利用位点特异性交联监测分泌型细菌毒力因子的组装

以下实验的总体目标是研究活细胞内蛋白质与蛋白质相互作用的动力学过程。首先在大肠杆菌中表达目标蛋白，将苯甲酰基苯丙氨酸这一氨基酸类似物特异性地引入蛋白的特定位置，并通过脉冲-追踪放射性标记方法对同步合成的小部分蛋白分子进行标记。第二步。

在追踪过程中不同时间点收集的细胞等分试样接受照射，以诱导目的蛋白与其相互作用因子之间形成共价键。随后，使用特异性抗体对蛋白进行免疫沉淀，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，以鉴定相互作用因子。根据交联产物电泳迁移率的变化，获得显示目的蛋白与其他细胞内因子之间相互作用随时间变化的结果。该技术相较于现有方法（如共免疫沉淀或化学交联）的主要优势在于，能够提供关于目的蛋白中特定残基与其他分子之间相互作用的时间动态信息。

此类数据在研究蛋白质通过多步骤组装途径的进程以及鉴定组装中间体时尤为宝贵。尽管该方法已针对大肠杆菌（E. coli）的使用进行了优化，但也可应用于其他系统，包括其他细菌、酵母和哺乳动物细胞。培养准备的详细信息可在文本方案中找到。

将5毫升M9培养基（含0.2%甘油、除甲硫氨酸和胱氨酸外的所有必需氨基酸以及抗生素）短暂配制好。通过向含有编码目标蛋白（带有琥珀突变）质粒和编码琥珀抑制系统质粒的转化大肠杆菌中加入培养基，开始过夜培养，并在37摄氏度下孵育。在实验当天，从过夜培养物中取适量菌液加入含有50毫升M9培养基和抗生素的250毫升锥形瓶中，使菌液在550纳米处的光密度达到0.03。将培养物置于37摄氏度摇水浴中孵育。

当菌液生长至对数早期至中期时，向每份培养物中加入 50 微升 1 摩尔的苯甲酰苯丙氨酸（BPA）。加入 BPA 时应逐滴加入，同时轻轻旋转三角瓶，以避免产生沉淀。随后，加入所需的诱导剂，以启动琥珀突变体的表达。

在30分钟诱导期间，继续将培养物在37摄氏度下孵育额外30分钟。用时间点以及“加UV”或“减uv”标记六个一次性15毫升离心管。将标记好的试管置于冰上。

将一个六孔组织培养板放置在另一个装满冰的冰桶上。在进行放射性标记前五分钟打开紫外灯。然后，向标记为“无紫外”的每根试管以及多孔板中的两个孔各加入约两毫升冰。

必须将冰直接吹入各时间点的试管和孔板中，以立即终止细胞内反应，从而准确捕捉生物化学通路在30分钟诱导期结束时的状态。将25毫升培养物转移至预热的125毫升一次性锥形瓶中。将锥形瓶置于37摄氏度的振荡水浴中。

脉冲追踪标记和紫外照射的步骤必须及时进行，并需要充分的组织和预先准备。在时间零分零秒时，向培养物中加入每毫升30微居里的S 35标记的甲硫氨酸和半胱氨酸，并迅速轻轻摇动以混匀。

加入250微升非放射性的100毫摩尔甲硫氨酸-半胱氨酸溶液，并迅速涡旋混匀。立即用移液器将4毫升培养物加入预冷的多孔板的一个孔中，该孔内含有冰；再将第二个4毫升等分试样移入标记为“0分钟（无UV）”的15毫升离心管中，时间为2分0秒。

将四毫升培养物移液至含有冰块的预冷多孔板的第二个孔中。然后在五分钟时间点前立即取另一份四毫升等分试样移液至标记为“一分钟后减去紫外线”的15毫升离心管中，并在六分钟零秒时将约两毫升冰加入多孔板的第三个孔中。将四毫升培养物移液至含有冰块的预冷多孔板的第三个孔中。

将另外四毫升等分试样加入已标记为“5分钟-uv”的15毫升离心管中。将装有多孔板的冰桶置于预热的紫外灯下，对每个样品单独照射四分钟。将细胞转移至已标记为“0分钟+uv”、“1分钟+uv”等的预冷15毫升离心管中。

然后在4°C条件下以2,500 × g离心细胞10分钟。每份样品加入300 µL M9培养基或PBS，以及33 µL 100%冷三氯乙酸（TCA），以沉淀蛋白质；在微量离心机中以最高速度离心TCA沉淀物10分钟。在去除上清液前，每份样品中加入50 µL溶解缓冲液，并在95°C下振荡加热5分钟，以溶解沉淀的蛋白质。

加入一毫升放射免疫沉淀分析缓冲液后，使用各样品的五分之一至二分之一进行标准免疫沉淀。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离免疫沉淀的蛋白质。最后，将染色并干燥后的凝胶暴露于磷屏过夜，并使用磷成像仪检测放射性蛋白质，包括交联产物。位点特异性光交联技术被用于鉴定在ESPP转运至外膜过程中与其相互作用的蛋白质。

在本实验中，ESPP β结构域第1113位和第1214位残基的pH丙氨酸密码子被替换为琥珀密码子。ESPP β结构域的晶体结构显示，这两个残基均位于β桶的周质侧，相隔约120度。通过C端抗ESPP抗体和血清，从经照射和对照的细胞中均免疫沉淀出两种不同的多肽。

最初，在较晚的时间点，一种分子量约为135千道尔顿的蛋白前体形式占主导地位，该前体包含共价连接的乘客域和β域。随着乘客域通过外膜转位，并经蛋白水解切割与β域分离，PRO ESPP的水平下降，游离的β域逐渐成为主要形式。然而，经UV I辐射的样品中明显出现了一些分子量更高的条带，而这些条带在对照样品中并不存在。

这些条带是由于PRO ESPP与相互作用蛋白发生交联所致，根据这些多肽的迁移率，可估算相互作用蛋白的大小，以检测其是否可能对应于已知的外膜蛋白组装因子。随后使用针对假定相互作用伴侣产生的抗Cera抗体进行了额外的免疫沉淀实验。当BPA分别掺入第1113和1214位残基时，观察到一个约150千道尔顿的多肽，该多肽可被针对17千道尔顿周质分子伴侣Skp的抗血清所免疫沉淀。

此外，我们发现当BPA仅在两个位点之一被引入时，会产生较大的多肽，这些多肽可分别通过抗BAM复合物亚基BAM B和BAM D的抗体进行免疫沉淀。完成该步骤后，可纯化交联产物，并可进一步采用其他方法（包括质谱分析）来帮助鉴定与目标蛋白相互作用的因子。观看本视频后，您应能充分掌握如何成功地将脉冲-追踪标记与位点特异性光交联技术相结合，以研究目标蛋白在活细胞内与其他分子相互作用的动态过程。