Name: 监视分泌细菌毒力因子的组装使用站点特定的交联 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: 学习位点特异性光交联结合脉冲追踪标记技术，用于在活细胞中动态监测蛋白质相互作用。该方法利用琥珀抑制技术掺入光活化氨基酸，实现时间分辨的相互作用事件捕获。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到了糖尿病与消化及肾脏疾病研究所院内研究计划的支持。

1. 质粒构建
<ol>
	<li>将编码目标蛋白的基因克隆至合适的表达载体后，使用定点突变试剂盒在所需位置引入琥珀突变。 
	注意：结构信息和表面暴露预测可作为确定突变位点的有用参考。由于琥珀抑制和交联的效率可能差异较大，应于多个位点引入琥珀突变。此外，由于Bpa是酪氨酸和苯丙氨酸的类似物，建议在通常编码大疏水性氨基酸的位置引入琥珀突变，以最小程度干扰蛋白的结构与功能。最后，在选择表达载体时需注意，目标蛋白的过度表达可能限制Bpa的掺入效率。</li>
</ol>
2. 培养物制备
<ol>
	<li>使用电穿孔法将含有琥珀抑制系统（pDULE-pBpa；参见参考文献4）的质粒转化至合适的 E. coli 菌株中，并共转化一个编码目标蛋白且带有琥珀突变的相容性质粒。</li>
	<li>将细胞涂布于含有适当抗生素的 LB 琼脂平板上（使用 5 µg/ml 四环素筛选 pDULE-pBpa）。在 37 °C 下过夜培养。</li>
	<li>次日，从单菌落接种 3–5 ml 含有 0.2% 甘油、除甲硫氨酸和半胱氨酸外的所有 L-氨基酸（40 µg/ml）以及抗生素的 M9 培养基中，进行过夜培养14。在 37 °C 下培养。</li>
	<li>第二天，将过夜培养物在室温下以 2,500 × g 离心 5 分钟，收集菌体。用 5 ml 新鲜 M9 培养基重悬菌体，重复离心一次。 
	注意：此洗涤步骤至关重要，可维持编码氨苄青霉素抗性基因的质粒稳定性，因为过夜培养物中残留的少量 β-内酰胺酶会降解新加入的氨苄青霉素，从而在细胞大量生长前导致其失活。</li>
	<li>将菌体重悬于 2 ml 新鲜培养基中，并使用分光光度计测定细胞浓度（OD550）。</li>
	<li>将细胞接种至含有 50 ml M9 培养基和抗生素的 250 ml 锥形瓶中，使 OD550 达到 0.03。在 37 °C 摇动水浴中培养。</li>
</ol>
3. Bpa 掺入及光交联前准备
注意：以下所述方案适用于包含三个时间点（0、1 和 5 分钟）的样品时间序列实验。若需设置不同数量的时间点，请相应调整体积。该实验流程的示意图见图&#160;1。
<ol>
	<li>在培养过程中，用 1 M NaOH 配制新鲜的 1 M（1,000 倍）Bpa 溶液（将 27 mg Bpa 溶于 100 μl 1 M NaOH 中）。使用避光管保存溶液，避免光照。</li>
	<li>当培养物达到对数早期至中期（OD550=0.2）时，向每份培养物中加入 50 μl 1 M Bpa。逐滴加入 Bpa，同时轻轻旋转烧瓶以避免沉淀。随后，加入所需的诱导剂以启动琥珀突变体的表达。继续在 37 °C 下孵育培养物额外 30 分钟。</li>
	<li>在 30 分钟诱导期间，标记六个一次性 15 ml 离心管，标注时间点（0 分钟、1 分钟、5 分钟）以及 &#34;+ UV&#34; 或 &#34;- UV&#34;。将离心管置于冰上。</li>
	<li>另准备一个装满冰的冰桶，并将 6 孔细胞培养板放置于冰上。</li>
	<li>解冻高比活性（1,000 mCi/mmol）&#160;35S-甲硫氨酸和 35S-半胱氨酸（或两者的预混制剂）用于脉冲标记，并配制（或解冻）非放射性 L-半胱氨酸和 L-甲硫氨酸溶液（各 100 mM）用于追踪。</li>
	<li>在放射性标记前 5 分钟&#160;打开紫外灯。 
	注意：紫外灯应可调节，以便将其置于多孔板样品上方约 3–4 cm 处。</li>
	<li>向标记为 &#34;- UV&#34; 的每个离心管以及多孔板中的两个孔中加入冰（约 2 ml）。 
	注意：应在 5 分钟&#160;时间点前立即向第三个孔中加入冰。必须将冰直接加入离心管和孔中，以便在每个时间点立即终止细胞内反应，从而准确获得特定生化通路的 &#34;快照&#34;。</li>
	<li>在 30 分钟&#160;诱导期结束时，将 25 ml 培养物转移至预热的 125 ml 一次性锥形瓶中。将锥形瓶放入 37 °C 摇动水浴中。</li>
</ol>
4. 脉冲-追踪标记与紫外照射
注意：脉冲-追踪标记和紫外照射实验步骤繁多，需及时操作，并要求有充分的组织和预先准备。所有试剂和试管应便于取用。以下提供了一个包含 0、1&#160;和 5 分钟&#160;时间点的实验方案。
<ol>
	<li>在0:00（分:秒）时，将25 ml培养物转移至125 ml锥形瓶中。</li>
	<li>在 0:30 时加入 30 µCi/ml 放射性氨基酸；迅速轻轻摇动以混匀。将烧瓶放入 37&#160;°C 摇床水浴</li>
	<li>在1:00时加入250 µl的100 mM甲硫氨酸-半胱氨酸溶液；迅速涡旋混匀。
	<ol>
		<li>立即将4 ml培养物移液至含有冰块的预冷多孔板的其中一个孔中。再将第二个4 ml等分试样移液至标记的15 ml离心管中 &#34;0 分钟 - 紫外线&#34;将烧瓶放回水浴中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在2:00时，将4 ml培养物用移液器转移至含有冰的预冷多孔板的第二个孔中。另取4 ml等分试样，用移液器转移至标记的15 ml离心管中 &#34;1 分钟 - 紫外线&#34;.&#160;将烧瓶放回水浴中。</li>
	<li>在6:00时，将4 ml培养液移入预冷多孔板中含冰的第三个孔内。另取4 ml等分试样移入标记的15 ml离心管中 &#34;5 分钟 - 紫外线&#34;.</li>
	<li>将装有培养板的冰桶置于预热的紫外灯下，每个样品单独照射4分钟。 
	注意：在时间点间隔至少为 4 min 的实验中&#160;每个样本在移液至多孔板后应立即进行辐照。</li>
	<li>将细胞转移至已标记的预冷15 ml离心管中 &#34;0 分钟 +UV&#34;，1 分钟 +UV&#34;, 等等.</li>
	<li>以 2,500 x g 离心 10 分钟&#160;4 ℃时&#160;°C.</li>
	<li>将每个样品重悬于 300 µl M9 培养基或 PBS 中，并加入 33 µl 100% 冷三氯乙酸（TCA）以沉淀蛋白质。在微量离心机中以最高速度离心 TCA 沉淀物 10 分钟。&#160;并移除上清液。此时样品可在 -20℃ 保存&#160;°C.</li>
