一种用于整体封片胚珠中染色质修饰与细胞核结构的高效定量单细胞分析方法 拟南芥

本实验的总体目标是制备适用于整体原位杂交和免疫染色的拟南芥花蕾样本。首先，将新鲜的花蕾用固定液进行固定；第二步，直接在显微镜载玻片上的微型丙烯酰胺凝胶垫中仔细解剖并包埋花蕾。

接下来的组织处理步骤可实现组织透明化和通透化。最后一步是将处理后的样品与抗体溶液孵育以进行免疫染色，或与标记探针孵育以进行荧光双杂交。最终，通过高分辨率共聚焦成像并结合三维重建，可在整体样本中实现单细胞水平的定量分析。

该方法最初用于研究CT在视图中的组织结构，但也可应用于分析浸入式样本中其他组织的其他细胞区室，以及其它模式生物。将微离心管中加入新配制的、冰上预冷的BBO缓冲液，每管放入20至30个腕骨，然后将试管置于室温下轻轻摇动半小时。接着，在400 ×g条件下离心1分钟，小心吸除上清液并弃去，向腕骨中加入1毫升PBT。每管腕骨置于冰上，以备后续制片。

已在冰上预先准备好。五个试管，每管含 200 微升新鲜配制的 5% 丙烯酰胺混合液。

五张用铅笔标记的洁净Super Frost载玻片，一管来自腕骨的含20% PS的Eloqua溶液，以及一管含20% NAPS的Eloqua溶液。取四到五个带有切割末端的组织块，分别放置于每张载玻片上。使用细针小心吸取，去除多余液体。

在腕骨上做纵向切口，并移除腕骨壁以释放成排的vues。此步骤需要练习。通过加入最多10 µL的PBS防止vues干燥，然后将其转移至含有丙烯酰胺混合液的微量离心管中。

迅速加入 12 微升 NAPS 和 12 微升 PS 混合液。用移液器充分混匀后，立即加入 30 微升活化的丙烯酰胺。将混合液滴加到载玻片上的分离组织样本上。轻轻盖上一块小盖玻片，室温下静置约一小时，使溶液充分聚合。

随后以相同方式制备每张载玻片。使用刀片将盖玻片剔除。样品可在含有 PBS 的共沉淀染色缸中于 4°C 下保存过夜，或直接进行后续处理。

通常应在 Coplan 瓶中使用 80 毫升溶液进行处理，并在通风橱内操作。首先将组织依次浸入甲醇-乙醇（1:1）溶液、乙醇-二甲苯（1:1）溶液，再依次浸入乙醇和甲醇溶液中孵育以进行透明处理。

每次浸泡时间为5分钟或30分钟。参见文字版实验方案。接下来，使用含2.5%甲醛的甲醇PBT溶液（1:1）处理15分钟。

然后用PBT清洗组织，每次10分钟，共清洗两次。此后，如有需要，可将载玻片在4摄氏度下过夜保存。接下来，从瓶子中取出最多六张载玻片，并沥去多余液体。

将它们置于一张纸巾上，迅速加入100微升预冷的细胞壁消化酶，混匀至完全覆盖组织块。然后用大片盖玻片盖住载玻片。

将切片置于湿盒中，在 37 摄氏度下孵育 2 小时。由于此步骤对后续均匀染色至关重要，因此为每种新配制的酶溶液优化 CO 消化温度非常重要。用 PBT 洗涤切片两次，每次 5 分钟。

然后将液体从载玻片上沥干，并向每张载玻片加入100 µL含有1%吐温的PBS配制的RNAs A溶液，在湿盒中37°C孵育1小时。孵育结束后，用PBT如前所述洗涤载玻片两次，然后将载玻片置于新配制的PBTF溶液中孵育20分钟，再次固定组织。最后用PBT洗涤一次，持续10分钟，以去除残留的PBTF。

然后将切片在含有2%吐温的PBS中4°C孵育2小时，进行组织通透。用PBT溶液洗涤两次，每次5分钟，以去除通透液。随后进行免疫染色。

首先将载玻片与目标一抗在湿盒中4摄氏度孵育12至24小时。每张载玻片上加入100 µL用PBS稀释并含0.2% Tween的抗体等分试样。

将切片置于PBT溶液中，在室温下轻轻摇动孵育2至4小时。接着，加入100微升用含0.2%吐温20的PBS按1:200稀释的二抗，在4°C孵育24小时。用PBT溶液在室温下轻轻摇动洗涤1小时，即可充分去除未结合的二抗。

然后用含10 µg/mL碘化丙啶的PBS溶液对DNA进行复染。染色持续15分钟，随后用PBT在室温下轻轻振荡洗涤载玻片15分钟。接着用含有10 µg/mL碘化丙啶的抗荧光淬灭封片剂封片。

静置一小时后，使用63倍甘油浸没镜头在共聚焦显微镜上对切片进行成像。在图像采集过程中，必须保持各样本之间的扫描设置完全一致，以实现定量比较，并应采用线性检测模式。随后将连续的二维图像重建为三维结构，分割每个感兴趣的细胞核，并利用三维图像处理软件对信号进行定量分析。

通过这一可靠的规模化制备方案，全组织样本将保持其三维结构。亚细胞结构可被清晰显现，例如染色质等，细节丰富。在DNA染色中，异染色质呈现为明亮且界限清晰的焦点，无需进行去卷积处理即可观察。

本方案允许在一轮实验中同时进行多种抗体的免疫染色。例如，在不同重复切片上的一次实验中，可同时检测与常染色质相关的容许性标志物——组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化（H3K4me3），以及与异染色质相关的标志物——组蛋白H3第27位赖氨酸单甲基化（H3K27me1），以分析染色质动态变化。另一种兼容的技术是荧光原位杂交（FISH），可用于检测45S核糖体RNA。

利用DNA重复序列来定义细胞核内的组织区域。探针直接用Alexa 488标记，DNA经复染以进行鉴定分析。为获得强而均一的信号并尽可能降低背景，测试不同的抗体稀释度和孵育时间以确定最佳条件至关重要。

由于该方法能够实现对组织的优异保存以及对染色质结构进行单细胞分析的最佳通透性，因此为植物细胞生物学或植物表观遗传学领域的科学家研究整个生物体背景下细胞核或亚细胞结构的单细胞水平组织提供了途径。