自动图像引导贴片夹在脑切片神经元研究中的应用

该协议描述了如何使用最近为标准体外电生理设备开发的系统进行自动图像引导的膜片钳实验。

该技术的总体目标是使用计算机视觉自动检测荧光细胞，并在急性脑切片中对这些细胞进行自动膜片钳。该方法可以帮助克服膜片钳电生理学领域的关键困难，例如荧光标记细胞的识别、靶向和膜片钳。该技术的主要优点是它可以自动检测膜片移液、荧光细胞，并将步骤与自动膜片钳整合。

这项创新显著提高了实验通量。该技术的意义延伸到神经系统疾病的治疗或诊断，因为高通量图像引导自动膜片钳可用于更多生理神经元制剂的药理学筛选。该方法也可应用于其他体外制剂，例如神经元细胞器类型或切片培养物，解离神经元以及任何非神经元细胞。

要开始此过程，请打开放大器、显微镜控制器和机械手控制器。然后，首先更改 Autopatcher IG 的安装目录，从命令行终端使用 python 运行 Autopatcher IG。接下来，键入 Python Autopatcher_IG。

PYW 并按 Enter 键。之后，用内部溶液填充所有玻璃移液管，并将其加载到头部舞台上。将移液器尖端移至显微镜视野并使其聚焦。

如果使用拨号盘在显微镜载物台中移动纵器，请按键盘上的 Z 更新坐标。初级校准将机械手的运动角度和距离转换为显微镜坐标系。机械手以预设距离沿三个方向移动，软件检测显微镜视野内移液器尖端的坐标。

单击加载移液管的相应单元的主 GUI 上的开始校准按钮。随后，通过单击主 GUI 底部的 Save calibration 来保存校准。除非更改了装置的物理组织，否则只需执行一次初级校准。

在此步骤中，将一个脑切片放在记录室的中央。用 Slice Hold Down 或 Harp 稳定脑切片。要检测荧光细胞，请在四倍放大镜下找到感兴趣的区域。

然后，通过打开 click to move 模式并单击感兴趣区域的中心来移动显微镜载物台。或者，使用键盘移动显微镜载物台。接下来，切换到高倍率镜头，并使用键盘上的 RF 沿 Z 轴移动显微镜来调整焦距。

该软件指导显微镜和相机在不同深度拍摄一系列图像。然后，这些图像经过计算机视觉处理以找到荧光标记的细胞。最终输出是检测到的像元坐标列表。

单击主 GUI 色谱柱单位 0 上的 detect cell（检测单元）按钮。如果 TTL 信号无法控制设置的 LED 或激光光源，请手动打开 LED 或激光。如有必要，请关闭 LED 或激光。

单元格坐标列表将出现在内存位置 GUI 中。通过单击从列表中删除不需要的单元格 X 坐标旁边的按钮。或者，如果靶细胞没有荧光标记，请单击主 GUI 上的鼠标模式。

然后，单击感兴趣的单元格，单元格上将出现一个带有数字的黄点，并且单元格的坐标将出现在内存位置 GUI 中。要进行二次校准以检测移液管偏移坐标，请用内部溶液填充玻璃移液管的 1/3。然后，将移液管装到连接到头部载物台的移液管支架上。

在低放大倍率下，使用键盘上的 1 和 2 在单元 1 和单元 2 之间切换。然后，将移液管带入视野并使用键盘调整焦点。接下来，单击 Load calibration（加载校准）加载主校准。

将显微镜镜头切换到高放大倍率，然后在主 GUI 上单击 40 次。将移液管尖端放在中心。然后，单击主 GUI 上正在使用的设备下的二级校准按钮。

要修补目标单元，请单击 patch control 按钮以打开 patch control GUI。单击内存位置 GUI 中坐标列表上感兴趣单元格旁边的 go to 按钮。随后，在主 GUI 中单击设备的 CTM 按钮以启用移动。

单击感兴趣的单元格，将移液器吸头移动到该单元格中。由于机械手的机械限制，当行程超过 500 微米时，可能会出现轻微的定位误差。为防止较大的机械定位误差，应在目标单元附近进行二次校准。

接下来，使用单元 one selected 按钮在两个单元之间切换输入信号。单击 patch control GUI 上的 patch 按钮。将自动修补开始，并且可以在修补控制 GUI 上监控压力和阻力。

自动跳线算法通过一系列逻辑回路监测电阻并控制压力，以形成 gigaseal。弹出窗口通知 gigaseal 的形成。该系统利用电阻变化来识别细胞与表面的接触。

在未及时检测到细胞表面接触的情况下，使用下一步按钮推进修补阶段，同时保持相同的自动修补试验。通过单击补丁控制 GUI 上的相应按钮，随时作自动过程。然后，选择 yes 以结合 Zap 和 ssuction 进行闯入。

或者，选择 no （否） 以仅通过抽吸进行磨合。然后，保存实验补丁日志。此图显示了加载到命令序列 GUI 的选定位置。

左列显示坐标列表，右列以 TTL 信号的形式显示每个位置的命令列表。以下是药物应用实验期间的屏幕截图，对应于三个选定的位置。将 KCL 溶液与红色荧光染料混合以进行可视化。

单元 1 是含 KCL 的移液管，单元 2 是修补移液管。在此图中，阶跃电流注射显示了规则的尖峰神经元。此处显示的是电压钳记录了 500 毫摩尔氯化钾溶液在三个位置局部应用的轨迹。

氯化钾应用靠近贴片细胞时，试验记录了向内电流的红色痕迹。红色箭头表示氯化钾的应用时间。与手动修补相比，使用这种方法可以在四分钟内进行膜片钳试验，而无需大量培训。

按照此程序，可以执行其他方法，如光遗传学、化学遗传学和药理学作，以回答与您的研究项目相关的问题。该技术开发后，可能为神经科学领域的研究人员探索不同体外制剂中突触受体和离子通道的高通量研究铺平道路。观看本视频后，您应该对如何进行图像引导的自动膜片钳实验有很好的了解。