</ol>
5. 免疫沉淀与交联产物检测
<ol>
	<li>向每个样品中加入 50 µl 溶解缓冲液（15% 甘油、200 mM Tris 碱、15 mM EDTA、4% SDS、2 mM PMSF），在 95&#160;°C 振荡加热 5 分钟&#160;，以溶解沉淀的蛋白质。</li>
	<li>加入 1 ml 放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（50 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl、1.0% Igepal CA-630、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS），并使用每份样品的五分之一至二分之一进行标准免疫沉淀15。 
	注意：Igepal CA-630（辛基苯基-聚乙二醇）用于替代已不再商业供应的 NP-40。这两种化合物在化学上无法区分。</li>
	<li>通过 SDS-PAGE 分离免疫沉淀的蛋白质。染色、脱色&#160;并干燥凝胶。</li>
	<li>将凝胶置于磷屏上过夜曝光，并使用磷光成像仪检测放射性蛋白质（包括交联产物）。</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).</li>
<li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+large-scale+data+sets+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions.</a> Nature. 417, 399-403 (2002).</li>
<li>Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+a+photocrosslinking+amino+acid+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli.</a> PNAS. 99, 11020-11024 (2002).</li>
<li>Farrell, I. S., Toroney, R., Hazen, J. L., Mehr, R. A., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-cross-linking+interacting+proteins+with+a+genetically+encoded+benzophenone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone.</a> Nat. Methods. 2 (5), 377-384 (2005).</li>
<li>Wittelsberger, A., Mierke, D. F., Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+ligand-receptor+interfaces%3A+approaching+the+resolution+limit+of+benzophenone-based+photaffinity+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Mapping ligand-receptor interfaces: approaching the resolution limit of benzophenone-based photaffinity scanning.</a> Chem. Biol. Drug Des. 71, 380-383 (2008).</li>
<li>Ieva, R., Tian, P., Peterson, J. H., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+and+spatially+restricted+interactions+of+assembly+factors+with+an+autotransporter+beta+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Sequential and spatially restricted interactions of assembly factors with an autotransporter beta domain.</a> PNAS. 108, 383-391 (2011).</li>
<li>Wang, F., Robbins, S., Guo, J., Shen, W., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Deiters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+amino+acids+with+novel+reactivity+to+the+genetic+code+of+Saccharyomycescerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharyomycescerevisiae.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 11782-11783 (2003).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Brock, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+repertoire+of+the+methylotrophic+yeast+Pichiapastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic yeast Pichiapastoris.</a> Biochemistry. 48 (12), 2643-2653 (2009).</li>
<li>Hino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+photo-cross-linking+in+mammalian+cells+by+site-specific+incorporation+of+a+photoreactive+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid.</a> Nat. Methods. 2 (3), 201-206 (2005).</li>
