比较方法来表征景观的宿主 - 病原体蛋白 - 蛋白相互作用

以下实验的总体目标是进行生态学研究，以比较来自不同病原体变体的蛋白质与一组常见细胞因子的相互作用谱。这是通过基于交配的酵母实现的，CDNA 的两种杂交筛选用于识别来自不同病原体变体的蛋白质的潜在相互作用伙伴。作为第二步，对相互作用的伙伴开放阅读框进行测序并转移到兼容的载体中，以便进一步验证。

接下来，选择从所有两个杂交筛选中出现的一组个体伴侣，并重新测试它们与所研究的全部菌株的相互作用。这是通过在哺乳动物细胞中进行的基于正交 gia、荧光素酶的蛋白质片段互补测定来完成的，以提供强大的比较相互作用数据集。结果显示，根据获得的荧光素酶测量值，病原体蛋白和细胞蛋白之间的相互作用强度不同，从而提供了病原体宿主蛋白相互作用的比较概述。

通过分层聚类处理相互作用谱将特定的宿主病原体相互作用与病理特征相关联，并提供有关病原体蛋白参与发病机制的见解。与其他绘制病原体宿主蛋白相互作用的方法相比，这种方法的主要优点是它提供了多个菌株变体之间的严格比较相互作用数据集。该技术提供了对病原体蛋白相互作用网络的见解，但它也可以作为使用完整病毒和河流遗传学的感染分子应用于其他系统，例如，按照书面方案种子中的描述，从交配和传播酵母细胞开始该方案。

用表达病原体蛋白的 P-G-B-K-T 7 质粒转化 30 mL 缺乏色氨酸且 AH 1 0 9 酵母菌株菌落少的选择性缺失培养基。在 30 摄氏度下旋转孵育 30 小时。下一个种子，200 毫升选择性辍学培养基减去色氨酸和 30 毫升 AH 1 0 9。

培养物在 30 摄氏度下旋转孵育 20 小时。此外，孵育 CDNA 文库将 Y 187 在 20 毫升 YP 胶水中转化 30 分钟，并在 30 摄氏度下旋转。然后，在 3， 500 RPM 和 20 摄氏度下，将一体积的 PG BK T 7 转化的 AH 109 培养物（相当于等量的活 Y 187 酵母细胞）离心 5 分钟。

小心地取出上清液，然后 Resus 将上颚悬浮在 10 毫升 YP 胶水中。将重悬的 AH 109 酵母与含有 Y 187 的文库混合。转移至 50 mL 试管中，然后在 3， 500 RPM 和 20 摄氏度下离心 5 分钟。

小心地取出 super dat Resus 后，将颗粒悬浮在 YP 胶水中，总共得到 1.5 毫升。接下来，将酵母以每板 0.5 毫升的浓度铺在三个 YCM 琼脂、150 毫米平板上，并在 30 摄氏度下孵育 4.5 小时。用耙玻璃在 10 毫升选择性辍学培养基中刮擦，减去亮氨酸色氨酸和组氨酸，从 YCM 板中收集交配的酵母。

用 5 毫升相同的培养基冲洗板 2 次，并在 3， 500 RPM 和 20 摄氏度下离心 5 分钟后混合。丢弃上清液和reus。将酵母沉淀悬浮在 5 毫升选择性缺失培养基中，不含亮氨酸、色氨酸和组氨酸。

然后将交配的酵母涂在 10 个选择性辍学琼脂板上，减去亮氨酸、色氨酸和组胺，并补充有适当浓度的 3 个氨基三唑或 3 个 AT 在自动激活试验中确定。在 30 摄氏度下在潮湿环境中孵育 6 至 10 天后，按照书面方案中的说明计算二倍体率。挑取酵母菌落并转移到从选择性辍学琼脂中新鲜制备的平板上，减去亮氨酸色氨酸和组氨酸加 3 个 a t。

以 8 个 12 孔泳道的方案订购酵母，复制 96 孔板，以便以后更容易测序。让酵母菌落在 30 摄氏度的潮湿环境中生长 4 到 5 天。本节的目标是 PCR，扩增 PA ct 中包含的 CDNA，即在选择性缺失琼脂减去亮氨酸、色氨酸和组氨酸平板上生长的裂解酵母菌落的两个载体。

首先将 96 孔 PCR 板置于冰上，以每孔 50 微升的 xmal 20 T 溶液溶解酵母细胞。轻轻重悬每个孔一个菌落。将板在 15 摄氏度下孵育 37 分钟，在 15 摄氏度下孵育 95 分钟。

将板放回冰上后，通过上下吹打，每孔混合液加入 50 微升蒸馏水，然后以 3， 500 RPM 和 4 摄氏度离心 5 分钟。按照文本方案中的说明制备 X 粘性混合物后，在 96 孔 PCR 板中每孔分配 40 微升混合物。每孔加入 10 微升裂解的酵母，并按照文本方案中列出的方式进行扩增。

