自动图像引导贴片夹在脑切片神经元研究中的应用
2017年7月31日
该协议描述了如何使用最近为标准体外电生理设备开发的系统进行自动图像引导的膜片钳实验。
该技术的总体目标是使用计算机视觉自动检测荧光细胞，并在急性脑切片中对这些细胞进行自动膜片钳。该方法可以帮助克服膜片钳电生理学领域的关键困难，例如荧光标记细胞的识别、靶向和膜片钳。该技术的主要优点是它可以自动检测膜片移液、荧光细胞，并将步骤与自动膜片钳整合。
这项创新显著提高了实验通量。该技术的意义延伸到神经系统疾病的治疗或诊断，因为高通量图像引导自动膜片钳可用于更多生理神经元制剂的药理学筛选。该方法也可应用于其他体外制剂，例如神经元细胞器类型或切片培养物，解离神经元以及任何非神经元细胞。
要开始此过程，请打开放大器、显微镜控制器和机械手控制器。然后，首先更改 Autopatcher IG 的安装目录，从命令行终端使用 python 运行 Autopatcher IG。接下来，键入 Python Autopatcher_IG。
PYW 并按 Enter 键。之后，用内部溶液填充所有玻璃移液管，并将其加载到头部舞台上。将移液器尖端移至显微镜视野并使其聚焦。
如果使用拨号盘在显微镜载物台中移动纵器，请按键盘上的 Z 更新坐标。初级校准将机械手的运动角度和距离转换为显微镜坐标系。机械手以预设距离沿三个方向移动，软件检测显微镜视野内移液器尖端的坐标。
单击加载移液管的相应单元的主 GUI 上的开始校准按钮。随后，通过单击主 GUI 底部的 Save calibration 来保存校准。除非更改了装置的物理组织，否则只需执行一次初级校准。
在此步骤中，将一个脑切片放在记录室的中央。用 Slice Hold Down 或 Harp 稳定脑切片。要检测荧光细胞，请在四倍放大镜下找到感兴趣的区域。
然后，通过打开 click to move 模式并单击感兴趣区域的中心来移动显微镜载物台。或者，使用键盘移动显微镜载物台。接下来，切换到高倍率镜头，并使用键盘上的 RF 沿 Z 轴移动显微镜来调整焦距。
该软件指导显微镜和相机在不同深度拍摄一系列图像。然后，这些图像经过计算机视觉处理以找到荧光标记的细胞。最终输出是检测到的像元坐标列表。
单击主 GUI 色谱柱单位 0 上的 detect cell（检测单元）按钮。如果 TTL 信号无法控制设置的 LED 或激光光源，请手动打开 LED 或激光。如有必要，请关闭 LED 或激光。
单元格坐标列表将出现在内存位置 GUI 中。通过单击从列表中删除不需要的单元格 X 坐标旁边的按钮。或者，如果靶细胞没有荧光标记，请单击主 GUI 上的鼠标模式。
然后，单击感兴趣的单元格，单元格上将出现一个带有数字的黄点，并且单元格的坐标将出现在内存位置 GUI 中。要进行二次校准以检测移液管偏移坐标，请用内部溶液填充玻璃移液管的 1/3。然后，将移液管装到连接到头部载物台的移液管支架上。
在低放大倍率下，使用键盘上的 1 和 2 在单元 1 和单元 2 之间切换。然后，将移液管带入视野并使用键盘调整焦点。接下来，单击 Load calibration（加载校准）加载主校准。
将显微镜镜头切换到高放大倍率，然后在主 GUI 上单击 40 次。将移液管尖端放在中心。然后，单击主 GUI 上正在使用的设备下的二级校准按钮。
要修补目标单元，请单击 patch control 按钮以打开 patch control GUI。单击内存位置 GUI 中坐标列表上感兴趣单元格旁边的 go to 按钮。随后，在主 GUI 中单击设备的 CTM 按钮以启用移动。
单击感兴趣的单元格，将移液器吸头移动到该单元格中。由于机械手的机械限制，当行程超过 500 微米时，可能会出现轻微的定位误差。为防止较大的机械定位误差，应在目标单元附近进行二次校准。
接下来，使用单元 one selected 按钮在两个单元之间切换输入信号。单击 patch control GUI 上的 patch 按钮。将自动修补开始，并且可以在修补控制 GUI 上监控压力和阻力。
自动跳线算法通过一系列逻辑回路监测电阻并控制压力，以形成 gigaseal。弹出窗口通知 gigaseal 的形成。该系统利用电阻变化来识别细胞与表面的接触。
在未及时检测到细胞表面接触的情况下，使用下一步按钮推进修补阶段，同时保持相同的自动修补试验。通过单击补丁控制 GUI 上的相应按钮，随时作自动过程。然后，选择 yes 以结合 Zap 和 ssuction 进行闯入。
或者，选择 no （否） 以仅通过抽吸进行磨合。然后，保存实验补丁日志。此图显示了加载到命令序列 GUI 的选定位置。
左列显示坐标列表，右列以 TTL 信号的形式显示每个位置的命令列表。以下是药物应用实验期间的屏幕截图，对应于三个选定的位置。将 KCL 溶液与红色荧光染料混合以进行可视化。
单元 1 是含 KCL 的移液管，单元 2 是修补移液管。在此图中，阶跃电流注射显示了规则的尖峰神经元。此处显示的是电压钳记录了 500 毫摩尔氯化钾溶液在三个位置局部应用的轨迹。