<li>Liu, W., Brock, A., Chen, S., Chen, S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 4 (3), 239-244 (2007).</li>
<li>Leyton, D. L., Rossiter, A. E., Henderson, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+self+sufficiency+to+dependence%3A+mechanisms+and+factors+important+for+autotransporter+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">From self sufficiency to dependence: mechanisms and factors important for autotransporter biogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 10 (3), 213-225 (2012).</li>
<li>Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+an+autotransporter+passenger+domain+with+BamA+during+its+translocation+across+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Interaction of an autotransporter passenger domain with BamA during its translocation across the bacterial outer membrane.</a> PNAS. 106, 19120-19125 (2009).</li>
<li>Pavlova, O., Peterson, J. H., Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+link+between+barrel+assembly+and+the+initiation+of+autotransporter+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mechanistic link between barrel assembly and the initiation of autotransporter secretion.</a> PNAS. 110, (2013).</li>
<li>Harlow, D., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+D+%22Using+antibodies%3A+a+laboratory+manual%22">Using antibodies: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laborator Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).</li>
<li>Barnard, T. J., Dautin, N., Lukacik, N., Bernstein, P., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autotransporter+structure+reveals+intra-barrel+cleavage+followed+by+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autotransporter structure reveals intra-barrel cleavage followed by conformational changes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (12), 1214-1220 (2007).</li>
<li>Akiyama, Y., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SecY+protein%2C+a+membrane-embedded+secretion+factor+of+E.+coli%2C+is+cleaved+by+the+ompT+protease+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">SecY protein, a membrane-embedded secretion factor of E. coli, is cleaved by the ompT protease in vitro.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 167 (2), 711-715 (1990).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本文介绍了一种将位点特异性光交联与脉冲-追踪标记相结合的方法，用于研究目标蛋白与活细胞中其他组分之间相互作用的动态过程。该方法特别适用于研究蛋白质依次与其他因子发生相互作用的多步骤过程。与传统的化学交联方法不同，位点特异性光交联能够提供有关目标蛋白各个片段甚至单个残基状态的详细信息。这些信息在分析具有多个独立结构域或模块的蛋白质时尤为有价值，或者如本文所示，在分析那些残基位置相对紧密但分别与寡聚复合物中不同亚基接触的蛋白质时也极为重要。该方法最大的优势或许在于，它能够提供多步骤通路中事件发生的顺序以及蛋白质-蛋白质相互作用动力学的信息。此外，在目标蛋白合成过程中即引入交联基团，可避免耗时的化学反应操作，也无需用可能以不可预测方式改变细胞天然环境的化学试剂处理细胞。原则上，使用长波长紫外光激活Bpa对细胞组分的损伤较小。
影响本方法成功的关键技术因素是琥珀密码子抑制效率和紫外光诱导交联的效率。可通过测定全长蛋白与在琥珀密码子处发生翻译终止所产生的截短蛋白的比值来评估琥珀密码子抑制效率。琥珀密码子抑制效率明显受突变位置（即&#160;翻译上下文）的影响，但也可能受到整...

