Name: 无标签定量蛋白经济学工作流程，用于发现驱动的宿主-病原体交互 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: 探索基于质谱的无标签定量蛋白质组学方法，用于分析宿主巨噬细胞与新型隐球菌的相互作用。该技术可同步检测宿主与病原体蛋白，为感染相关蛋白研究提供新见解。

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作者感谢 Bioinformatics Solutions Inc. 的 Jonathan Krieger 博士在代表性实验中操作质谱仪，同时感谢 Geddes-McAlister 课题组成员在实验设置和稿件反馈方面提供的帮助。作者部分经费来自班廷研究基金会——Jarislowsky 博士后发现奖（Banting Research Foundation – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award）、新前沿研究基金——探索项目（New Frontiers Research Fund – Exploration, NFRFE-2019-00425）以及加拿大创新基金会（Canadian Foundation for Innovation, JELF 38798），上述资助授予 J.G.M.；B.B. 获得了加拿大自然科学与工程研究委员会研究生奖学金——硕士（NSERC Canada Graduate Scholarship – Masters）和安大略省研究生奖学金（Ontario Graduate Scholarship）；A.S. 获得了伊丽莎白二世科学与技术研究生奖学金（Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology）。

采用源自BALB/c小鼠的永生化巨噬细胞系进行以下实验方案，该方案已获圭尔夫大学动物使用方案4193号批准。值得注意的是，其他品系小鼠或其他来源的永生化细胞也可应用于本方案，但需经过充分测试以优化各项具体参数。以下方案将指导从一管冻存的巨噬细胞开始的操作步骤。细胞保存于含10% FBS（胎牛血清）、1% L-谷氨酰胺和5% 青霉素-链霉素（Pen/Strep）混合液的DMEM（杜氏改良伊格尔培养基）以及20% DMSO（二甲基亚砜）中。
1. 培养 C. neoformans
<ol>
	<li>使用甘油保存菌种，将野生型 C. neoformans 菌株（H99）划线接种于酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂平板上，以分离单菌落。</li>
	<li>在37 °C静置培养箱中培养16小时。</li>
	<li>挑取一个野生型 C. neoformans 菌株的单菌落，接种于5 mL YPD液体培养基中，置于松盖的10 mL试管内，在5 mL YPD肉汤中培养。设四个重复。</li>
	<li>在37 °C摇床培养箱中以200 rpm振荡培养16小时。</li>
	<li>次日，将每份过夜培养物按1:100比例转接至3 mL YPD液体培养基中进行二次培养。</li>
	<li>测定真菌培养物在600 nm处的光密度（OD600nm）值，以确定其处于对数中期。根据分光光度计的不同，野生型 C. neoformans 菌株通常在YPD培养基中培养6至8小时后进入对数中期，OD600nm值一般在1.0至1.5之间。</li>
	<li>当细胞达到对数中期时，取10 µL真菌细胞悬液转移至洁净的1.5 mL微量离心管中，用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释100倍，使用血细胞计数板计数细胞数量。</li>
</ol>
2. 巨噬细胞的培养
注意：细胞培养操作前，应确保工作环境已灭菌。
<ol>
	<li>细胞培养基的制备
	<ol>
		<li>含抗生素培养基：向DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）中加入10% FBS（胎牛血清）、1% L-谷氨酰胺和5%青霉素-链霉素（Pen/Strep）混合液。使用0.2 µm完整滤器系统过滤培养基，并于4 °C保存。</li>
		<li>无抗生素培养基：操作步骤相同，但省略Pen/Strep混合液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>巨噬细胞接种 
	注意：细胞培养操作前，应将含抗生素培养基（2.1.1）预热至37°C。
	<ol>
		<li>将巨噬细胞冻存管迅速置于37 °C水浴中解冻。</li>
		<li>用1 mL含抗生素培养基重悬细胞，以洗去冻存液。 
		注意：需格外小心，避免因剧烈吹打导致细胞裂解。</li>
		<li>将重悬后的细胞转移至无菌15 mL离心管中。</li>
		<li>在室温下以400 × g 离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
		<li>用移液管或真空抽吸装置小心去除上清液。</li>
		<li>用10 mL含抗生素培养基轻柔重悬细胞沉淀。</li>
		<li>将重悬细胞轻柔吹打加入60 × 15 mm细胞培养皿中。</li>
		<li>将培养皿置于37 °C、5% CO2条件下过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>巨噬细胞的初次传代 
	注意：冻存细胞通常每管含有500万至1000万个细胞（约1 mL）。次日，成功存活并完成接种的巨噬细胞将贴附于培养皿底部，可进行传代操作。
	<ol>
		<li>细胞培养操作前，将含抗生素培养基（步骤2.1.1）预热至37 °C。确保操作环境已灭菌。使用光学显微镜观察细胞，确认其已贴壁且状态良好。</li>
		<li>用移液管或真空抽吸装置从培养皿中移除培养基。</li>
		<li>向60 × 15 mm培养皿中轻柔加入5–7 mL无菌室温PBS（磷酸盐缓冲液）。</li>
		<li>轻柔倾斜培养皿，清洗贴壁细胞。</li>
		<li>用移液管或真空抽吸装置移除PBS。</li>
		<li>向细胞中加入1 mL冷PBS（4 °C保存），倾斜培养皿使PBS均匀覆盖所有细胞，室温静置1分钟。</li>
		<li>通过轻敲培养皿、用冷PBS吹打细胞或使用细胞刮刀释放细胞。</li>
		<li>向培养皿中加入9 mL含抗生素培养基。</li>
		<li>在新的60 × 15 mm培养皿中加入9 mL新鲜含抗生素培养基，并从原培养皿中加入1 mL重悬细胞。</li>
		<li>当所需传代的培养皿均已完成接种后，可弃去原培养皿中剩余的重悬细胞。</li>
		<li>将新培养皿置于上述条件（步骤2.2.8）下培养。</li>
		<li>当细胞达到70–80%汇合度时进行后续传代（根据细胞系和培养基不同，约每2天一次）。 
		注意：感染实验前，巨噬细胞至少应传代五次。根据细胞系不同，感染实验应在第25至30代之间完成。超过25–30代后，细胞应冻存或弃用。可根据实验计划选择第2.4或2.5节操作。后续部分将采用第2.4节方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染前巨噬细胞的接种
	<ol>
		<li>执行传代操作步骤2.3.1至2.3.7。</li>
		<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞密度（细胞/mL）。</li>
		<li>将0.3 × 106个巨噬细胞接种至6孔细胞培养板的单个孔中。</li>
		<li>用含抗生素培养基（步骤2.1.1）调整每孔总体积至1 mL。</li>
		<li>重复步骤2.4.3和2.4.4，直至完成8个孔的接种（两个独立培养板中各接种4孔）。</li>
		<li>可选：向剩余两个孔中各加入1 mL室温PBS，以维持培养过程中的湿度。</li>
		<li>将细胞置于步骤2.2.8所述培养条件下培养2天，再进行感染操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染当天巨噬细胞的接种
	<ol>
		<li>执行传代操作步骤2.3.1至2.3.7。</li>
		<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞密度（细胞/mL）。</li>
		<li>将1.2 × 106个巨噬细胞接种至6孔细胞培养板的单个孔中。</li>
		<li>用含抗生素培养基（2.1.1）调整每孔总体积至1 mL。</li>
		<li>重复步骤2.4.3和2.4.4，直至完成8个孔的接种（两个独立培养板中各接种4孔）。</li>
		<li>可选：向剩余两个孔中各加入1 mL室温PBS，以维持培养过程中的湿度。</li>
		<li>将细胞置于步骤2.2.8所述条件下培养3小时，使细胞充分贴壁。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 巨噬细胞的感染 C. neoformans
注意：当细胞融合度达到70-80%时，每孔约有1.2 × 106个巨噬细胞。为实现100:1的感染复数（MOI）目标，每个反应需要1.2 × 108个真菌细胞。实验需设置四个生物学重复样本。
免责声明：在我们的研究团队中，感染复数（MOI）为100:1已获得理想结果，此数值仅供参考。对于感染性更强的病毒，可能需要采用更低的MOI C. neoformans 菌株或韧性较低的巨噬细胞系。感染验证（第3.5节）可用于确定特定条件下的最佳感染复数（MOI） C. neoformans – 巨噬细胞&#160;组合
<ol>
	<li>真菌细胞的制备
	<ol>
		<li>按照步骤1培养C. neoformans至对数生长中期。</li>
		<li>在1,500 × g条件下离心10分钟收集细胞，用无菌室温PBS轻柔洗涤沉淀，并重复洗涤共三次。</li>
		<li>将细胞重悬于不含抗生素的细胞培养基（步骤2.1.2）中，调整浓度至1.2 × 108 个细胞/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>巨噬细胞的制备
	<ol>
		<li>观察6孔板中每孔细胞，确保细胞融合度达到70–80%。或者，也可通过计数使每孔含有约1.2 × 106个巨噬细胞。</li>
		<li>执行步骤2.3.1至2.3.4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>C. neoformans与巨噬细胞的共培养
	<ol>
		<li>将1 mL重悬的C. neoformans细胞（步骤3.1.3）加入已按第3.2节制备好的含巨噬细胞的4个孔中。 
		注：实验开始前需预先计算所需板数。向空孔中加入1 mL不含抗生素的培养基（步骤2.1.2）。</li>