在 1.2% agros 凝胶上运行 3 微升 PCR 产物以检测 PCR 阳性克隆。对从 His 三个阳性克隆中分离的 PCR 扩增片段进行测序。然后进行原始细胞分析以识别细胞开放阅读框，在细胞转染之前丢弃低置信度比对以及包含序列上的移码和过早终止代码。

将病原体蛋白和细胞蛋白开放阅读框转移到各自的载体中，以产生与 Gaia 荧光素酶片段融合的蛋白质，如文本方案中所述，以每毫升 350， 000 个细胞的 DMEM 和 10% 胎牛血清（不含抗生素）种子 2 9 3 T 细胞。将每孔 100 微升分装在无菌白色培养板中，然后在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下生长 24 小时，第二天。使用任何合适的转染方案转染细胞，每孔使用 100 ng 病原体和宿主开放阅读框质粒构建体，每孔转染 10 ng的 CMV 萤火虫荧光素酶质粒，以标准化转染效率。

将每个点在一式三份的转移转染混合物中测试到培养的 2 9 3 T 细胞的板中。小心将 DNA 混合物轻轻沉积到细胞上，因为 2、9、3 T 细胞的粘附性不强，很容易从孔底部分离，在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳和 5% 二氧化碳洗涤细胞，用 PBS 以每孔 100 微升的速度洗涤细胞。加入 40 μL 1 x 香草裂解液、缓冲液，并在室温下孵育 30 分钟。

在搅拌下，将 10 微升细胞裂解物保存在另一个白色板中，以备后续剂量储存在 4 摄氏度或负 20 摄氏度（带上限）的萤火虫荧光素酶以测量盖亚活性。将板放入发光计中，将 100 μL 香草荧光素酶测定试剂注入细胞裂解物上。然后对发光进行计数 10 秒。

96 孔板的剂量大约需要半小时。始终使用新鲜提取物，因为冷冻或长期储存可能会影响剩余 10 微升细胞提取物上相互作用介导的 Gaia 活性。使用化学发光计将 50 μL 萤火虫荧光素酶检测试剂注入细胞裂解物上，并对发光进行计数 10 秒。

每次相互作用，96 孔板的剂量大约需要半小时。计算 Gaia 荧光素酶活性和萤火虫荧光素酶活性之间的比率，以获得标准化的 GAIA 发光值。考虑到转染效率和细胞活力。

计算一式三份的平均值以监控交互作用。估计每个病原体宿主对的归一化发光比或 NLR。为此，将在病原体和宿主蛋白存在下检测到的标准化 GAIA 发光活性除以在对照孔中测得的活性之和。

在之前的一项研究中，积极互动的 NLR 临界值估计约为 3.5。高通量 GIA 戒律、蛋白质互补测定或 H-T-G-P-C-A 的主要优势在于其高灵敏度，通过评估 HPVE 2 蛋白的假阳性率和假阴性率来确定假阴性率，可以说明这一点。通过 H-T-G-P-C-A 评估了来自 HPV 16 的 E 2 的已知相互作用，18 次相互作用中有 4 次未恢复，对应于 22% 的假阴性率。

使用 12 种 HPVE 两种蛋白与一组随机细胞蛋白的相互作用测量为 5.8%。该图强调了该方法的强特异性，表明已知干扰 E 2 与其细胞伴侣 BRD 4 结合的单点突变湮灭，即 NLR 比率。这种大规模的比较生态组学方法最近已成功应用于人瘤病毒的三种早期蛋白质，E 2、E 6 和 E 7，它们起源于不同的基因型，代表了它们对每种早期蛋白质的嗜性和病理学的自然多样性。

相互作用概况的分层聚类，主要概括了 HPV 系统发育，证明了该方法的稳健性和相互作用数据集的优点。它可用于将特定的病毒宿主相互作用谱与病理特征相关联，从而为病毒蛋白的参与提供线索。在发病机制中，可以提取基因型特异性相互作用，这可能对应于嗜性或致病性生物标志物。

如此处所示，对于 E 6 个相互作用的伴侣，细胞靶标根据相互作用强度进行排序，并根据相互作用的 HPV 类型进行分组。这种表示允许识别特定的生物标志物，例如 fad，它仅与致癌 HPV 的 E 6 蛋白相互作用。这种靶向性对于所有致癌性 HPV 的致癌性状至关重要，因此构成了用作 HPV 感染的替代标志物或治疗靶点的良好候选者。

遵循此过程。H-T-G-P-C-A 可适于与表达为与生物素标签融合的第三种蛋白质一起使用。这允许在链球菌潜水色板上捕获三个伴侣复合物，这可以回答大蛋白复合物形成的问题。

看完这个视频后，你应该对如何表征病原体、宿主罐罐相互作用有了很好的了解。第三，通过探测多种菌株变体的交互伙伴。其次，通过使用蛋白质持续时间（例如在哺乳动物细胞中）比较它们与一整套病原体类型的相互作用。