为了明确某种目标蛋白在生物通路中的作用、理解其组装过程或阐明其作用机制，通常必须识别并表征该蛋白与其他细胞组分之间的相互作用。目前有多种常用方法可用于研究蛋白-蛋白相互作用，但这些方法均存在一定的局限性。最简单的无偏倚方法是共纯化（或称免疫共沉淀），用以鉴定与目标蛋白结合的其他蛋白；但该方法要求蛋白复合物在纯化过程中保持完整。弱相互作用或瞬时相互作用可通过化学交联加以稳定，但这种方法通常需要使用通过蛋白质序列中广泛分布的伯胺基团进行连接的化合物，从而可能产生复杂且难以解释的交联图谱，尤其是在目标蛋白属于多蛋白复合物组分的情况下。此外，由于化学交联剂的间隔臂长度通常超过10 Å，因此可能与邻近但并不直接与目标蛋白相互作用的蛋白形成共价键。亲和层析和双杂交筛选等方法也常用于鉴定蛋白-蛋白相互作用。然而，前者需要在能够促进具有生理意义的相互作用的条件下进行，因而无法用于检测弱相互作用；后者则要求结合相互作用能够在宿主生物体中被复制，并且在目标蛋白及其结合伙伴被构建成融合蛋白时仍能维持。双杂交方法还容易产生假阳性结果2。一旦确认了蛋白-蛋白相互作用，通常还需要大量工作来定位相互作用位点。传统方法最显著的缺陷可能是：它们无法提供有关分子间相互作用的时间顺序或结合动力学的任何信息。
本文介绍了一种简单的方法，克服了其他用于研究蛋白质-蛋白质相互作用方法的一些局限性。首先，在编码目标蛋白质的基因中引入单个琥珀突变。随后，该琥珀突变体与一种琥珀抑制型tRNA以及来源于Methanococcus jannaschii的氨酰-tRNA合成酶共表达，该合成酶经过改造，仅在琥珀密码子处插入光活化氨基酸类似物对苯甲酰苯丙氨酸（Bpa）3。用长波长紫外光（UV）（约365 nm）照射细胞，可促使Bpa与距离约3-8 Å范围内的蛋白质之间形成共价键4,5。在某些实验条件下，活化的Bpa也可与细胞中的非蛋白质组分（如脂质和核酸）形成交联6。在琥珀密码子处终止的分子通常可在SDS-PAGE上与全长蛋白明显区分，并且不能与其他蛋白质交联。通过在交联前对细胞进行脉冲-追踪放射性标记，然后对交联产物进行免疫沉淀或亲和纯化，可确定蛋白质-蛋白质相互作用的顺序和持续时间。获取分子间相互作用的时间信息，对于研究目标蛋白在有序的多步骤组装、转运或信号通路中的动态过程，以及鉴定通路中间体具有特别重要的价值。与化学交联类似，位点特异性交联可在生理条件下检测蛋白质-蛋白质相互作用，但由于交联剂仅引入单一位置，因此更有利于分析蛋白质各个片段与其他因子之间的相互作用。这一位点特异性交联的独特优势在目标蛋白含有多个可能与不同结合伴侣相互作用的结构域或区段时尤为突出。此外，位点特异性交联还可与质谱等方法结合使用，以精确绘制介导蛋白质-蛋白质相互作用的关键残基。尽管该方法在E. coli中进行了优化，但已有报道表明，通过琥珀密码子抑制将光活化氨基酸类似物插入蛋白质的过程也已在分枝杆菌（Mycobacterium）、酵母和哺乳动物细胞中实现7-11。因此，原则上本方法也可应用于其他系统。
我们已广泛使用该方法来鉴定促进EspP生物合成的分子间相互作用，一种 E. coli O157:H7 毒力因子。EspP 属于一类被称为 &#34;自转运蛋白&#34; 含有一个大的N端胞外结构域（&#34;乘客结构域&#34;）和一个C端结构域（&#34;b结构域&#34;）折叠成圆柱形的β桶结构，并将该蛋白质锚定于外膜（OM）12乘客区室穿过外膜的转运机制长期以来一直是个未解之谜。与其他所有细菌细胞表面蛋白一样，EspP必须依次穿过内膜，经由周质空间（内膜与外膜之间的区域）转运，并被靶向定位至外膜，这一过程包含一系列有序的事件。在穿过外膜之后，EspP的乘客区室还会通过蛋白水解切割与β区室分离，并从细胞表面释放。通过将位点特异性交联技术与脉冲-追踪放射性标记相结合，我们发现该蛋白的两个区室最初均在周质中与分子伴侣Skp发生相互作用。6随后，β结构域的各个片段以立体特异性方式与一种称为Bam复合物的异源寡聚体组分相互作用，该复合物通过一种尚未明确的机制催化β桶状蛋白整合到细菌外膜中。尤为引人注意的是，我们发现当乘客结构域穿过外膜时，其与Bam复合物的一个亚基（BamA）存在接触。13我们的研究结果使我们能够构建出一个关于自转运蛋白组装的详细模型14 并暗示Bam复合物在乘客结构域跨外膜转运过程中的作用。