		<li>将细胞置于步骤2.2.8所列条件下孵育3小时。</li>
		<li>使用移液管或真空抽吸装置移除孔板中的细胞培养基。</li>
		<li>轻柔加入1 mL无菌室温PBS。</li>
		<li>轻轻倾斜孔板，以洗涤未贴附或未被吞噬的胞外C. neoformans细胞。</li>
		<li>使用移液管或真空抽吸装置移除PBS，共洗涤三次。重复步骤3.3.4至3.3.5两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>未感染的巨噬细胞
	<ol>
		<li>同样，使用6孔板中的4个孔作为仅含巨噬细胞的对照样本。向这些孔中加入1 mL不含抗生素的培养基（步骤2.1.2）。</li>
		<li>重复步骤3.3.2至3.3.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染验证 
	注：可通过细胞毒性检测评估感染效率。以下方案将重点介绍使用一种细胞毒性检测试剂检测乳酸脱氢酶（LDH）释放的方法。也可使用其他细胞毒性检测试剂。
	<ol>
		<li>C. neoformans感染巨噬细胞的制备
		<ol>
			<li>重复步骤1、2和3（至步骤3.5为止）。如需要，LDH检测可设三个重复。</li>
			<li>完成步骤3.3.6后，向6孔板的每个孔中加入1 mL不含抗生素的培养基（2.1.2）。</li>
			<li>重复步骤2.4.3和2.4.4，直至填满3个孔加3n个孔（其中n为检测的时间点数量）。</li>
			<li>将细胞置于步骤2.2.8所列条件下孵育。</li>
			<li>在选定的时间点（例如1、3、6、12和24小时），根据试剂盒说明书收集上清液以检测LDH释放量。</li>
			<li>在同一时间点，裂解未感染的巨噬细胞，以测定最大细胞毒性值。</li>
			<li>按如下公式计算细胞毒性： 
			<img alt="公式1" src="/files/ftp_upload/61881/61881equ01.jpg" /></li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 样本采集
<ol>
	<li>共培养与未感染巨噬细胞的收集
	<ol>
		<li>向细胞（来自步骤 3.3.6 和 3.4.2）中加入 1 mL 冷 PBS，室温静置 1 分钟。</li>
		<li>通过轻轻敲击培养板或用冷 PBS 轻柔吹打细胞，使细胞脱离培养板。 
		注意：应避免使用细胞刮刀，因其可能导致细胞裂解。</li>
		<li>将重悬的细胞转移至 15 mL 离心管中。</li>
		<li>室温下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>立即进行后续细胞处理（详见步骤 5），或在液氮中速冻后于 -80 °C 保存以备后续处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 细胞蛋白质组
注意：充分裂解需根据所分析的细胞类型进行优化（即循环次数和振幅取决于细胞沉淀量以及探头式超声破碎仪型号的功率百分比）。
<ol>
	<li>感染巨噬细胞裂解
	<ol>
		<li>将已收集的细胞沉淀（步骤 4.1.5）重悬于 300 µL 含新鲜溶解的蛋白酶抑制剂混合片的 100 mM Tris-HCl（pH 8.5）中。 
		注意：实验开始前，将一片蛋白酶抑制剂混合片加入 10 mL 冰冷的 100 mM Tris-HCl（pH 8.5）中溶解。</li>
		<li>将细胞置于冰浴中进行探头超声处理，共 15 个循环，每个循环 30 秒开启、30 秒关闭，以裂解细胞。</li>
		<li>将细胞短暂离心 30 秒，400 x g，注意不要形成紧密沉淀，仅去除管壁上的液体，随后将样品转移至 2 mL 低吸附微量离心管中。</li>
		<li>加入 1/10 体积的 20% SDS，使终浓度为 2%。</li>
		<li>加入 1/100 体积的 1 M 二硫苏糖醇（DTT），使终浓度为 10 mM，并通过移液充分混匀，随后在 95 °C 热金属浴中以 800 rpm 振荡孵育 10 分钟。接着冷却至室温（可在冰上冷却）。</li>
		<li>加入 1/10 体积的 0.55 M 碘乙酰胺（IAA），使终浓度为 55 mM，并通过移液充分混匀。室温避光孵育 20 分钟。</li>
		<li>加入 100% 丙酮，使终浓度为 80% 丙酮，样品于 -20°C 过夜保存，以沉淀蛋白质。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质消化
	<ol>
		<li>次日，将样品在 10,000 x g、4 °C 条件下离心 10 分钟，收集沉淀；弃去上清液，用 500 µL 80% 丙酮洗涤沉淀，共洗涤两次。洗涤后于室温下空气干燥沉淀。</li>
		<li>将蛋白质沉淀重溶于 100 µL 8 M 尿素/40 mM HEPES 中，为确保完全溶解，可在冰水浴中涡旋或超声处理 15 个循环，每个循环 30 秒开启、30 秒关闭。 
		注意：尿素/HEPES 体积的调整取决于沉淀细胞量的大小；若体积有调整，所有后续步骤的体积也需相应调整。</li>
		<li>根据制造商说明书使用蛋白定量试剂盒（如 BCA 蛋白定量法）测定蛋白浓度，并以 8 M 尿素/40 mM HEPES 作为空白对照进行背景校正。</li>
		<li>加入 300 µL 50 mM 碳酸氢铵，使尿素终浓度为 2 M。 
		注意：可在此步骤统一蛋白浓度以利于后续分析；建议消化 100 µg 蛋白，剩余未消化样品可通过液氮速冻后短期储存于 -20 °C 或长期储存于 -80 °C。</li>
		<li>在冰上按 2:50（体积/重量）的比例加入胰蛋白酶/赖氨酰内切酶（trypsin/Lys-C）混合酶，轻轻弹击管壁混匀，室温孵育过夜。</li>
		<li>孵育结束后，加入 1/10 体积的终止液（20% 乙腈，6% 三氟乙酸）终止消化反应，并在室温下以 10,000 x g 离心 5 分钟。</li>
		<li>收集上清液（含已消化的肽段），弃去任何沉淀的杂质或残渣。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肽段脱盐
	<ol>
		<li>向 C18 Stop And Go Extraction（STAGE）小柱（200 µL 移液枪头内含三层 C18 树脂）中加入 100 µL 100% 乙腈以活化，1,000 x g 离心 2 分钟。</li>
		<li>加入 50 µL 缓冲液 B（80%（v/v）乙腈，0.5%（v/v）乙酸），平衡 C18 STAGE 小柱，1,000 x g 离心 2 分钟。</li>
		<li>加入 200 µL 缓冲液 A（2%（v/v）乙腈，0.1%（v/v）三氟乙酸，0.5%（v/v）乙酸），进一步平衡 C18 STAGE 小柱，1,000 x g 离心 3–5 分钟。</li>
		<li>将约 50 µg 已消化的样品加至 C18 STAGE 小柱，1,000 x g 离心 3–5 分钟，或直至样品完全通过小柱。剩余已消化样品用液氮速冻，储存于 -20°C，待后续使用。</li>
		<li>用 200 µL 缓冲液 A 洗涤 C18 STAGE 小柱，1,000 x g 离心 3–5 分钟。</li>
		<li>向 C18 STAGE 小柱中加入 50 µL 缓冲液 B，500 x g 离心 2 分钟，将洗脱的肽段收集至 0.2 mL PCR 管中。</li>
		<li>将洗脱的肽段在真空离心浓缩仪中干燥 30–40 分钟，最高转速。完全干燥的样品可于室温或 -20 °C 储存，直至后续处理。 
		注意：干燥并脱盐后的肽段适用于质谱分析平台的样品提交，可在常温下运输。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 质谱分析
<ol>
	<li>将多肽溶解于 10 &#181;L 缓冲液A，并测定注射约1.5至 3 &#181;g 将肽段上样至质谱柱。上样量取决于仪器型号。</li>
	<li>使用预先设定的乙腈梯度（约5%-60%）在0.5%乙酸溶液中，于目标时间（例如2 h）内通过高效液相色谱分离肽段，随后经电喷雾离子化进入质谱仪。</li>
	<li>使用高分辨率质谱仪以数据依赖性采集模式获取质谱扫描数据（m/z 300 到 1650。 
	注意：梯度百分比和梯度长度由实验和使用者决定。精确的质谱仪设置取决于仪器型号、实验条件和使用者偏好。</li>
</ol>
7. 数据分析
注意：质谱数据可通过多种生物信息学流程进行处理。在本方案中，我们描述了使用公开可用的 MaxQuant 和 Perseus 平台进行数据处理的方法，但建议各用户根据分析需求、个人偏好和使用习惯，评估选择适合的生物信息学工具。
<ol>
	<li>使用 MaxQuant 软件加载未经处理的原始数据文件（直接来自质谱仪）。在修改后的 MaxQuant 搜索参数下进行蛋白质鉴定；采用靶向-诱饵（target decoy）策略，以 1% 的错误发现率（FDR）进行鉴定，要求每种蛋白质至少包含两条唯一肽段。使用 Andromeda 搜索引擎结合从 UniProt 数据库获取的生物体 FASTA 文件（例如 Cryptococcus neoformans H99、Mus musculus），实现对检测到的肽段进行鉴定与定量，并启用“运行间匹配”的无标记定量（label-free quantification）。有关详细教程，请参考 MaxQuant 官方在线资源（见材料表）。</li>
	<li>将 MaxQuant 的输出文件（“proteingroups.txt”）上传至 Perseus 软件。</li>
	<li>使用“基于分类列筛选行”功能，过滤掉可能的假阳性、污染物以及仅由修饰位点肽段组成的条目。</li>
	<li>将数据值转换为 log2 尺度。</li>
	<li>通过为行数据添加分类注释，创建数据集分组。</li>
	<li>根据有效值对数据集进行筛选，以确定蛋白质检出的阈值。 
	注意：为确保分析的严谨性和稳健性，建议采用 >50% 的检出率。例如，若处理了四个重复样本，则至少需保留三个有效值。</li>
	<li>如需要，可通过正态分布填补缺失值。 
	注意：填补值基于正态分布优化生成，为“NaN”占位符随机分配一个合理的 LFQ 强度值，以模拟典型的丰度测量结果。该填补方法为后续需要定量数据的统计分析提供了基础。</li>
	<li>为蛋白质行添加注释信息（如蛋白质名称、基因本体（Gene Ontology）术语）。 
	注意：至此生成的 Perseus 分析流程已构建出一个稳健的框架，可用于进一步的生物信息学处理、统计分析和数据可视化。有关详细教程，请参考 Perseus 官方在线资源（见材料表）。</li>
</ol>

