Name: 自动图像引导贴片夹在脑切片神经元研究中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 了解自动图像引导膜片钳技术，利用计算机视觉在急性脑切片中自动检测荧光标记神经元并进行电生理记录。该方法显著提高实验通量，适用于神经科学研究和药物筛选。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢怀特霍尔基金会提供的经费支持。感谢 Samuel T. Kissinger 提出的宝贵意见。

1. 系统设置
<ol>
	<li>构建压力控制单元。
	<ol>
		<li>根据电路图组装压力控制单元（图1）。根据电路原理图制造的印刷电路板（PCB）上焊接必要的部件（图1b）。使用标准电阻、发光二极管（LED）、金属氧化物半导体场效应晶体管（MOSFET）、电容器和连接器（参见 材料表）。将电磁阀焊接到PCB上。使用电线将气泵和气压传感器连接到PCB。 
		注：在备齐所有必要部件的情况下，构建压力控制单元大约需要 2 h。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>连接辅助数据采集（DAQ）板卡。
	<ol>
		<li>将印刷电路板的数据输出端连接至数据采集板，按照 表1. 
		注意：数据采集板（DAQ板）将处于运行状态 &#34;单端模式。&#34; 端口图示可在用户手册中找到（参见 材料表).</li>
		<li>连接 &#34;AIn Pr S&#34; 连接至其中一个模拟输入（AI）通道 &#34;R-Gr&#34; 连接到次级数据采集板的模拟地之一。</li>
		<li>将放大器的主输出端连接至次级数据采集板的一个AI通道，将接地端连接至该板的模拟地。 
		注意：可使用标准BNC电缆连接放大器的主输出端。</li>
		<li>剥去另一端的绝缘层，并连接正极信号（即&#160;铜芯）连接至AI通道和接地（即&#160;将核心周围的细导线连接到模拟地。如果使用多个膜片钳通道，则对第二个通道重复此步骤。 
		注意：稍后的步骤中将配置DAQ板的模拟输入。</li>
		<li>将电源连接至次级DAQ板的电源输出端。泵需使用独立的12 V电源。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>连接管路。
	<ol>
		<li>根据说明书连接气泵和两个阀门 表2使用三通接头将来自阀2顶部端口的软管、压力传感器和上一步中的移液管 holder 连接起来。</li>
		<li>如果使用两个移液管，在连接移液管支架的管路上再添加一个三通连接器。在进行膜片钳操作时，手动切换正在使用的阀门和移液管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安装 Autopatcher IG。 
	注意：系统要求：Autopatcher IG 仅在运行 Windows 7 的 PC 上进行过测试，尚未验证适用于其他操作系统。所述操作步骤仅适用于材料表中所列的硬件设备。
	<ol>
		<li>从 GitHub 下载 Autopatcher-IG（https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG）。</li>
		<li>安装 Python（参见 材料清单 （获取版本及下载地址）。</li>
		<li>通过输入以下命令卸载 PyQt4 库 &#34;pip 卸载 PyQt4&#34; 在命令行终端中。 
		注意：该系统使用较旧版本的 PyQt4 库，以实现与 Qwt 和 Opencv 库的兼容性。</li>
		<li>从历史 wheel 文件（http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/）安装 Python 库。查找以下文件：Numpy（pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl）、Opencv（opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl）、Pyqt（PyQt4-4.11.4-cp27-none-win32.whl）和 Qwt（PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl）。
		<ol>
			<li>要安装 wheel 文件，请进入保存文件的目录并输入 &#34;pip install ***wheelfilename***.whl&#34; 替代 &#34;***wheelfilename***&#34; 使用文件的实际名称。 
			注意： &#34;cp27&#34; 在轮文件名中表示 Python 2.7 和 &#34;win32&#34; 指示 Windows 32 位。如果 &#34;win32&#34; 不起作用，尝试 &#34;win64&#34;</li>
		</ol>
		</li>
		<li>要控制CCD相机，请下载并安装64位版本的驱动程序（https://www.qimaging.com/support/software/）。然后下载适用于64位系统的MicroManager（https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release），以便在Python中控制相机。</li>
		<li>为控制机械臂和显微镜载物台，请安装制造商提供的控制软件。 
		注意：通过此操作，控制操纵器所需的驱动程序也将被安装。安装包通常随附于光盘中。</li>
		<li>为控制辅助 DAQ 板，请安装随 DAQ 板购买时附带的 CD-ROM 中的 Universal Library。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配置Autopatcher IG的硬件。
	<ol>
		<li>通过 USB 端口将显微镜载物台和操纵器控制器连接到计算机。</li>
		<li>将 COM 端口号按此顺序分配给设备：0：显微镜载物台，1：左侧操纵器，2：右侧操纵器，在 &#34;ports.csv&#34; 配置文件中的 &#34;构型&#34; 文件夹中。保持 ports.csv 文件中的其他参数不变（即&#160;&#34;SCI&#34; 和 &#34;1&#34;）保持不变。 