<table><tbody><tr><td>QuikChange II 定点突变试剂盒</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>BPA (H-p-Bz-Phe-OH)</td><td>Bachem</td><td>F-2800</td><td></td></tr><tr><td>TRAN&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt;S-标记物，代谢标记试剂（&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt;S-L-蛋氨酸和 &lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt;S-L-半胱氨酸，&gt;1,000 Ci/mmol）</td><td>MP Biomedicals</td><td>51006</td><td></td></tr><tr><td>Spectroline SB-100P 超高强度紫外灯，365 nm</td><td>Spectronics Corporation</td><td>SB-110P</td><td></td></tr><tr><td>Spectroline 替换灯泡 100S</td><td>Spectronics Corporation</td><td>11-992-15</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 组织培养板，6 孔</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>一次性 125 ml 锥形瓶</td><td>Corning</td><td>430421</td><td></td></tr><tr><td>Innova 3100 摇动水浴箱</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

利用位点特异性交联监测分泌型细菌毒力因子的组装

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

本文介绍了一种用于检测和分析目标蛋白与其他因子之间动态相互作用的方法 体内我们的方法基于琥珀抑制技术，该技术最初由 Peter Schultz 及其同事开发。1首先在目标蛋白编码基因的特定位点引入琥珀突变。随后将该琥珀突变体在 E. coli 以及编码琥珀抑制型tRNA和氨酰-tRNA合成酶的基因，这些基因来源于 Methanococcus jannaschii利用该系统，可将光激活氨基酸类似物对苯甲酰基苯丙氨酸（p-benzoylphenylalanine, Bpa）插入至琥珀密码子。随后用紫外光照射细胞，使Bpa残基与距离在3–8 Å范围内的蛋白质发生共价交联。通过将光交联与脉冲-追踪标记及目标蛋白的免疫沉淀相结合，可监测数秒至数分钟内发生的蛋白质-蛋白质相互作用变化。我们已优化该方法用于研究一种细菌毒力因子的组装过程，该因子由两个独立结构域组成：一个整合于外膜的结构域和一个转位至胞外空间的结构域。但该方法亦可用于研究原核与真核细胞中多种不同的组装过程及生物学通路。原则上，可通过质谱分析鉴定与目标蛋白相互作用的因子，甚至相互作用因子中具体参与结合的氨基酸残基。