<ol><li>Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+Multi-National+Prevalence+of+Fungal+Diseases-Estimate+Precision%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision.</a> Journal of Fungi. , (2017).</li>
<li>Tugume, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-Associated+cryptococcal+meningitis+occurring+at+relatively+higher+CD4+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts.</a> Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).</li>
<li>Rajasingham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+disease+of+HIV-associated+cryptococcal+meningitis%3A+an+updated+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis.</a> The Lancet Infectious Diseases. , (2017).</li>
<li>Perfect, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antifungal+pipeline%3A+A+reality+check%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The antifungal pipeline: A reality check.</a> Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).</li>
<li>Bermas, A., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combatting+the+evolution+of+anti-fungal+resistance+in+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans.</a> Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).</li>
<li>Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+pathogens%2C+new+tricks%3A+Emerging%2C+drug-resistant+fungal+pathogens+and+future+prospects+for+antifungal+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).</li>
<li>Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Proteomics+of+Fungal+Pathogenesis%2C+Host-Fungal+Interactions%2C+and+Antifungal+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development.</a> Journal of Fungi. , (2019).</li>
<li>Sukumaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+communication+patterns+of+the+innate+immune+system+by+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics.</a> J Leukocyte Biol. , (2019).</li>
<li>Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+interactomics%3A+Considerations+for+the+use+of+co-elution+to+measure+protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li>
<li>Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Coming+Age+of+Complete%2C+Accurate%2C+and+Ubiquitous+Proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes.</a> Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Proteome-wide+Label-free+Quantification+by+Delayed+Normalization+and+Maximal+Peptide+Ratio+Extraction%2C+Termed+MaxLFQ%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li>
<li>Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+and+Absolute+Quantitation+in+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. , (2011).</li>
<li>Zhong, Z., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonization+of+Cryptococcus+neoformans+by+human+anticryptococcal+glucuronoxylomannan+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies.</a> Infection and Immunity. , (1996).</li>
<li>Nicola, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+autophagy+in+immunity+to+Cryptococcus+neoformans+and+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans.</a> Infection and Immunity. , (2012).</li>
<li>Ball, B., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Proteomic+Profiling+of+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2019).</li>
<li>Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectromerty-based+quantitative+proteomics+of+murine-derived+polymorphonuclear+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. , (2019).</li>
<li>Geddes, J. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+profiling+of+Cryptococcus+neoformans+reveals+regulation+of+a+subset+of+virulence-associated+proteins+and+potential+biomarkers+by+protein+kinase+A%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A.</a> BMC Microbiology. , (2015).</li>
<li>Geddes, J. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+protein+kinase+a-regulated+proteome+of+Cryptococcus+neoformans+identifies+a+role+for+the+ubiquitin-proteasome+pathway+in+capsule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation.</a> mBio. 7 (1), 1-15 (2016).</li>
<li>Al Shweiki, M. H. D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Label-Free+Quantification+in+Discovery+Proteomics+and+Impact+of+Technological+Factors+and+Natural+Variability+of+Protein+Abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance.</a> Journal of Proteome Research. , (2017).</li>
<li>Ong, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Isotope+Labeling+by+Amino+Acids+in+Cell+Culture%2C+SILAC%2C+as+a+Simple+and+Accurate+Approach+to+Expression+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+mass+tags%3A+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).</li>
<li>Borner, G. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organellar+Maps+Through+Proteomic+Profiling+-+A+Conceptual+Guide%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Organellar Maps Through Proteomic Profiling - A Conceptual Guide.</a> Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).</li>
<li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+know+the+neighborhood%3A+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).</li>
<li>Kugadas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontline+Science%3A+Employing+enzymatic+treatment+options+for+management+of+ocular+biofilm-based+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2019).</li>
<li>Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Quantitative+Proteomics+Distinguishes+General+and+Site-Specific+Host+Responses+to+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+at+the+Ocular+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface.</a> Proteomics. , (2020).</li>
<li>Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Proteomic+Profiling+ofMurine+Ocular+Tissue+and+theExtracellular+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