		注意：COM端口编号信息可通过运行制造商提供的操纵器配置软件找到。前往 &#34;设置&#34; 标签，选择 &#34;设置&#34; 以及 &#34;运动&#34; 页面，并查看顶部每个选项卡的标签。或者，可以在PC设备管理器中找到此信息。</li>
		<li>为DAQ板上的压力传感器以及膜片钳通道1和2（分别对应单元1和单元2）分配模拟输入通道编号。在 &#34;DAQchannels.csv&#34; 文件中的 &#34;构型&#34; 文件夹 
		注意：建议使用记事本应用程序而非电子表格程序打开 .csv 文件，因为后者在保存更改时可能会修改文件内容。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行Autopatcher IG。
	<ol>
		<li>打开放大器、显微镜控制器和操纵器控制器。确保放大器软件正在运行。</li>
		<li>通过命令行终端使用 Python 运行 Autopatcher IG，操作如下：首先，更改目录（命令 &#34;cd&#34; 对于大多数常见终端，在安装了 Autopatcher IG 的设备上输入 &#34;python Autopatcher_IG.pyw&#34; 在命令行终端中输入并按下 &#34;输入&#34; 关键 
		注意：在启动Autopatcher IG之前，请勿运行操纵器控制软件，否则将占用显微镜载物台和操纵器，导致Autopatcher IG无法识别硬件。若需控制其他模块，可在Autopatcher IG完全启动后运行操纵器控制软件。例如， 内联加热器）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>校准主移液器。
	<ol>
		<li>按照先前所述方法拉制膜片钳电极9用内液填充拉制的玻璃微电极，并将其安装到显微操作器的头部。 
		注意：空玻璃移液管在显微镜下具有不同的对比度，可能导致校准不准确。</li>
		<li>将移液管尖端移至显微镜视野内并调至清晰。如果使用拨号面板移动操纵器和/或显微镜载物台，请通过按下按钮更新坐标 &#34;z&#34; 在键盘上。 
		注意：如果使用键盘控制移动（显微镜载物台：A/D - x轴，W/S - y轴，R/F - z轴；操纵器：H/K - x轴，U/J - y轴，O/L - z轴，1/2 - 单元编号），则无需执行此操作，因为坐标将实时更新。</li>
		<li>点击 &#34;开始校准&#34; 主图形用户界面（GUI）上对应移液器所在单元的按钮（图2). 
		注意：校准完成后将弹出一个窗口。 
		注意：校准将自动进行，大约需要 3.5 分钟。点击同一按钮（此时已切换为 &#34;取消校准&#34; 在启动校准后，将中止校准尝试。</li>
		<li>通过点击保存校准 &#34;保存校准&#34; 位于主图形用户界面底部（可保存当前两个操纵器的校准参数，供将来加载使用）。 
		注意：低倍镜（4 或&#160;10倍和40倍高倍镜必须进行对齐，以确保二次校准正常工作。请参考所用光学系统用户手册中的对齐操作步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 自动化膜片钳实验步骤
<ol>
	<li>按照先前所述方法制备急性脑切片10.</li>
	<li>准备用于膜片钳的玻璃移液管。</li>
	<li>将一片脑切片置于记录室中央，用切片固定器固定切片， &#34;竖琴&#34;</li>
	<li>检测荧光细胞。
	<ol>
		<li>在4倍物镜下找到目标区域。通过开启点击移动功能来移动显微镜载物台。&#34;CTM&#34;）模式，然后单击目标区域的中心。或者，使用键盘移动显微镜载物台（A/D - x轴，W/S - y轴，R/F - z轴）。</li>
		<li>切换至高倍镜，通过数字键盘上的 R/F 键沿 z 轴方向移动显微镜来调节焦距。 
		注意：建议调整水浴液面高度，使在低倍和高倍物镜下观察时，z轴方向的焦平面相同或相近。</li>
		<li>点击 &#34;检测细胞&#34; 主图形用户界面列上的按钮 &#34;单元 0。&#34; 如果实验装置的LED或激光光源无法通过TTL信号控制，请手动打开LED/激光；细胞检测完成后将弹出窗口。
		<ol>
			<li>必要时关闭LED/激光器；细胞坐标的列表将出现在 &#34;记忆位置&#34; 图形用户界面。通过点击从列表中移除不需要的细胞 &#34;X&#34; 坐标旁边的按钮。</li>
			<li>或者，如果靶细胞未进行荧光标记，则单击 &#34;小鼠模型&#34; 在主图形用户界面中，点击目标细胞，细胞上将出现一个带数字的黄色圆点，同时该细胞的坐标将显示在 &#34;记忆位置&#34; 图形用户界面</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>校准辅助移液器。
	<ol>
		<li>用内液填充玻璃移液管的三分之一。将移液管装入固定在显微操作仪头部的移液管架上。</li>
		<li>使用低倍物镜。将移液器移入视野，并通过键盘调节焦距（H/K - x轴，U/J - y轴，O/L - z轴）。使用 &#34;1&#34; 和 &#34;2&#34; 在单元1和单元2之间切换。</li>
		<li>单击以加载主校准 &#34;加载校准&#34; 点击 &#34;二级校准&#34; 主图形用户界面中正在使用的单元下方的按钮。例如，如果正在使用单元2，则单击该单元下方的按钮 &#34;二级校准&#34; 按钮在 &#34;第2单元&#34; 柱。按照弹出窗口的说明切换到高倍镜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封接目标细胞。
	<ol>
		<li>确保 &#34;MultiClamp&#34; (即&#160;放大器）软件正在运行。单击 &#34;膜片钳控制&#34; 按钮以打开 &#34;膜片钳控制&#34; 图形用户界面；启动此界面可能需要几分钟时间。</li>
		<li>使用40倍放大倍数的物镜进行观察 &#34;40X&#34; 在主图形用户界面上 &#34;第0单元&#34; 柱。单击 &#34;前往&#34; 坐标列表中目标细胞所在单元格旁的按钮 &#34;记忆位置&#34; 图形用户界面；显微镜将移动至细胞位置。</li>
		<li>在主图形用户界面中，点击正在使用的单元的CTM按钮，以启用鼠标点击后的移动功能。点击目标细胞，移液管尖端将移动至该细胞。</li>
		<li>点击 &#34;贴片&#34; 按钮 &#34;膜片钳控制&#34; 图形用户界面 
		注意：自动封接将开始，可在屏幕上监测压力和电阻。 &#34;膜片钳控制&#34; 图形用户界面