我们采用位点特异性光交联技术，以鉴定在 EspP 转运至外膜（OM）过程中与其相互作用的蛋白质。在本实验中，将 EspP 第1113位和第1214位氨基酸的苯丙氨酸密码子替换为琥珀终止密码子。这两个位点均位于β结构域中，该结构域可整合入外膜并作为膜锚定部分。EspPβ结构域的晶体结构16显示，这两个残基位于β桶的周质侧，彼此间隔约~120°（见图2和图3）。将 E. coli AD20217菌株转化，使其携带 pDULE-pBpa 质粒以及编码两种 EspP 琥珀突变体之一的质粒（pRI22）13。加入 IPTG 诱导 EspP 表达后，进行脉冲-追踪标记实验，并在0、1和5分钟时间点收集样品。每份样品的一半进行紫外照射，另一半则作为未照射对照。随后使用针对 EspP C端肽段及其他蛋白的抗血清进行免疫沉淀（具体如后所述）。免疫沉淀的蛋白质通过 SDS-PAGE 分离。
使用C端抗...

本文介绍了脉冲-追踪放射性标记与位点特异性光交联技术相结合的方法，用于监测目标蛋白与大肠杆菌（E. coli）中其他因子之间的相互作用。与传统的化学交联方法不同，该方法可在活细胞内获得有序组装途径的高分辨率“快照”。