该实验方案的关键步骤包括巨噬细胞的制备，以及在尽可能减少细胞损伤的情况下收集共培养样品用于蛋白质处理。在洗涤、接种以及去除贴壁巨噬细胞的过程中，必须轻柔谨慎地操作，以防止细胞在收集前发生不必要的裂解。确定实验所需的正确感染复数（MOI）也至关重要，因为使用过高的MOI接种可能导致巨噬细胞迅速死亡，从而难以收集和处理质谱（MS）样品；相反，MOI过低则会导致被吞噬的真菌细胞数量减少，从而限制在生物系统中对真菌蛋白的检测。为克服这些限制，我们建议通过预实验测试不同MOI条件，并结合细胞死亡检测方法（例如LDH定量）来确定能够引发宿主反应但又不会在样品收集前导致宿主细胞死亡的真菌细胞数量。在本研究中，我们的目标是鉴定与感染相关的真菌蛋白，因此需要采用较高的MOI（100:1），以便在大量宿主蛋白背景中充分检测到真菌蛋白。我们通常在开展完整实验前常规进行巨噬细胞毒性检测，以评估MOI对宿主细胞死亡的影响。此外，C. neoformans细胞与巨噬细胞共孵育的时间点也十分关键，因为该真菌可能具有较大的多糖荚膜，巨噬细胞需要更长时间才能完成吞噬。在本实验中，我们选择3小时的共培养孵育时间，因为在此时间点我们获得了较全面的真菌蛋白质...

