定量，单细胞在全安装胚珠在染色质修饰和核体系结构分析的有效方法拟南芥
2014年6月19日
我们在这里提供了一个高效，可靠的协议进行免疫染色，荧光原位杂交，DNA染色后在整个安装拟南芥胚珠定量，高分辨率成像。该方法已成功地用于分析染色质修饰和核架构。
该程序的总体目标是准备用于全安装杂交和免疫染色的拟南芥 Vues。这是通过首先将新鲜的花蕾固定在固定液中来实现的。第二步是将 vues 仔细解剖并直接嵌入微型丙烯酰胺垫中，直接放在显微镜载玻片上。
接下来，组织处理可实现组织澄清和渗透。最后一步是将处理过的样品与抗体溶液进行免疫染色或标记探针进行 C 2 荧光杂交孵育。最终，高分辨率共聚焦成像后进行三维重建，允许在单细胞水平进行整体定量分析。
该方法最初用于提供对视图中 CT 组织的见解，但它也可以应用于分析跳入其他组织和其他模式生物中的其他细胞隔室中，放入装有新鲜制备的 BBO 缓冲液的微量离心管中，每管在冰上以 20 至 30 个腕骨冷却，将管在室温下轻轻摇动半小时。接下来，以 400 Gs 的速度将试管旋转 1 分钟，然后小心吸出上清液，丢弃它们，并向腕骨中加入一毫升 PBT。将管子放在冰上，以便每根腕管安装。
在冰上做好准备。5 个试管，含 200 μL。新鲜制作的 5% 丙烯酰胺混合物。
五张用铅笔标记的干净的超级霜载玻片，一根腕管的 20%a PS 的 Eloqua 和 20%NAPS 的 A Eloqua 的 A 思想 Eloqua。用切端尖端取 4 或 5 个，将它们分别放在一张载玻片上。使用细针小心移液，去除多余的液体。
在腕骨上做纵向切割，拿走腕壁以释放一排排的 vues。此步骤需要练习。通过添加最多 10 微升 PBS，然后加入到含有丙烯酰胺混合物的微量离心管中来防止 vues 干燥。
快速添加 12 μL 的 NAPS 和 12 μL 的 PS。用移液将溶液充分混合，并快速加入 30 μL 这种活性丙烯酰胺。混合到带有剖析 vue 的幻灯片上。轻轻地将一个小盖玻片放在制备物上，让溶液在室温下聚合约一小时。
稍后以这种方式准备每张幻灯片。使用剃须刀片削掉盖玻片。样品可以在 4 摄氏度下与 PBS 一起储存在共计染色缸中过夜，也可以直接进行处理。
通常，应在装有 80 毫升溶液的 coplan 罐中进行加工。在通风橱下。首先通过在甲醇乙醇系列溶液中孵育来澄清组织，这是一种一对一的乙醇二甲苯溶液，然后再次在乙醇中孵育，然后在甲醇中孵育。
每次沐浴时间为 5 或 30 分钟。请参阅文本协议。接下来，使用含 2.5% 甲醛的一对一甲醇 PBT 溶液 15 分钟。
然后在 PBT 中冲洗组织两次，每次浸泡 10 分钟。在此之后，如有必要，可以将载玻片在 4 摄氏度下储存过夜。接下来，从罐子中取出最多六张载玻片，沥干多余的液体。
将它们放在薄纸上，并快速加入 100 微升冷冻的细胞壁消化酶。混合到垫子上。然后用大盖玻片盖住载玻片。
将玻片在 37 摄氏度的潮湿室中孵育 2 小时。优化每种新酶溶液的 CO 消化温度非常重要，因为此步骤对于以后的均一染色至关重要。用 PBT 洗涤玻片两次，每次洗涤 5 分钟。
然后现在将载玻片排空到每张载玻片上。加入 100 微升 RNAS A 的 PBS 中，用 1% 吐温完成，孵育后在潮湿的室中将载玻片在 37 摄氏度下孵育一小时，像以前一样用 PBT 洗涤载玻片两次，然后通过将载玻片在新鲜制备的 PBTF 浴中孵育 20 分钟再次固定组织。用 PBT 洗涤一次 10 分钟冲洗掉 PBTF。
然后通过将载玻片在 PBS 中与 2%吐温在 4 摄氏度下孵育 2 小时进行组织渗透。在 PBT 中洗涤两次，每次 5 分钟，以去除可渗透溶液。然后进行免疫染色。
首先在目标一抗中孵育载玻片。将 100 微升等分试样的抗体用 PBS 稀释，并在每张载玻片之间加入 0.2%。将玻片转移到潮湿的腔室中，并在 4 摄氏度下孵育 12 至 24 小时。
在 PBT 浴中洗涤玻片 2 到 4 小时，并在室温下轻轻摇动。接下来，加入 100 微升二抗，在 PBS 中稀释 1 至 200 份，浓度在 20 之间，浓度为 0.2%，并在 4 摄氏度下孵育玻片 24 小时。在 PBT 中轻轻摇动浸泡 1 小时，即可清洗未结合的二抗载玻片。
然后用每毫升 10 μg 碘化丙啶的 PBS 溶液对 DNA 进行复染。让染色持续 15 分钟，然后在室温下用 PBT 轻轻摇动洗涤玻片 15 分钟。现在用补充有 10 μg/mL 碘化丙啶的抗褪色培养基封片。
静置一小时后，使用 63 x 甘油浸没透镜在共聚焦显微镜上对载玻片进行成像。因此，在图像采集过程中，保持样品之间的扫描设置相同以实现比较定量并使用线性检测模式至关重要。然后将序列图像重建为三维结构，分割每个感兴趣的原子核，并使用 3D 图像处理软件量化信号。
使用这种强大的大规模制备方案，整个 Mount Vue 将保留其三维结构。亚细胞结构变得清晰可见，细节丰富，就像染色质一样。当 DNA 染色时，异质染色质显示为明亮且明确的病灶，无需应用反卷积。
该方案允许在一轮中使用多种抗体进行平行免疫染色。例如，在不同的复制玻片上，在一项实验中检测到 U 染色质相关允许标记物 H 3 三甲基化赖氨酸 4 和异质染色质相关标记物 H 3 单甲基赖氨酸 27，以分析染色质动力学。另一种兼容的技术是荧光 C 两次杂交或鱼到 45 s.核糖体。
DNA 重复序列用于定义核组织区域。探针直接用 Alexa 4 88 标记，DNA 进行反染对于化分析，测试不同的和体的稀释度和孵育时间非常重要，以确定以尽可能低的速率提供稳健和 hogene 信号的条件。还有身体的忏悔。
由于这种方法实现了组织的良好保存和染色质组织单细胞分析的最佳渗透性，因此它为植物细胞生物学或植物表观遗传学领域的科学家在单细胞水平和全人环境中研究细胞核或亚细胞组织铺平了道路。
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概述
本文介绍了一种在整个拟南芥胚珠中进行免疫染色和荧光原位杂交（FISH）的可靠协议。该方法通过高分辨率成像允许分析染色质修饰和核结构。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物生物学
- 细胞生物学
- 成像技术
背景
- 免疫染色对于在组织中可视化特定蛋白质至关重要。
- 荧光原位杂交（FISH）能够定位核酸。
- 整体技术允许对植物结构进行全面分析。
- 拟南芥作为植物研究中的模式生物。
研究目的
- 开发一个在拟南芥胚珠中进行有效免疫染色和FISH的协议。
- 促进染色质修饰的研究。
- 增强对植物细胞核结构的理解。
使用的方法
- 用固定液固定新鲜花蕾。
- 在显微镜载玻片上的丙烯酰胺垫中解剖和嵌入胚珠。
- 组织处理以实现阐明和渗透。
- 用抗体溶液或标记探针孵育以进行成像。
主要结果
- 成功应用免疫染色和FISH的协议。
- 实现了高分辨率共聚焦成像。
- 在单细胞水平上进行定量分析。
- 获得了对染色质修饰和核结构的见解。
结论
- 开发的协议对研究拟南芥胚珠是高效和可靠的。
- 它为植物细胞生物学提供了宝贵的见解。