本文介绍了一种在活体条件下检测和分析目标蛋白与其他因子之间动态相互作用的方法。本方法基于……

以下实验的总体目标是研究活细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的动态过程。首先在大肠杆菌中表达目标蛋白，将氨基酸类似物苯甲酰苯丙氨酸特异性地引入蛋白的特定位置，并通过脉冲-追踪放射性标记方法对同步合成的小部分蛋白质分子进行标记。第二步。在追踪过程中不同时间点收集的细胞样品，通过照射诱导目的蛋白与其相互作用因子之间形成共价键。随后使用特异性抗体对蛋白进行免疫沉淀，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，以鉴定相互作用因子。根据交联产物电泳迁移率的变化，获得结果显示目的蛋白与其他细胞内因子之间的相互作用随时间发生动态变化。该技术相较于现有方法（如共免疫沉淀或化学交联）的主要优势在于，能够提供关于目的蛋白中特定残基与其他分子之间相互作用的时间动态信息。此类数据在研究蛋白质通过多步组装途径的进程以及鉴定组装中间体时尤为宝贵。尽管该方法已针对大肠杆菌（e coli）进行了优化，但也可应用于其他系统，包括其他细菌、酵母和哺乳动物细胞。培养准备的详细信息可在文本方案中找到。将5毫升M9培养基（含0.2%甘油、除甲硫氨酸和胱氨酸外的所有必需氨基酸以及抗生素）短暂配制好。通过向含有编码目标蛋白（带有琥珀突变）质粒和编码琥珀抑制系统质粒的转化大肠杆菌中加入培养基，开始过夜培养，并在37摄氏度下孵育。在实验当天，从过夜培养物中取适量菌液加入含有50毫升M9培养基和抗生素的250毫升锥形瓶中，使菌液在550纳米处的光密度达到0.03。将培养物置于37摄氏度摇水浴中孵育。当菌液培养至对数生长早期至中期时，向每份培养物中加入 50 微升 1 摩尔的苯甲酰苯丙氨酸（BPA）。加入 BPA 时应逐滴加入，同时轻轻旋转锥形瓶以避免沉淀产生。随后，加入所需的诱导剂以启动琥珀突变体的表达。在30分钟诱导期间，继续将培养物于37摄氏度孵育额外30分钟。用时间点以及“加UV”或“减UV”标记六支一次性15毫升离心管。将标记好的离心管置于冰上。将一个六孔组织培养板放置在另一个装有冰块的冰桶上。在进行放射性标记前五分钟打开紫外灯。然后，向标记为“无紫外”的每根试管中以及多孔板的两个孔中各加入约两毫升冰块。必须将冰直接吹入各时间点的试管和孔板中，以立即终止细胞内反应，从而准确捕捉生物化学通路在30分钟诱导期结束时的状态。将25毫升培养物转移至预热的125毫升一次性锥形瓶中。将锥形瓶置于37°C振荡水浴中。脉冲-追踪标记和紫外照射的步骤必须及时进行，并需要充分的组织和预先准备。在时间点一分钟零秒时，向培养物中加入每毫升30微居里的S 35标记的甲硫氨酸和半胱氨酸，并迅速轻轻摇晃以混匀。加入250微升非放射性的100毫摩尔甲硫氨酸-半胱氨酸溶液，并迅速混匀。立即将4毫升培养物用移液器转移至预冷的多孔板的一个孔中，该孔内含有冰；同时在时间为2分0秒时，将另一份4毫升等分试样移入标记为“0分钟（−UV）”的15毫升离心管中。将四毫升培养物用移液器转移至预冷多孔板的第二个孔中，该孔内含有冰。然后在五分钟时间点前立即向标记为“一分钟后减去紫外线”的15毫升离心管中加入另一份四毫升等分试样，并在六分钟零秒时将约两毫升冰加入多孔板的第三个孔中。将四毫升培养物用移液器转移至含有冰的预冷多孔板的第三个孔中。取另一份4毫升等分试样加入已标记为“5分钟-uv”的15毫升离心管中。将装有冰桶的多孔板置于预热的紫外灯下，对每个样品单独照射4分钟。将细胞转移至预冷的15毫升离心管中，离心管分别标记为“0分钟+uv”、“1分钟+uv”，依此类推。然后在4°C条件下，以2,500 × g离心细胞10分钟。每份样品用300微升M9培养基或PBS重悬，并加入33微升100%冷三氯乙酸（TCA）以沉淀蛋白质，在微量离心机中以最高速度离心10分钟收集TCA沉淀物。在去除上清液前，向每份样品中加入50微升溶解缓冲液，并在95°C下振荡加热5分钟，以溶解沉淀的蛋白质。加入一毫升放射免疫沉淀分析缓冲液后，采用各样品的五分之一至二分之一进行标准免疫沉淀。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离免疫沉淀的蛋白质。最后，将染色并干燥后的凝胶暴露于磷光成像屏中过夜，利用磷光成像仪检测放射性标记的蛋白质，包括交联产物。位点特异性光交联技术被用于鉴定在ESPP转运至外膜过程中与其相互作用的蛋白质。在本实验中，ESPP beta 结构域的第1113位和第1214位丙氨酸密码子被替换为琥珀密码子。ESPP beta 结构域的晶体结构显示，这两个残基均位于β桶的周质侧，彼此相隔约120度。通过C端抗ESPP血清，从经照射和未照射的对照细胞中均免疫沉淀出两种不同的多肽。最初，在较晚的时间点，一种大约135千道尔顿的前体蛋白形式占主导地位，该前体蛋白包含共价连接的乘客域和β域。随着乘客域通过外膜易位，并经蛋白水解切割与β域分离，PRO ESPP的水平下降，游离的β域逐渐成为主要形式。然而，经UV I辐射的样品中明显出现了分子量更高的条带，而这些条带在对照样品中并不存在。这些条带是由于 PRO ESPP 与相互作用蛋白发生交联所致，根据这些多肽的迁移率，可估算相互作用蛋白的大小，以检验其是否可能对应已知的外膜蛋白组装因子。此外，还使用针对假定相互作用伴侣产生的抗 Cera 抗体进行了额外的免疫沉淀实验。当 BPA 分别掺入第 1113 和 1214 位残基时，观察到一个约 150 千道尔顿的多肽，该多肽可被针对 17 千道尔顿周质分子伴侣 Skp 的抗血清所免疫沉淀。此外，我们发现当 BPA 仅在两个位点中的一个位置掺入时，所产生的较大肽链可分别通过抗 BAM 复合物亚基 BAM B 和 BAM D 的抗体进行免疫沉淀。完成该步骤后，可纯化交联产物，并可进一步采用质谱等其他方法，以帮助鉴定与目标蛋白相互作用的因子。观看本视频后，您应能够充分掌握如何成功地将脉冲-追踪标记与位点特异性光交联技术相结合，用于研究目标蛋白在活细胞内与其他分子相互作用的动态过程。

monitoring-assembly-secreted-bacterial-virulence-factor-using-site

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

监视分泌细菌毒力因子的组装使用站点特定的交联

我们描述了一种用于追踪由胞内细菌引发的内膜系统破裂的方法 志贺氏菌 福氏 和 结核分枝杆菌...