		<ol>
			<li>使用 &#34;第一单元已选中&#34; 用于在两个单元之间切换输入信号的按钮。 
			注意：系统将接近目标细胞，施加负压，匹配细胞膜电位，并根据一系列压力和电阻阈值及逻辑来检测吉封（gigaseal）的形成。</li>
			<li>通过点击相应按钮，可在任意时刻操控自动流程 &#34;膜片钳控制&#34; 图形用户界面。例如，单击 &#34;贴片&#34; 再次点击按钮以取消封接尝试，然后点击 &#34;下一阶段&#34; 无论阈值如何，均推进补丁过程至下一步。 
			注意：当千兆欧姆封接形成时，弹出窗口将通知用户，并提供应用电击（zap）和大负压的选项。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>选择 &#34;是&#34; 通过联合使用电击和抽吸进行破碎。或者，选择 &#34;无&#34; 仅用负压吸引进行穿刺。 
		注意：当全细胞记录成功建立时，弹出窗口将提醒用户保存实验记录日志。</li>
		<li>保存实验膜片记录日志。 
		注意：如果封接尝试失败，弹出窗口将通知用户，封接程序将重置。</li>
		<li>返回步骤 2.4，用另一个细胞重复上述步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>优化封接阈值（可选）。 
	注意：初始移液管电阻范围、正压与负压、千兆封接电阻的阈值 等等可以从配置文件中进行修改。
	<ol>
		<li>打开 &#34;PatchControlConfiguration.csv&#34; 文件在 &#34;配置&#34; 将文件夹放置在系统安装的目标位置。修改每个阈值对应的数值，但不要更改数值的名称，否则会导致系统无法识别这些条目。</li>
		<li>立即按下以应用新的阈值 &#34;Ctrl+L&#34; 无需重新启动程序；重新启动程序将应用文件中的最新阈值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 进行记录
注意：一旦形成成功的封接，自动膜片钳软件将自动把计算机控制的微电极放大器的模式设置为电流钳（&#34;IC&#34;）。全细胞膜片钳记录可使用任意选定的记录软件进行（本系统不包含记录功能）。若已识别出多个目标细胞，在完成一次记录后，返回步骤 2.4，尝试另一个细胞。
<ol>
	<li>使用皮升喷射仪（可选）进行自动局部药物施加实验。 
	注意：此处以局部药物施加实验为例，说明如何使用额外的&#34;命令序列&#34;功能，通过TTL信号控制外部硬件。
	<ol>
		<li>使用剥除的BNC电缆将次级DAQ板上的A端口通道0和接地端连接至数字化仪的启动触发输入端（如步骤1.2.3所述）。将数字化仪的一个数字输出通道连接至皮升喷射仪的外部触发端。</li>
		<li>根据用户手册准备皮升喷射仪。将皮升喷射仪的气路输出端连接至安装在显微操作器上的药物喷射微管夹持器。</li>
		<li>装载一支充满所需药物的微管，并将其固定在微管夹持器上。按照步骤1.7所述方法校准微管。</li>
		<li>在按照步骤2.6完成细胞膜片钳制后，通过主GUI切换至&#34;鼠标模式&#34;，然后在相机视图GUI中点击鼠标选择所需的药物递送位置。或者，使用&#34;网格&#34;GUI设计一个网格，网格中的每个像素即为一个目标位置。 
		注意：可通过鼠标在相机视图GUI中拖动来调整网格。</li>
		<li>在&#34;命令序列&#34;GUI中，选择安装药物微管的显微操作器单元。点击&#34;加载鼠标点&#34;或&#34;加载网格点&#34;，以导入所有用于药物递送的坐标。
		<ol>
			<li>点击每个坐标条目，以在右侧列中编辑特定的命令TTL信号。在第一个命令条目中，点击最右侧的数字，将其由&#34;0&#34;改为&#34;1&#34;，从而发送一个+5 V的TTL信号。将时间（T）设置为所需的TTL信号持续时间，单位为ms。</li>
			<li>在第二个命令条目中，将所有数字位设置为&#34;0&#34;，并将T设置为单次试验的记录时长。对所有坐标条目编辑相应的命令。如需多个TTL信号，可点击&#34;+&#34;添加新的命令条目。 
			注意：8位数字分别对应次级DAQ板上A端口的通道0-7（端口1-3已被泵和两个阀门占用），必要时可进行切换。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在数据采集模块中创建记录协议，使扫描的开始由外部启动触发信号触发。编辑协议以在指定时间递送药物。</li>
		<li>在&#34;命令序列&#34;GUI中，点击左侧的&#34;运行&#34;以执行所有坐标的操作。或者，点击右侧的&#34;运行&#34;仅执行选定的序列。 
		注意：微管将移动至每个坐标位置，并按预设执行TTL信号，从而启动记录扫描。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li>
<li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li>
<li>Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computer-assisted+multi-electrode+patch-clamp+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system.</a> J Vis Exp. (80), e50630(2013).</li>
<li>Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+cell+patch+clamp+recording+performed+on+a+planar+glass+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.</a> Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACQ4%3A+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroinform%22%5BJournal%5D)">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li>
<li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li>
</ol>

