无标签定量蛋白经济学工作流程，用于发现驱动的宿主-病原体交互

在这里，我们提出了一个协议，以分析宿主和病原体之间的相互作用，在感染基于质谱学的蛋白组学。此协议使用无标签量化来测量宿主（例如巨噬细胞）和病原体（例如 新福尔曼隐球菌）的蛋白质丰度变化。

我们的方案从宿主和病原体的角度研究真菌感染，以确定对疾病至关重要的生物系统之间的相互作用。我们可以在单个实验中同时检测真菌蛋白和宿主蛋白，并鉴定仅在感染过程中产生的真菌蛋白，代表新的感染相关蛋白。尽管我们专注于通过发现新的抗毒力治疗策略来治疗真菌感染，但我们的蛋白质组学和生物信息学管道是通用的，可以应用于许多生物系统。

我们的方法为不同病原体和众多免疫反应的研究奠定了基础，可用于为隐球菌与先天免疫系统之间的关系提供新的见解。巨噬细胞对病原体的反应和检测足够的真菌蛋白很重要。因此，建议对每个物种的 MOI 和时间点进行测试和优化。

由于巨噬细胞和真菌细胞培养可能具有挑战性，因此了解共培养后的预期结果非常重要。可视化为研究人员提供了实施程序的信心。为了制备用于巨噬细胞感染的真菌细胞，从中长期培养物中收集并离心新型隐球菌细胞，然后在相同的离心条件下用 1 毫升室温 PBS 温和洗涤 3 次。

最后一次洗涤后，以 1.2 倍/毫升的 10 倍重悬真菌细胞至第八个细胞的无抗生素细胞培养物，中等浓度，并将 1 毫升真菌细胞悬液添加到 70% 至 80% 汇合的 6 孔巨噬细胞培养板的四个孔中。然后，将板放入细胞培养箱中 3 小时。小心地倾斜板，让每个孔轻轻洗涤 3 次，每次洗涤每孔 1 毫升 PBS。

为了测量最后一次洗涤后的感染熟练度，向 6 孔板的每个孔中加入 1 毫升不含抗生素的培养基，然后将板放入细胞培养箱中。在适当的实验时间点，从每个孔中收集上清液，并根据标准方案测量每个孔中 LDH 的量。同时，裂解未感染的巨噬细胞以确定最大细胞毒性的值。

然后可以使用所示的公式计算细胞毒性。对于未感染的巨噬细胞收集和共培养，向未感染的巨噬细胞的每个孔中加入 1 毫升冷 PBS。1 分钟后，轻轻敲击板，将细胞从孔底部分离，并将细胞悬液汇集到一个 15 mL 试管中。

通过离心收集细胞并完全去除上清液，以便立即在液氮中快速冷冻沉淀，以在零下 80 度下储存。对数据集过程的主成分分析表明，正如预期的那样，数据中分离的最大成分是感染样本与未感染样本。样品的第二个显着特征是它们的生物变异性。

将 Pearson 相关性与欧几里得距离的分层聚类相结合，显示感染样本与未感染样本的明显聚类，复制重现性范围为 95% 至 96%可以使用 Benjamini-Hochberg 错误发现率进行针对多重假设检验进行校正的学生T 检验，以识别感染期间丰度存在显着差异的蛋白质与未感染的对照相比。在该分析中，鉴定了 117 种宿主蛋白，表明感染后表达发生显著变化。值得注意的是，正如感染期间预期的那样，还观察到真菌蛋白丰度的显着增加。

在共培养、洗涤和样品采集过程中轻柔地处理巨噬细胞很重要。通过定义病原体如何适应宿主以及宿主如何保护自己免受感染，可以获得对微生物学和免疫学领域的新见解。