侵袭性真菌感染的发病率正在急剧上升，且与极高的死亡率相关，这种情况最常出现在具有免疫缺陷倾向的个体中1。Cryptococcus neoformans 是一种臭名昭著的机会性真菌病原体，能够在宿主巨噬细胞内生存。抗真菌治疗不足会导致真菌播散，并引发危及生命的隐球菌性脑膜炎和脑膜脑炎2,3。全球免疫功能低下人群的增加，导致抗真菌药物的使用需求同步上升，而包括 C. neoformans 在内的许多真菌物种对此类药物的耐药性也日益增强4,5,6。因此，迫切需要采用强大且高效的技術手段，以回答有关宿主防御反应和微生物致病机制的关键生物学问题。
质谱技术（MS）的新时代技术进步，包括强大的计算和生物信息学分析流程的建立，为大规模宿主-病原体研究的整合分析提供了基础7,8。传统的以致病过程为导向的蛋白质组学分析通常仅从宿主或病原体单一方面来描述感染过程，所采用的方法包括蛋白质相关性分析、亲和层析联合蛋白质组学以及相互作用组学等全面的技术手段9。在宿主系统中研究危险病原体的毒力具有重要的临床意义；然而，过去在单次实验中同时实现双重视角分析被认为是难以实现的。例如，病原体在感染过程中的蛋白质信号常常被大量存在的宿主蛋白所掩盖，导致低丰度真菌蛋白的检测灵敏度降低7。此外，样本的高度复杂性使得单个实验体系中存在大量待研究靶点，因而难以阐明特定病原体蛋白的作用机制。
自下而上的蛋白质组学是一种常用的质谱技术，可实现便捷的样品制备，其中通过序列特异性的酶解反应生成肽段，随后经液相色谱分离，并利用质谱进行鉴定和定量10,11。本文介绍一种基于数据依赖性采集策略的方法，旨在实现对基于感染的蛋白质组（即“感染体”）的无偏覆盖。具体而言，非标记定量（LFQ）摆脱了对化学或代谢标记物的依赖，能够在多个蛋白质组之间稳健且准确地识别蛋白质水平的变化，同时减少样品处理和操作步骤12,13。该通用方法可在特定时间点检测细胞内产生的全部蛋白质，而无需预设任何蛋白质表达情况，从而可能发现对感染过程至关重要的新机制。
本文所述的工作流程经过优化，旨在研究在模拟感染宿主免疫细胞条件下 C. neoformans 的蛋白质水平变化（图1）。该方法无需依赖细胞类型的分离与纯化，而是同时提取宿主和病原体的蛋白质组，并利用两种生物体特异性的数据库通过生物信息学手段区分物种特异性的蛋白质表达。此方法的优势在于可对任意数量的样本进行处理，而无需同位素标记研究或组分分离所必需的额外且昂贵的制备步骤。此外，该工作流程支持经过优化的蛋白质提取方案，可推广应用于多种能够靶向并感染宿主免疫细胞的真菌和细菌病原体。总体而言，本实验方案详细阐述了完成无偏倚蛋白质提取及样本处理以进行高分辨率质谱分析的步骤，继而进行数据与统计分析，从而全面揭示在感染过程中具有重要意义的真菌蛋白质，并同时系统性地描绘宿主防御反应的特征。