一项非临时专利申请&#34;用于体外自动图像引导膜片钳电生理学的系统与方法&#34;，美国序列号：15/353,719，于2016年11月16日提交，参考编号：PRF 67270-02。

此处，我们介绍一种用于自动图像引导的膜片钳记录方法 体外该过程的关键步骤总结如下。首先，利用显微镜获取的一系列图像，通过计算机视觉技术自动识别移液管尖端。然后利用该信息计算显微镜坐标系与操纵器坐标系之间的坐标变换函数。通过计算机视觉自动检测荧光标记的细胞并确定其坐标。上述步骤结合移液管定位和自动封接算法，使用开源的 Python 编程语言以及 PyQT 和 OpenCV 库实现集成。
与现有方法相比 体外 膜片钳技术，该系统在多个方面实现了显著改进。它最大限度地减少了人为干预。该系统自动化了膜片钳实验中的大部分步骤，从而大幅降低了对人工操作的需求。部分尚需手动完成的步骤，例如在低倍与高倍显微镜物镜之间切换，可通过增加电动化硬件实现自动化。
膜片钳技术提高了通量。使用该系统进行的膜片钳实验获得了更高的成功率和更短的单次实验时间，从而显著提升了整体通量。用于荧光细胞检测和移液管尖端检测的计算机视觉算法非常稳健，错误率极低。移液管尖端检测的平均误差为1.6 µm，荧光细胞检测的假阳性率为4.9% ...

