：首先，通过探测多种菌株变异体的相互作用伙伴；其次，通过在哺乳动物细胞中利用蛋白质-蛋白质相互作用分析，比较它们与一系列不同类型病原体的相互作用。

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