<table><tbody><tr><td>100 mM Tris-HCl，pH 8.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>4&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>60 x 15 mm 培养皿，Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>174888</td><td></td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>乙腈，质谱级</td><td>Pierce</td><td>TS-51101</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1099510001</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34850-1L</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵（ABC）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A643-500</td><td>配制 50 mM ABC 储存液，室温下可稳定保存一个月。</td></tr><tr><td>Bel-Art&amp;trade; HiFlow 真空抽滤收集系统</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-717-300</td><td>非必需，可用移液管移除培养基。</td></tr><tr><td>C18 树脂</td><td>3M Empore</td><td>3M2215</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>VWR</td><td>10062-906</td><td>非必需，可采用其他方法释放巨噬细胞。</td></tr><tr><td>离心式真空浓缩仪</td><td>Eppendorf</td><td>07-748-15</td><td></td></tr><tr><td>完整过滤装置</td><td>VWR</td><td>10040-436</td><td></td></tr><tr><td>锥形离心管（15 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 自动细胞计数仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>非必需，可使用血细胞计数板替代。</td></tr><tr><td>CytoTox 96 非放射性细胞毒性检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>G1780</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0861</td><td>配制 1 M DTT 大量储存液，速冻后于 -20 &amp;deg;C 保存备用。每次使用后丢弃（避免反复冻融）。</td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含 GlutaMAX 补充剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12483020</td><td>60&amp;deg;C 孵育 30 分钟进行热灭活。分装为 50 mL 份量，速冻保存。使用前解冻。</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>VWR</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>配制 40 mM HEPES/8 M 尿素大量储存液，速冻后于 -20&amp;deg;C 保存备用。每次使用后丢弃（避免反复冻融）。</td></tr><tr><td>高效液相色谱系统</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC140</td><td>梯度长度根据样品复杂性确定，建议感染体样品使用 120 分钟梯度。</td></tr><tr><td>高分辨率质谱仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>726042</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺（IAA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6125</td><td>配制 0.55 M 大量储存液，速冻后于 -20&amp;deg;C 保存备用。每次使用后丢弃（避免反复冻融）。</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030081</td><td>可分装后冷冻保存。使用前解冻。</td></tr><tr><td>LoBind 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>13-698-794</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>https://maxquant.org/</td><td></td><td>MaxQuant 是一个公共平台，提供教程（如 MaxQuant 暑期学校），介绍大规模质谱数据集的计算分析步骤。</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>13864457</td><td></td></tr><tr><td>青霉素:链霉素 10k/10k</td><td>VWR</td><td>CA12001-692</td><td>可分装后冷冻保存。使用前解冻。</td></tr><tr><td>肽段分离柱</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ES803</td><td></td></tr><tr><td>Perseus 软件</td><td>http://maxquant.net/perseus/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>VWR</td><td>CA12001-676</td><td>无需购买。也可自行配制，但使用前必须进行无菌过滤。</td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;23225</td><td></td></tr><tr><td>移液管，一次性血清移液管（10 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>移液管，一次性血清移液管（25 mL）Basix</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955235</td><td></td></tr><tr><td>探针式超声破碎仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>100-132-894</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28364</td><td>20%（w/v）</td></tr><tr><td>分光光度计（Nanodrop）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>STAGE 柱离心机</td><td>Sonation</td><td>STC-V2</td><td></td></tr><tr><td>温控摇床</td><td>VWR</td><td>NO89232-908</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>85183</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/Lys-C 蛋白酶混合物，质谱级</td><td>Pierce</td><td>A40007</td><td>-20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>Bransonic</td><td>A89375-450</td><td>存放于冷藏室（4°C）</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U1250-1KG</td><td>配制 40 mM HEPES/8 M 尿素大量储存液，速冻后于 -20 &amp;deg;C 保存备用。每次使用后丢弃（避免反复冻融）。</td></tr><tr><td>酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基</td><td>BD Difco</td><td>BM20</td><td></td></tr></tbody></table>