膜片钳技术最初由 Neher 和 Sakmann 在 20 世纪 70 年代开发，用于研究可兴奋膜的离子通道1自那时以来，膜片钳技术已被应用于细胞、突触和环路水平上多种不同研究领域的研究——两者均 体外 和 体内—在多种不同细胞类型中，包括神经元、心肌细胞、非洲爪蟾卵母细胞以及人工脂质体2该过程包括准确识别和定位目标细胞，通过精细的显微操作器控制将膜片电极移至细胞附近，在适当时机对电极施加正压和负压以形成紧密的千兆欧姆封接（gigaseal），并进一步破膜以建立全细胞记录构型。膜片钳技术通常以手动方式进行，需要经过长期训练才能掌握。即使对于经验丰富的研究人员，其实验成功率仍然相对较低。近年来，已有多种尝试致力于实现膜片钳实验的自动化。目前发展出两种主要的自动化策略：一是在标准膜片钳设备基础上进行改进，实现对封接过程的自动控制；二是从零开始设计全新的设备与技术。前一种策略可适配现有硬件，适用于多种膜片钳应用，包括 体内 盲法膜片钳3,4,5, 体外 急性脑片、器官型脑片培养及离体培养神经元的膜片钳记录6它能够通过同时使用多个显微操作器来探究复杂的局部神经环路7平面膜片钳技术是这一新开发策略的范例，可用于对悬浮细胞进行高通量同步膜片钳记录，适用于药物筛选。8然而，平面膜片钳技术并不适用于所有类型的细胞，特别是具有长突起的神经元或包含广泛连接的完整神经环路。这限制了该技术在神经系统复杂环路定位研究中的应用，而后者正是传统膜片钳技术的主要优势所在。
我们开发了一套可自动完成人工膜片钳操作的系统 体外 通过扩展标准膜片钳硬件实现。我们的系统Autopatcher IG可提供自动移液管校准、荧光标记细胞靶点识别、移液管运动的自动控制、全自动全细胞膜片钳记录以及数据日志功能。该系统能够自动获取脑切片在不同深度下的多幅图像，利用计算机视觉技术对其进行分析，并提取包括荧光标记细胞坐标在内的相关信息。这些信息可用于定位目标细胞并自动进行膜片钳操作。该软件采用Python语言编写——一种免费的开源编程语言，并使用了多个开源库，从而确保其他研究人员可便捷地获取和使用，提升电生理实验的可重复性与严谨性。该系统采用模块化设计，可轻松集成额外的硬件设备，以适配本文所展示系统的现有架构。