当氯化钾应用靠近贴片细胞时，试验记录了向内电流的红色痕迹。红色箭头表示氯化钾的应用时间。与手动修补相比，使用这种方法可以在四分钟内进行膜片钳试验，而无需大量培训。
按照此程序，可以执行其他方法，如光遗传学、化学遗传学和药理学作，以回答与您的研究项目相关的问题。该技术开发后，可能为神经科学领域的研究人员探索不同体外制剂中突触受体和离子通道的高通量研究铺平道路。观看本视频后，您应该对如何进行图像引导的自动膜片钳实验有很好的了解。
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概述
本方案描述了一种利用先进的计算机视觉技术进行自动图像引导式膜片钳实验的方法。该方法可提高在急性脑切片中识别和靶向荧光标记细胞的效率。
关键研究组成部分
科学领域
- 电生理学
- 神经科学
- 成像技术
背景
- 膜片钳电生理学技术对于研究神经元活动至关重要。
- 识别和靶向特定细胞可能具有挑战性。
- 自动化技术可提高实验通量。
- 荧光标记有助于细胞的识别。
研究目的
- 自动化检测用于膜片钳实验的荧光标记细胞。
- 提高电生理记录的效率。
- 促进在神经元样本中进行药理学筛选。
使用的方法
- 用于细胞检测的计算机视觉技术。
- 用于记录的自动膜片钳装置。
- 检测与记录过程的整合。
- 在多种体外神经元制备中的应用。
主要结果
- 成功实现细胞识别与膜片钳技术的自动化。
- 提高了电生理实验的通量。
- 在药理学研究中具有潜在应用价值。
- 适用于多种不同细胞类型的广泛适用性。
结论
- 该技术显著提高了实验效率。
- 它解决了传统膜片钳方法中的关键挑战。
- 该方法对神经系统疾病研究具有重要意义。
常见问题
行业重要性概述
自动化的图像引导膜片钳技术解决了神经元电生理学中的通量限制问题，能够对离子通道和突触受体靶点进行可扩展的功能验证。该方法通过降低技术变异性并提高数据密度，支持早期发现阶段的筛选工作，从而在先导化合物识别项目中发挥重要作用。该技术通过从生理学上具有相关性的神经元样本中提供定量、可重复的电生理读出结果，增强了靶点验证中预测结果的可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过直接测量荧光标记细胞中的神经元兴奋性和突触特性，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：减少对专业操作人员的依赖，实现不同用户和实验地点间膜片钳操作的标准化。
- 预测价值：提高每次实验的数据产出量，支持靶点结合与作用机制研究中的统计学严谨性。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：生成标准化的神经元样本，适用于后续的药理学和遗传学筛选实验。
- 定量输出：提供实时电阻和压力参数，可实现自动封接形成检测及流程优化。
- 可扩展性：支持每片组织中多重靶向多个细胞，可在不显著增加操作时间的前提下提高实验通量。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：促进在急性脑切片中研究神经元表型，同时维持原有的神经环路和病理生理环境。
- 转化连续性：通过在不同模型系统间实现一致的检测结果，连接发现阶段的电生理研究与临床前验证。
- 机制性风险降低：可在完整组织中直接评估化合物对离子通道功能和神经元放电模式的影响。
流程与工作流整合
该方法可整合到发现生物学工作流程中，作为靶点识别之后、先导化合物优化之前的功效验证步骤，提供在原代神经元环境中靶点结合的电生理学验证。
- 发现生物学：通过实现对药理学或遗传学扰动下神经元活动的自动化、高保真记录，支持假设验证。
- 筛选：提高检测的可重复性和通量，能够系统性地评估化合物库对神经元兴奋性和突触传递的影响。
- 分析：提供定量的电生理读数（例如，放电频率、输入电阻、电流-电压关系），用于阐明构效关系和靶点选择性。
- 转化研究：通过在急性脑切片中的神经元上进行记录，保持生理相关性，保留天然的表达谱和微环境信号。
- 企业级复用：建立可重复使用的电生理能力，适用于针对离子通道、G蛋白偶联受体（GPCRs）和突触蛋白的多个神经科学发现项目。
运营与企业影响
- 科学价值：通过在生理相关条件下直接、定量地测量神经元功能，提高靶点验证的可信度。
- 操作价值：通过自动化细胞识别、定位和膜片钳操作，提高实验通量并降低变异性。
- 战略价值：在发现流程早期生成可靠的多功能数据，从而加快决策进程。
- 项目组合影响：基于在疾病相关神经环路中确认的电生理调节作用，支持对靶点进行风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 系统设置与故障排除需要具备电生理学、计算机视觉集成以及显微操作器操作方面的专业知识。
- 依赖稳定的荧光标记、合适的膜片钳移液管制备以及环境控制，以维持脑片的健康状态。
- 需要标准化的软件协议和校准程序，以确保不同实验和操作者之间的可重复性。
- 应用于非神经元细胞或离体细胞时，可能需要调整细胞检测算法和膜片钳参数。
- 实际限制包括长距离移动时的机械定位误差，以及可靠细胞检测对最佳荧光信噪比的依赖性。
