监视分泌细菌毒力因子的组装使用站点特定的交联

本文阐述了脉冲追踪无线电标记与位点特异性光交联相结合的使用，以监测目标蛋白质与大肠杆菌中其他因子之间的相互作用。与传统的化学交联方法不同，这种方法可在活细胞中生成有序组装途径的高分辨率"快照"。

以下实验的总体目标是检查活细胞内蛋白质相互作用的动力学。这是通过首先在大肠杆菌中表达目标蛋白质，在特定位置将氨基酸类似物苯甲酰苯丙氨酸掺入蛋白质中，然后进行脉冲追踪无线电标记以标记一小群同步合成的蛋白质分子来实现的。作为第二步。

追踪过程中不同时间点收集的细胞等分试样进行辐照，以触发目标蛋白质与其相互作用的任何因子之间共价键的形成。接下来，用特异性抗体免疫沉淀蛋白质，并通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，以鉴定相互作用因子，获得的结果显示目标蛋白质与其他细胞内因子之间的相互作用随时间的变化基于交联产物的电泳迁移率的变化。与现有方法（如免疫共沉淀或化学交联）相比，该技术的主要优点是它能够生成有关目标蛋白质中特定残基与其他分子之间发生的相互作用的时间信息。

在研究蛋白质通过多步组装途径的进展和识别组装中间体时，这些数据特别有价值。虽然这种方法已针对大肠杆菌进行了优化，但它也可用于其他系统，包括其他细菌、酵母和哺乳动物细胞。培养物制备的详细信息可在文本实验步骤中找到。

简要制备 5 毫升含有 0.2% 甘油的 M 9 培养基，除蛋氨酸和胱氨酸和抗生素外的所有 el 氨基酸通过加入大肠杆菌开始过夜培养，加入编码具有琥珀色突变的目标蛋白质的质粒和编码琥珀色抑制系统的质粒，在 37 摄氏度下孵育。在实验当天，将适量来自过夜培养物的细胞加入到含有 50 毫升 M 9 培养基和抗生素的 250 毫升锥形瓶中，以获得 550 纳米处的光密度为 0.03。在 37 摄氏度的摇动水浴中孵育培养物。

当培养物达到对数早期到中期时，向每个培养物中加入 50 微升 1 摩尔的苯甲酰苯丙氨酸或 BPA。在旋转培养瓶的同时，一次一滴添加 BPA，以避免沉淀。接下来，添加驱动琥珀色突变体表达所需的任何诱导剂。

在 30 分钟的诱导期内，继续在 37 摄氏度下孵育培养物 30 分钟。用时间点标记 6 个一次性 15 ml 离心管，并加 UV 或减 UV。将标记的试管放在冰上。

将一个 6 孔组织培养板放在第二个装满冰的冰桶的顶部。在无线电标记前 5 分钟打开 UV 灯。然后向每个标有 minus UV 的试管和多孔板中的两个孔中加入大约 2 毫升的冰。

必须将冰直接吹入试管和孔中，以便在每个时间点立即停止细胞内反应，从而在 30 分钟诱导期结束时获得生化途径的准确快照。将 25 mL 培养物转移到预热的 125 mL 一次性锥形瓶中。将烧瓶放入 37 摄氏度的摇动水浴中。

脉冲追踪标记和紫外线照射的步骤必须及时进行，并且需要大量的组织和提前准备。向培养物中加入每毫升 30 微居里 S 35 标记的蛋氨酸和半胱氨酸，并快速旋转以混合。1 分零秒。

加入 250 微升非放射性 100 毫摩尔蛋氨酸半胱氨酸溶液并快速旋转。要立即混合，请将 4 毫升培养物移液到含有冰的冷藏多孔板的一个孔中，将第二个 4 毫升等分试样移液到 15 毫升试管中，标记为 0 分钟减去 UV。2 分零秒。

将 4 毫升培养物移液到含有冰的冷藏多孔板的第二个孔中。然后将另外 4 毫升等分试样移液到 15 毫升试管中，在 5 分钟时间点之前立即标记 1 分钟减去 UV，以大约 2 毫升冰移液到多孔板中的第三个孔中，时间为 6 分零秒。将 4 毫升培养物移液到装有冰管的冷藏多孔板的第三个孔中。

将另外 4 毫升等分试样放入 15 毫升试管中，标记为 5 分钟减去 UV。将装有多孔板的冰桶放在预热的紫外灯下，分别照射每个样品 4 分钟。将细胞转移到冷冻的 15 mL 试管中，分别标记为 0 分钟加 UV、1 分钟加 UV 等。

然后在 4 摄氏度下以 2， 500 倍 G 离心细胞 10 分钟。将每个样品重悬于 300 μL M、9 培养基或 PBS 和 33 μL 100% 冷三氯乙酸或 TCA 中，以沉淀蛋白质，将 TCA 沉淀物在微量离心中以最高速度离心 10 分钟。在去除沉淀物之前，向每个样品中加入 50 微升增溶缓冲液，并在 95 摄氏度下搅拌加热 5 分钟，以溶解沉淀的蛋白质。

加入 1 mL 放射免疫沉淀分析缓冲液后，使用每个样品的 1/5 到 1/2 进行标准免疫沉淀。通过 ESAL 硫酸钠、聚丙烯酰胺凝胶电泳或 SDS 页面分离免疫沉淀的蛋白质。最后，将染色和干燥的凝胶暴露在磷酸化筛选中过夜，并使用磷酸化成像仪检测放射性蛋白质，包括交联产物，使用位点特异性光交联来识别在 ESPP 到达外膜过程中与 ESPP 相互作用的蛋白质。

在本实验中，ESPP β 结构域残基 1113 和 1214 处的 pH 丙氨酸密码子被琥珀密码子取代。ESPP β 结构域的晶体结构显示，这两个残基都在 β 桶的质周侧，相距约 120 度。C 末端抗 ESPP 和血清从辐照细胞和对照细胞中免疫沉淀两种不同的多肽。

最初，该蛋白质的大约 135 道尔顿前体形式，其中包含共价连接的乘客和 β 结构域，在后来的时间点占主导地位。PRO ESPP 水平下降，游离 β 结构域开始占主导地位，因为乘客结构域位于外膜上并通过蛋白水解裂解与 β 结构域分离。然而，UV I 辐射样品显然具有更高的分子量条带，而对照样品中不存在这些条带。

这些条带是 PRO ESPP 与相互作用蛋白交联的结果，基于这些多肽的迁移率，估计相互作用蛋白的大小以测试它们是否可能对应于已知的外膜蛋白组装因子。使用针对假定的相互作用伴侣产生的抗 cera 进行额外的免疫沉淀。当 BPA 掺入残基 1113 和 1214 时观察到的大约 150 道尔顿多肽可以用抗血清对 17 道尔顿周围血浆伴侣跳跃进行免疫沉淀。

此外，我们发现，当 BPA 仅掺入两个位置中的一个时观察到的较大多肽可以分别被针对 BAM 复合物亚基 BAM B 和 BAM D 的抗cera免疫沉淀。执行此程序后，可以纯化交联产物，并可以执行包括质谱在内的其他方法，以帮助鉴定与目标蛋白质相互作用的因子。观看视频后，您应该对如何成功地将脉冲追踪标记与位点特异性光交联相结合，以研究感兴趣的蛋白质与活细胞内其他分子的相互作用动力学有一个很好的理解。