<table><tbody><tr><td>CCD相机</td><td>QImaging</td><td>Rolera Bolt</td><td></td></tr><tr><td>电生理记录系统</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope Pro 2000</td><td>包含显微镜和操纵器。本文中演示的由制造商提供的操纵器控制软件为&amp;ldquo;Linlab2&amp;rdquo;。</td></tr><tr><td>放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>计算机控制的微电极放大器</td></tr><tr><td>数模转换器</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td>LED光源</td><td>Cool LED</td><td>pE-100</td><td>波长488 nm</td></tr><tr><td>数据采集板</td><td>Measurement Computing</td><td>USB1208-FS</td><td>辅助DAQ。&lt;br/&gt; 使用手册地址：http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td></tr><tr><td>电磁阀</td><td>The Lee Co.</td><td>LHDA0531115H</td><td></td></tr><tr><td>气泵</td><td>Virtual industry</td><td>VMP1625MX-12-90-CH</td><td></td></tr><tr><td>气压传感器</td><td>Freescale semiconductor</td><td>MPXV7025G</td><td></td></tr><tr><td>脑片固定装置</td><td>Warner instruments</td><td>64-1415 (SHD-40/2)</td><td>RC-40灌流 chamber 配套的2.0 mm、19.7 mm平头脑片锚定套件</td></tr><tr><td>Python</td><td>Anaconda</td><td>版本 2.7（适用于Windows的32位）</td><td>https://www.continuum.io/downloads</td></tr><tr><td>螺丝端子</td><td>Sparkfun</td><td>PRT - 08084</td><td>3.5 mm间距螺丝端子（2针）</td></tr><tr><td>（2针）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N沟道MOSFET 60 V 30 A</td><td>Sparkfun</td><td>COM - 10213</td><td></td></tr><tr><td>DIP插座焊尾式 - 8针</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-07937</td><td></td></tr><tr><td>LED - 基础红色 5 mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09590</td><td></td></tr><tr><td>LED - 基础绿色 5mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09592</td><td></td></tr><tr><td>DC桶形电源插座/连接器（SMD）</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-12748</td><td></td></tr><tr><td>壁式交流适配器电源 - 12 V直流 600 mA</td><td>Sparkfun</td><td>TOL-09442</td><td></td></tr><tr><td>导线 - 混合套装（实心芯，22 AWG）</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-11367</td><td></td></tr><tr><td>带锁三通阀（公头x母头x母头）</td><td>ARK-PLAS</td><td>RCX10-GP0</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tygon S3 E-3603 柔性管路</td><td>Fisher scientific</td><td>14-171-129</td><td>外径：1/8 英寸&lt;br/&gt; 内径：1/16 英寸</td></tr><tr><td>BNC公头转BNC公头同轴电缆</td><td>Belkin Components</td><td>F3K101-06-E</td><td></td></tr><tr><td>560 欧姆电阻（5%容差）</td><td>Radioshack</td><td>2711116</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>General Valve</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr></tbody></table>

应用自动化图像引导膜片钳技术研究脑片中的神经元

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

全细胞膜片钳是测量单个细胞电学特性的金标准方法。然而，该方法 体外 由于操作复杂且高度依赖用户操作与控制，膜片钳技术仍是一项具有挑战性且通量较低的技术。本文展示了一种用于图像引导的自动膜片钳系统 体外 急性脑片中的全细胞膜片钳实验。我们的系统采用基于计算机视觉的算法，用于检测荧光标记的细胞，并通过显微操作器和移液管内压控制，实现对目标细胞的全自动膜片钳操作。整个过程高度自动化，几乎无需人工干预。实验中的实时信息，包括电学阻抗和移液管内压，均以电子方式记录，便于后续分析以及针对不同细胞类型的优化。尽管本系统以急性脑片记录为描述背景，但也可应用于解离神经元、器官型脑片培养以及其他非神经元细胞类型的自动图像引导膜片钳实验。

我们的系统已测试用于急性脑切片、小鼠诱导性多能干细胞（iPSCs）分化而来的神经元以及人工表达特定通道的HEK 293细胞的膜片钳记录。图3展示了一项使用Thy1-ChR2-YFP转基因小鼠（B6.Cg-Tg(Thy1-COP4/EYFP)18Gfng/J）的实验，该小鼠的视觉皮层第5层锥体神经元被荧光标记。目标细胞是自动识别出的绿色荧光阳性细胞之一（图3b）。图3a为记录到的神经元的微分干涉差（DIC）图像。全细胞构型通过自动膜片钳方案的步骤2.5至2.6建立，并通过阶跃电流注入诱发的动作电位进行验证（图3c）。
为了演示“命令序列”（Command Sequence）功能，我们在对脑片细胞进行膜片钳记录的同时，使...

