非人灵长类龙脱细胞和Recellularization使用专门的大型器官生物反应器

该程序的总体目标是从 Reus Maccas 的肺部分离整个器官生物基质，并将这些基质用作研究肺组织工程应用的支架。这是通过首先用去污剂、盐和酶使整个罗伊斯玛卡肺脱细胞来实现的。第二步是将脱细胞的肺支架安装到生物反应器中，该生物反应器能够为气道通气并用液体细胞培养基灌注肺血管系统。

接下来，肺支架通过气道与干细胞和通过肺血管系统与内皮细胞就位。最后一步是在生物反应器提供的通气和灌注条件下，在肺支架内培养所需的细胞时间，然后分析所得的细胞和组织形态。最终，用干细胞和内皮细胞对脱细胞玛卡肺支架进行再化，产生模拟天然肺组织的解剖学和组织学特征的工程组织。

这种方法可以帮助回答肺组织工程领域的关键问题，例如干细胞或祖细胞是否可以单独或与成熟的肺上皮细胞和内皮细胞一起用于再生肺组织。该技术的意义延伸到终末期肺病的治疗，因为用患者来源的干细胞或祖细胞对脱细胞肺基质进行化有可能增加可用于肺移植的供体肺的数量。此外，使用患者自身的干细胞设计的肺可能对免疫排斥反应具有抵抗力。

当我们观看耶鲁大学 Laura Nicholson 博士实验室成员之前发布的 Joe 视频时，我们第一次想到了这种方法。在这里，我们介绍了他们对啮齿动物程序的修改，以适应我们的大型动物 Resus Meac 模型的需求。在处理玛卡组织时，必须格外小心，以防止感染性暴露事件。

在处理非人类灵长类动物组织之前，请穿戴个人防护设备，包括外科口罩、面罩、一层外科手套、一次性防护服和第二层外科手套，肺部平躺在解剖托盘中，使用带有适当大小的倒钩的母诱饵连接器插管肺动脉。用酒精消毒的扎带将套管固定到位。将塑料扎带套在气管上。

将母诱饵连接器插入气管开口，并拧紧连接器倒钩周围的扎带，以将气管固定在倒钩周围。通过滴注磷酸盐缓冲盐水或含有每毫升 30 单位肝素和每毫升 5 微克硝基压制钠侧的 PBS，清除肺部滞留的空气。缩写的 SNP 允许在重复之前通过自然反冲将溶液排出。

在使用 PBS 肝素 SNP 溶液进行第三次气道安装后再安装两次。用诱饵塞盖住气管诱饵套管。切开心尖，用 PBS 肝素 SNP 灌溉内心室，以去除残留的血液撕裂两个心房，以促进灌注时肺回路的引流。

将装满 PBS 肝素 SNP 溶液的 60 cc 注射器连接到肺动脉套管上，然后小心地取下柱塞，让液体流入脉管系统。从气管插管上取下塞子，让气道中的液体通过自然反冲排出。继续灌注，直到从肺血管系统中排出尽可能多的血液。

该程序最困难的方面是有效地冲洗和清洗肺气道 对于液体，液体流动相对于气体受到抑制，因为气道不是用来传导液体的，需要时间和患者来完成这些步骤，我们建议继续执行该方案，尽管随着脱细胞的进行和细胞碎片的冲洗，气道中仍有残留液体， 液体粘度将保持低，肺部将能够有效地排出液体 第一天。将心肺阻滞浸入去离子水中，使用分别连接到浸没气管和动脉插管的 60 cc 注射器用去离子水给肺充气和灌注肺。用去离子水有效地重复气道和血管清洗。

洗涤 5 次后，再漂洗 4 次，总共漂洗 5 次，每次约 0.5 至 1 升，将肺从水中取出，并将块浸入 Triton 溶液中。用 Triton 溶液充气并灌注肺部。和以前一样，第二次重复安装，并将浸没的器官在 Triton 溶液中于 4 摄氏度孵育过夜。

孵育过夜后，从 Triton 溶液中取出肺阻滞，并用去离子水外部洗涤。然后将块浸入新鲜的去离子水中。将去离子水滴入气管和肺动脉五次，以洗去 Triton 溶液和细胞碎片。

从去离子水中取出肺，浸入 2% 脱氧涂层钠或 SDC 溶液中。以相同的方式用 SDC 溶液充气和灌注。第三天将肺浸入 4 摄氏度的 SDC 溶液中过夜。

再次用去离子水从外部清洗组织，并通过气道和脉管系统清洗组织五次。和以前一样，从去离子水中取出组织并浸入一摩尔氯化钠溶液中。像以前一样用氯化钠溶液充气和灌注，然后用去离子水冲洗五次氯化钠溶液，将肺部洗干净后，在室温下将组织浸入氯化钠溶液中 1 小时。

和以前一样，将它们浸泡在新鲜的 DNA 溶液中，并将这种溶液滴入气道和脉管系统。在室温下将肺在 DNA 溶液中孵育 1 小时。然后从 DNA 溶液中取出肺，并用 PBS 溶液外洗。