由胞内病原体引起的液泡破裂的单细胞测量

本文描述了一种用于鉴定膜蛋白在体（in...

膜蛋白-SPINE：一种用于鉴定膜蛋白蛋白质相互作用的生化工具 体内

本文所述方法用于在特定步骤诱导凋亡信号级联反应，以解析抗凋亡细菌效应蛋白的活性。该方法也可用于诱导表达促凋亡或毒性蛋白，或用于研究对其他信号通路的干扰作用。...

应用可诱导表达系统研究细菌毒力因子对细胞内信号通路的干扰

通过III型分泌系统将效应蛋白转运至宿主细胞是革兰氏阴性菌中一种常见的毒力策略。本研究采用基于β-内酰胺酶效应蛋白融合的检测方法，对转运过程进行定量分析。在感染了Yersinia的细胞中，通过激光扫描显微镜监测β-内酰胺酶对FRET报告分子的转化作用。...

分析 小肠结肠炎耶尔森菌 利用β-内酰胺酶效应子融合蛋白将效应子转运至宿主细胞

研究细菌病原体与其宿主之间的相互作用是生物学研究的重要领域。本文介绍了利用BlaM底物在siRNA基因沉默过程中检测贝氏柯克斯体（Coxiella...

应用荧光共振能量转移（FRET）技术检测siRNA沉默期间Coxiella burnetii效应蛋白转位效率

蛋白质复合物的结构对其功能至关重要。结合多种质谱技术已被证明是研究其组装过程的有力手段。本文提供了化学交联和天然质谱的技术方案，并展示了这两种互补技术如何帮助阐明多亚基蛋白质复合物的结构架构。...

结合完整蛋白质复合物的化学交联与质谱技术研究多亚基蛋白组装体的结构

本文介绍了一种简便的荧光检测方法，用于评估氨基酰-tRNA合成酶/tRNA配对在哺乳动物细胞表达蛋白中掺入非经典氨基酸（ncAAs）的效率。文中还描述了将非经典氨基酸应用于G蛋白偶联受体（GPCRs）研究的实例，包括结合位点的光交联定位以及在活细胞中对GPCR进行生物正交标记。...

优化化学探针在G蛋白偶联受体中的遗传编码，用于活体哺乳动物细胞中的光交联定位与生物正交化学研究

本文介绍了一种利用生物膜干涉技术（BLI）监测炭疽毒素组装与解聚过程的实验方案。在生物传感器表面完成毒素复合物的组装与解聚后，将大分子蛋白复合物从传感器表面释放，进而通过电子显微镜和质谱技术分别对其进行可视化观察及组分鉴定。...

利用质谱和电子显微镜分析在生物层干涉技术生物传感器上组装并释放的动态蛋白质复合物

同源J结构域蛋白与Hsp70分子伴侣协同作用，参与从蛋白质折叠到降解等多种生物学过程。本文介绍了一种原位邻近连接实验方法，可用于在细菌、酵母和人类细胞中监测这些短暂形成的分子伴侣复合物。...

原位监测细菌、酵母和人类细胞中瞬时形成的分子伴侣复合物

细菌细胞成像是一种新兴的系统生物学方法，旨在解析调控大型大分子机器功能的静态与动态过程。本文通过整合定量活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术，用于研究Legionella pneumophila...

应用活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征的 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统

本文提供了一种简单明了的实验方案，利用遗传密码子扩展技术（GCE）对Salmonella分泌的效应蛋白进行位点特异性标记，并通过直接随机光学重建显微镜（dSTORM）在HeLa细胞中成像观察分泌蛋白的亚细胞定位。...

利用遗传密码子扩展技术对细菌分泌蛋白进行超分辨率成像

学习位点特异性光交联结合脉冲追踪标记技术，用于在活细胞中动态监测蛋白质相互作用。该方法利用琥珀抑制技术掺入光活化氨基酸，实现时间分辨的相互作用事件捕获。

利用位点特异性交联监测分泌型细菌毒力因子的组装

探索更多视频