本方案描述了如何使用近期开发的用于标准体外电生理学设备的系统，开展自动图像引导的膜片钳实验。

全细胞膜片钳是测量单个细胞电学特性的金标准方法。然而，体外膜片钳技术仍然是一个……

该技术的总体目标是利用计算机视觉自动检测急性脑片中的荧光标记细胞，并对这些细胞进行自动膜片钳记录。该方法有助于克服膜片钳电生理学领域中的关键难题，例如荧光标记细胞的识别、靶向定位以及膜片钳操作。该技术的主要优势在于能够自动检测膜片钳电极和荧光细胞，并将这些步骤与自动膜片钳操作集成在一起。该技术创新显著提高了实验通量。该技术的应用前景涵盖神经系统疾病的治疗或诊断，因为高通量成像引导的自动膜片钳技术可用于更接近生理状态的神经元样本中的药理学筛选。该方法还可应用于其他体外样本，如神经元类器官、脑片培养、离散神经元以及任何非神经元细胞。开始此操作步骤时，先打开放大器、显微镜控制器和操纵器控制器。然后，通过命令行终端使用 Python 运行 Autopatcher IG，首先切换到安装 Autopatcher IG 的目录，接着输入命令：Python Autopatcher_IG。在命令行终端中输入 PYW，然后按回车键。随后，用内液充满所有玻璃移液管，并将其装载到显微操作臂上。移动移液管尖端至显微镜视野范围内，并调节至清晰对焦。如果使用拨号盘移动显微镜载物台上的操纵器，请按键盘上的 Z 键更新坐标。主校准将操纵器移动的角度和距离转换为显微镜坐标系。操纵器沿三个方向以预设距离移动，软件则检测显微镜视野内移液管尖端的坐标。单击主图形用户界面中对应单元上的“开始校准”按钮，以对该单元上安装的移液器进行校准。随后，单击主图形用户界面底部的“保存校准”按钮以保存校准结果。除非设备的物理结构发生改变，否则该初始校准仅需执行一次。在此步骤中，将一片脑切片置于记录室中央。使用切片固定器或网格状固定器稳定脑切片。为检测荧光细胞，在4倍物镜放大下找到目标区域。然后，开启点击移动模式，点击目标区域的中心，以移动显微镜载物台。或者，也可使用键盘上的数字键移动显微镜载物台。接下来，切换至高倍物镜，并通过键盘上的RF键调节显微镜在Z轴方向的焦距。该软件控制显微镜和相机在不同深度拍摄一系列图像。随后，这些图像经过计算机视觉处理，以识别荧光标记的细胞。最终输出结果为检测到的细胞坐标的列表。单击主图形用户界面第一列单元格零处的检测细胞按钮。如果实验装置的LED或激光光源无法通过TTL信号控制，请手动打开LED或激光。必要时关闭LED或激光。细胞坐标列表将显示在内存位置图形用户界面中。通过点击坐标旁的 X 按钮，从列表中移除不需要的细胞。或者，如果目标细胞未进行荧光标记，可在主图形用户界面中点击鼠标模式。然后，点击目标细胞，细胞上将出现一个带数字的黄色圆点，同时该细胞的坐标将显示在内存位置图形用户界面中。为了检测移液管偏移坐标而进行二次校准，需用内部溶液填充玻璃移液管的三分之一。随后，将移液管安装到连接在显微操作臂上的移液管支架中。在低倍镜下，使用键盘上的数字1和2在单元一和单元二之间切换。然后，将移液器移入视野，并使用键盘调节焦距。接下来，单击“加载校准”以加载初始校准。将显微镜物镜切换至高倍镜，并在主图形用户界面中点击40次。将移液器尖端移至中心位置，然后点击主图形用户界面上正在使用的单位下方的次级校准按钮。要对目标细胞进行膜片钳记录，首先单击膜片钳控制按钮以打开膜片钳控制图形用户界面。然后在记忆位置图形用户界面的坐标列表中，单击目标细胞旁的“前往”按钮。随后，单击主图形用户界面中该单元的 CTM 按钮以启动移动。单击目标细胞所在的区域，以移动移液器尖端至该细胞。由于操作器存在机械限制，当移动距离超过500微米时，可能会出现轻微的定位误差。为避免产生较大的机械定位误差，应在目标细胞附近进行二次校准。接下来，使用“选择单元”按钮在两个单元之间切换输入信号。点击补丁控制图形用户界面（GUI）上的“补丁”按钮，自动封接将开始，可在补丁控制GUI上监测压力和电阻。自动封接算法通过一系列逻辑循环监测电阻并控制压力，以形成吉欧封接。弹出窗口会提示吉欧封接的形成。系统利用电阻变化来识别细胞表面接触。如果未能及时检测到细胞表面接触，请使用下一个按钮在同一次自动封接尝试中推进至封接阶段。通过点击补丁控制图形用户界面（GUI）上的相应按钮，可在任意时刻操控自动过程。然后选择“是”，以结合电击和负压方式进行破膜。 或者选择“否”，仅通过负压进行穿刺。然后保存实验膜片记录日志。该图显示了已加载至命令序列图形用户界面的选定位置。左侧列显示了坐标列表，右侧列以 TTL 信号的形式显示了每个位置对应的指令列表。以下是药物应用实验期间的屏幕截图，对应于所选的三个位置。KCL 溶液与红色荧光染料混合，以便于可视化。单元一为含KCL的移液管，单元二为膜片钳移液管。本图中，阶梯电流注入显示了一个规律性放电的神经元。此处展示的是在三个位置局部施加500毫摩尔氯化钾溶液后的电压钳制记录轨迹。红色轨迹显示的是氯化钾溶液施加位置接近膜片细胞时记录到的内向电流。红色箭头指示了氯化钾溶液施加的时间点。采用该方法，无需大量训练，即可在四分钟内完成一次膜片钳实验，相较于手动膜片钳技术更为高效。在完成该操作步骤后，可进一步开展光遗传学、化学遗传学以及药理学干预等其他方法，以回答与您的研究项目相关的问题。该技术在建立后，有望为神经科学领域的研究人员探索不同体外制备模型中突触受体和离子通道的高通量研究提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何开展图像引导的自动化膜片钳实验。