基于无标记定量蛋白质组学的工作流程用于发现驱动型宿主-病原体相互作用

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

基于质谱（MS）的定量蛋白质组学技术成就为分析生物体在不同条件下的全局蛋白质组开辟了诸多尚未探索的途径。将这一强大策略应用于微生物病原体与宿主之间的相互作用，可全面表征感染过程中的双方动态。本文所述工作流程描述了在永生化巨噬细胞存在下，对新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）感染体进行无标记定量（LFQ）分析。新型隐球菌是一种真菌性兼性胞内病原体，可引发致命的隐球菌病。该实验方案详细说明了在同一实验中对病原体和哺乳动物细胞进行适当蛋白质制备的技术，从而为液相色谱（LC）-MS/MS分析提供合适的肽段样本。LFQ方法具有高通量和通用性，能够实现广泛动态范围的蛋白质鉴定与定量，并可推广至任何宿主-病原体感染体系，同时保持极高的灵敏度。该方法经过优化，可用于在模拟感染条件下系统性地记录病原体无偏倚的蛋白质丰度谱。具体而言，本文所展示的方法为研究C. neoformans的致病机制提供了关键信息，例如与毒力相关的蛋白质表达，并鉴定出宿主在应对微生物入侵时发生响应的关键蛋白质。

上述方案能够在单次实验中同时鉴定并定量来自真菌病原体C. neoformans和宿主巨噬细胞的蛋白质。共培养后，细胞被一同收集并处理，随后基于各物种特有的肽段谱图通过生物信息学方法进行分离。该方法在解析感染过程中宿主与病原体之间相互作用方面具有强大优势。实验中鉴定出的蛋白质数量取决于起始材料、样品制备方法、色谱梯度长度、质谱仪设备以及生物信息学分析流程。采用本方案时，我们通常可鉴定出约8,000个蛋白质，其中包括约1,500个来自C. neoformans的蛋白质和约6,500个宿主蛋白质。在完成数据集处理后，我们生成主成分分析（PCA）图以观察驱动分析结果的关键因素（图2A）。在此图中，数据分离的最大组分表现为感染样本与非感染样本之间的差异，这与实验设计预期一致（组分1，79.8%）；第二组分则反映了样本间的生物学变异（组分2，5.7%）。接下来，通过皮尔逊相关性分析结合欧氏距离的层次聚类对样本进行分组，并评估重复样本间的变异性（图2B）。在我们的分析中，感染样本与非感染样本呈现出...

