秀丽隐杆线虫 用于免疫荧光和DAPI染色的性腺解剖和冷冻裂缝

这种解剖和免疫荧光的方法被许多秀丽隐杆线虫实验室使用。它可以用于检测抗体或标记融合蛋白可用于的任何蛋白质。尽管需要一些练习才能正确进行此剖析，但该协议灵活且易于故障排除。

对我们来说，DAPI染色总是有效的，我们通常可以找到一种适用于每种抗体的条件。这种技术的最大挑战是解剖步骤。您必须快速但自信地工作才能获得良好的种系挤出。

实践是关键。首先，将固定载玻片放在解剖显微镜的载物台上，并将盖玻片放在固定载玻片的顶部。然后，将四微升的解剖溶液移液到盖玻片的中心，并将固定载玻片移动到载物台的一侧以释放视野。

从NGM平板中挑选10至20个雌雄同体到解剖溶液中。最好每张幻灯片选择大约 10 张，但不要太多，以至于它们无法在五分钟内解剖。要解剖动物，将针尖交叉成X形，并使用X的底部将成虫固定在盖玻片的表面上。

接下来，将X形放在咽部后面，大约是年轻人身体长度的五分之一或头部透明部分的正下方。然后，用一个剪刀动作将动物斩首，从体腔中完全释放，以及肠道的一半或两半。要用甲醛固定样品，请将四微升固定溶液移液到盖玻片上，非常靠近动物的液滴，同时避免直接移液到解剖液滴中并置换解剖的尸体。

用一根手指将盖玻片固定到固定载玻片上。用另一只手轻轻轻弹盖玻片几次以混合滴剂。将带正电荷的载玻片正面朝下握住，用它轻轻触摸样品液滴来拾取载玻片中心的盖玻片，液滴的表面张力将拾取盖玻片。

将载玻片放在工作台上，在室温下固定五分钟。在此期间，用铅笔标记幻灯片。要使用液氮冷冻裂解样品，同时用镊子保持载玻片的标记边缘，请轻轻将其降低到液氮中。

松开载玻片，使其靠在烧杯的侧面，盖玻片面朝上，载玻片在 10 秒内冻结。如果使用干冰冷冻，用剃须刀刮掉铝块表面的霜后，牢固地握住载玻片的标签边缘并将其放在清除的表面上，向下施加一些压力以确保与块完全接触。当盖玻片下的样品变成冰时，冻结发生在 10 秒内。

通过牢牢抓住载玻片标记的短边缘来取出冻结的载玻片，并将一个长刃支撑在工作台上。用另一只手牢牢握住剃须刀，将剃须刀的边缘滑下载玻片，将盖玻片从样品上滑落并离开。立即将载玻片放入含有95%乙醇的Coplin罐中，并将载玻片置于乙醇中至少五分钟。

然后，在PBST中洗涤载玻片三次，每次在室温下洗涤五分钟，同时每次洗涤使用新鲜的PBST。种系细胞核的荧光成像结果表明，DAPI与DNA结合强烈。当靶向RAD-51（双链断裂的标志物）的抗体作为离散病灶存在于瞳孔核内，共定位在由DAPI标记的染色体上时，免疫荧光染色是有效的。

kle-2杂合子突变体在染色体结构上存在轻微缺陷，如DAPI染色略有紊乱和双链断裂数增加所示，反映在RAD-51病灶数量增加。解剖和冷冻裂纹步骤都可能很棘手，因此快速平稳地工作非常重要。我们建议在尝试整个协议之前练习这些步骤。

例如，您可以练习在更大体积的液体（如 200 微升）中解剖，然后在盖玻片中逐渐降低到我们推荐的 4 微升体积。该技术可用于共聚焦或结构照明显微镜上的高分辨率成像，也可以与DNA或RNA-FISH，荧光原位杂交结合使用，以可视化蛋白质相对于特定序列的定位方式。