application-automated-image-guided-patch-clamp-for-study-neurons

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

自动图像引导贴片夹在脑切片神经元研究中的应用

本视频演示了一种从树突膜表面进行膜片钳记录的技术。该技术有助于直接检测多巴胺能神经元树突的电学特性及其相关的电压门控离子通道。...

脑片中多巴胺能神经元树突的膜片钳记录

本视频展示了如何将尖端精细的移液管置于脑切片附近，与神经元细胞形成封接。通过施加负压使细胞膜破裂，从而建立全细胞膜片钳，以实现电生理实验中的电流测量。...

建立脑片电生理记录的全细胞电压钳制配置

本视频介绍了一种同时对含有神经元特异性荧光蛋白的转基因脑片进行成像和记录电活动的方法。该方法包括将脑片置于灌流室中，并用充氧的人工脑脊液维持；使用光源激发荧光标记的细胞；并通过多通道探针和膜片钳技术记录电信号。...

脑切片中神经元细胞的同步光学与电生理监测

在本视频中，脑切片被固定在记录室中，使用计算机控制的显微镜定位并聚焦于目标细胞。随后，自动图像处理系统精确地将膜片钳电极移至细胞膜表面，形成封接，以监测电信号。...

用于研究脑切片中神经元的自动化图像引导膜片钳技术

本视频演示了通过固定脑切片、定位移液管以实现全细胞记录构型，并刺激突触前神经元来记录突触后反应，从而揭示神经元连接关系的突触连接图谱绘制方法。...

急性脑切片中神经元连接的成对膜片钳记录

本文介绍了一种用于研究急性分离脑片神经元中配体门控离子通道功能的有效方法。该方法结合标准膜片钳技术记录神经元，同时使用充满药物的微电极对神经元进行局部药物施加。...

局部给药法研究小鼠脑切片中烟碱型乙酰胆碱受体功能

在急性脑切片中对突触连接的神经元进行膜片钳记录和同时的细胞内生物胞素填充，可实现其结构与功能特性的相关联分析。本方案的目的是描述从神经元微环路进行电生理记录及其后续形态学分析的关键技术步骤。...

利用成对膜片钳记录技术对急性脑切片中神经元微环路的电生理学与形态学特征进行表征

本方案演示了一种优化方法的实施...

使用优化方法制备急性脑切片 N甲基-D-葡糖胺保护回收法

本方案描述了进行全细胞膜片钳记录的基本操作步骤。该技术可用于研究 神经元的电学行为，且在脑切片中进行时，可评估仍相对完整地整合于保存较好的脑环路中的神经元的多种功能。...

脑片中的全细胞膜片钳记录

脑片膜片钳技术是分析学习诱导的兴奋性或抑制性突触内在特性和可塑性变化的有效方法。...

用于分析学习诱导可塑性的脑片膜片钳技术

离体脑片可用于研究挥发性麻醉剂对传入刺激诱发反应的影响。利用光遗传学技术可独立激活丘脑皮层和皮层间传入纤维，作用于非初级新皮层，并通过异氟烷调节突触和神经网络反应。...

脑片中传入通路的光遗传学激活及挥发性麻醉剂对反应的调节

了解自动图像引导膜片钳技术，利用计算机视觉在急性脑切片中自动检测荧光标记神经元并进行电生理记录。该方法显著提高实验通量，适用于神经科学研究和药物筛选。

应用自动化图像引导膜片钳技术研究脑片中的神经元

探索更多视频