本文介绍了一种基于质谱蛋白质组学的方法，用于在感染过程中分析宿主与病原体之间的相互作用。该方法通过非标记定量技术，在单次实验中同时检测宿主（例如巨噬细胞）和病原体（例如Cryptococcus neoformans）蛋白质丰度的变化。

基于质谱（MS）的定量蛋白质组学的技术进步为分析生物体的……开辟了许多尚未探索的新途径

本方案从宿主和病原体两个角度研究真菌感染，以鉴定对疾病发生至关重要的生物系统间相互作用。我们可在单次实验中同时检测真菌和宿主的蛋白质，并识别仅在感染过程中表达的真菌蛋白，这些蛋白代表了新的与感染相关的蛋白。尽管我们的研究重点是通过揭示新型抗毒力策略来治疗真菌感染，但所采用的蛋白质组学与生物信息学分析流程具有普适性，可应用于多种生物系统。我们的方法为研究不同病原体及多种免疫反应奠定了基础，可用于深入揭示隐球菌与先天免疫系统之间的关系。巨噬细胞对病原体的反应以及检测到足够的真菌蛋白至关重要。因此，建议针对每种物种测试并优化感染复数（MOI）和时间点。由于巨噬细胞和真菌细胞培养可能具有挑战性，了解共培养后可能出现的情况非常重要。可视化结果可帮助研究人员更有信心地实施该实验操作。为准备用于巨噬细胞感染的真菌细胞，需从处于对数中期的培养物中收集并离心 C. neoformans 细胞，随后在相同的离心条件下，用 1 毫升室温 PBS 轻柔洗涤三次。最后一次洗涤后，将真菌细胞重悬于无抗生素的细胞培养基中，浓度为每毫升 1.2 × 10⁸ 个细胞，并向六孔巨噬细胞培养板中每个含 70% 至 80% 汇合度的孔加入 1 毫升真菌细胞悬液。然后，将培养板放入细胞培养箱中孵育 3 小时。小心倾斜培养板，使每个孔用 1 毫升 PBS 轻柔地洗涤 3 次，每次洗涤每孔使用 1 毫升 PBS。为测定最后一次洗涤后的感染效率，向六孔板的每个孔中加入一毫升不含抗生素的培养基，并将该板放入细胞培养箱中。在适当的实验时间点，收集每个孔中的上清液，并根据标准方案测定各孔中乳酸脱氢酶（LDH）的含量。在同一时间点，裂解未感染的巨噬细胞，以确定最大细胞毒性值。随后可使用所示公式计算细胞毒性。对于未感染的巨噬细胞收集与共培养，向每孔未感染的巨噬细胞中加入一毫升冷PBS。一分钟后，轻轻敲击培养板，使细胞从孔底脱落，并将细胞悬液汇集至一个15毫升离心管中。通过离心收集细胞，并彻底去除上清液，以便将沉淀物立即在液氮中快速冷冻，随后于-80°C保存。对实验流程的数据集进行主成分分析表明，与预期一致，数据中最大分离组分是感染样本与非感染样本之间的差异。样本的第二个区分特征是其生物学变异性。通过欧氏距离进行层次聚类并结合皮尔逊相关性分析，可明显区分感染样本与非感染样本，其重复样本的可重复性范围为95%至96%。可采用经Benjamini-Hochberg错误发现率校正的Student's t检验，以鉴定感染组与非感染对照组之间丰度存在显著差异的蛋白质。在此分析中，共鉴定出117种在感染后表达水平发生显著变化的宿主蛋白质。值得注意的是，如预期所示，感染期间真菌蛋白质的丰度也显著增加。在共培养、洗涤和样品收集过程中，轻柔处理巨噬细胞至关重要。通过明确病原体如何适应宿主以及宿主如何抵御感染，微生物学和免疫学领域获得了新的认识。

label-free-quantitative-proteomics-workflow-for-discovery-driven-host

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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使用光镊技术进行活细胞动态成像研究宿主-病原体相互作用

探索基于质谱的无标签定量蛋白质组学方法，用于分析宿主巨噬细胞与新型隐球菌的相互作用。该技术可同步检测宿主与病原体蛋白，为感染相关蛋白研究提供新见解。

基于无标记定量蛋白质组学的工作流程用于发现驱动型宿主-病原体相互作用

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