将肺浸入 PBS 溶液中，并通过气道和脉管系统洗涤该溶液五次。和以前一样，在第四天将肺储存在密封容器中的 PBS 溶液中过夜。用新鲜的冰冷 PBS 溶液通过气道和脉管系统清洗肺部五次。

然后将它们储存在 PBS 溶液中，置于 4 摄氏度的无菌密封容器中直至使用。根据示意图在层流罩下组装生物反应器组件。在文本方案中，在生物反应器中使用之前，用已平衡至细胞培养箱的 5%CO 2 气氛的培养基填充主腔室，将气管和血管插管适配器套在肺插管上。

通过将肺部浸泡在培养基中并将套管适配器连接到改良盖子中的相应端口，将器官安装在主生物反应器室中。连接后，将盖子牢固地固定上。在注射期间，腔室不会再次打开，使用注射器端口和装有 60 号 18 号针头的 18 CCC 注射器从管道中吸出空气，移动三向截止旋塞的方向，以引导液体流入注射器。

将密封、连续连接的生物反应器室和已安装的器官移至组织培养箱中，以平衡温度和气体。使用连接到主腔的注射泵为肺部通气，大约每两分钟满呼吸一次，并通过蠕动泵以每分钟约 10 毫升的速度灌注脉管系统，气道就位总共 30 分钟。通过连接到呼吸回路中三向截止旋塞的注射器端口轻轻注射，用细胞悬液给肺部充气。

将肺静态保持在 37 摄氏度、5% CO2 下过夜，无需气道或血管灌注，以使细胞附着在脱细胞的肺基质上。过夜孵育后，重新启动标准气道通气程序和培养，器官进行 3 至 7 天的血管就位。通过旋转位于连接这两个隔室的管道中的旋塞阀，可以使用蠕动泵逐渐接种内皮细胞，同时在接种完成后使用磁力搅拌轻轻搅拌，从而将流路的方向性从主室更改为内皮座储液器。

踩踏灌注并静态孵育约 4 至 6 小时。用主腔培养基以大约 10 mL/min 的速度重新开始血管灌注。培养 3 至 7 天，持续血管灌注，同时进行气道通气培养期。

在整个脱细胞过程中，MCCA 肺表现出进行性美白，最终在脱细胞过程结束时呈现半透明外观。然而，肺保持了其大体解剖特征，并且在很大程度上保持弹性，并且能够在用液体充气后产生自然反冲。在微观层面。

脱细胞后组织学超微结构保持完整。那就是支气管、呼吸支气管、肺泡囊。血管和毛细血管仍然可以通过低倍显微镜非常清楚地区分。

然而，组织学显微解剖学表明，虽然肺的大体解剖结构和超微结构受到脱细胞的轻微干扰，但组织完全缺乏完整的细胞，如图所示。脱细胞组织中仅保留微量 DNA。此外，通过醇沉淀浓缩并在 0.8% AROS 凝胶中可视化的痕量 DNA 主要由低分子量降解片段组成。

通过天然和脱细胞肺蛋白的 western blot 分析评估细胞蛋白去除的效率。使用 β 肌动蛋白抗体的裂解物，β 肌动蛋白很容易在天然肺裂解物中检测到，但在脱细胞的肺裂解物中则不然，这表明在用玛卡骨髓来源的间充质干细胞或 BMC 和生物反应器培养物进行气道接种后 14 天，脱细胞作用显着耗尽了细胞并去除了细胞相关蛋白物质，大约每两分钟有一个吸气呼气周期。脱细胞玛卡肺的实质被有效化。

BMC 排列在牙槽隔膜上，同时保持清晰开放的肺泡腔。使用生物反应器的 BMC 也对大气道的裸露基质进行塑形，培养 14 天后，主支气管的管腔表面衬有单层鳞状 BMCs。在所示的生物反应器中，在用微血管内皮细胞接种脉管系统后 5 天，用内皮培养基以每分钟 5 毫升的速度提供恒定的血管灌注，这是一个脱细胞的雷乌斯肺叶。

组织学分析显示肺实质中小脉管系统的细胞。在某些情况下，细胞似乎通过跨管腔的几个细胞投影附着在基质上，而血管的其他横截面则显示细胞衬在内皮表面，具有清晰的管腔。遵循此过程。

可以进行免疫组织化学、蛋白质印迹和定量实时 PCR 等其他方法，以回答其他问题，例如接种的干细胞在无细胞肺基质上培养后是否分化为肺系细胞，或者是否与生物反应器内的成熟上皮细胞和内皮细胞分化为肺系细胞。看完这个视频，我们应该对如何使非人灵长类动物肺脱细胞，然后用得到的脱细胞肺作为支架，在生物反应器系统中培养干细胞、上皮细胞和内皮细胞。不要忘记，与非人类灵长类动物组织一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴完整的个人防护设备，包括面罩和双层乳胶或丁腈手套。