- 该方法可以应用于植物科学中的各种研究问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables high-resolution, quantitative single-cell analysis of chromatin modification and nuclear architecture in whole-mount plant tissues, addressing a key technical barrier in plant epigenetics research. By preserving tissue integrity while enhancing reagent permeability, it supports reproducible imaging and downstream applications such as immunostaining and FISH. The approach provides a scalable platform for mechanistic de-risking in target validation pipelines involving chromatin-associated mechanisms in plant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chromatin states and nuclear organization at single-cell resolution in reproductively relevant plant tissues.
- Operational Value: Facilitates preservation of native tissue architecture during immunostaining and FISH workflows.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, high-resolution imaging readouts for chromatin marks and nuclear architecture.
- Operational Value: Standardizes sample preparation for parallel multi-antibody immunostaining and probe-based hybridization assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports analysis of epigenetic dynamics in germ-line precursor cells, relevant to hereditary trait transmission.
- Operational Value: Enables longitudinal imaging of the same tissue context across developmental stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where chromatin modification states inform target confidence and pathway validation in plant-based systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of chromatin regulator function through direct visualization of modification patterns.
- Screening: Delivers reproducible, permeabilized tissue preparations suitable for antibody and nucleic acid probe penetration.
- Analytics: Enables 3D reconstruction and quantitative signal segmentation from confocal imaging data.
- Translational Research: Connects chromatin state observations to functional outcomes in gametophyte development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue preparation platform applicable across multiple antibody panels and nucleic acid probes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in chromatin-associated phenotypes through direct, quantitative nuclear imaging.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability of whole-mount immunostaining and FISH in plant tissues.
- Strategic Value: Increases confidence in target validation by linking chromatin modifications to nuclear architecture at single-cell resolution.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of epigenetic targets in plant trait development programs.
Implementation Considerations
- Expertise in plant tissue fixation, dissection, and acrylamide embedding techniques.
- Access to confocal laser scanning microscopy and 3D image processing software.
- Standardization of reagent permeation and blocking steps across laboratories.
- Adaptation considerations for varying tissue density and developmental stages in plant models.
- Optimization of antibody and probe incubation conditions to balance signal specificity and background.
