Name: 非人灵长类龙脱细胞和Recellularization使用专门的大型器官生物反应器 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-15T20:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 45 s
Description: 了解非人灵长类恒河猴肺器官去细胞化技术，使用生物反应器进行血管灌注和通气培养，将干细胞与内皮细胞接种于脱细胞支架，构建具有天然肺组织解剖学特征的工程化肺组织，为再生医学和肺移植提供新策略。

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作者谨向《组织工程学》（Tissue Engineering）的编辑致谢，感谢其允许在本报告中使用此前发表文章中的图片。

1. 全器官猕猴肺脱细胞
<ol>
	<li>溶液的制备
	<ol>
		<li>将10-15 L去离子水（dH2O）分装至1-2 L瓶中，进行高压灭菌。</li>
		<li>在磁力搅拌器上搅拌的同时，将1 ml Triton X-100加入999 ml dH2O中，配制&#34;Triton溶液&#34;（0.1% Triton X-100溶于dH2O）。使用0.22 µm滤器装置过滤该溶液，并于室温保存。</li>
		<li>在搅拌条件下，缓慢将20 g脱氧胆酸钠（SDC）加入约900 ml dH2O中，配制&#34;SDC溶液&#34;（2% SDC溶于dH2O）。待SDC完全溶解后，将溶液转移至量筒中，并用dH2O定容至1 L。使用0.22 µm滤器装置过滤该溶液，并于室温保存。</li>
		<li>将58 g NaCl加入约900 ml dH2O中，搅拌至完全溶解，配制&#34;NaCl溶液&#34;。再用dH2O补足至终体积1 L，过滤后于室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>器官准备
	<ol>
		<li>处理猕猴组织时，必须格外小心以防止感染性暴露事件。在接触非人灵长类动物组织前，应穿戴以下个人防护装备（PPE）：外科口罩、面罩、外科手套、一次性防护服以及第二层外科手套。</li>
		<li>从动物尸检中采集完整的心肺组织块，并将其置于含50 U/ml肝素的PBS中，以防止外部血液凝固。</li>
		<li>将肺平放在解剖盘中，使用适当尺寸的带倒刺雌性鲁尔接头插管肺动脉。用经酒精灭菌的扎带固定插管位置。</li>
		<li>在气管周围套上无菌扎带，将一个0.250英寸&#160;雌性鲁尔接头插入气管开口，然后收紧扎带，使气管紧固在接头倒刺周围。</li>
		<li>通过灌注含30 U/ml肝素和5 µg/ml硝普钠（SNP）的PBS溶液排出肺内滞留空气。让溶液依靠肺的自然回缩力排出，并重复灌注两次。第三次灌注后，用鲁尔帽封闭气管插管，使液体保留在肺内。</li>
		<li>剪除心脏心尖部分，并用PBS-肝素-SNP溶液冲洗心室内腔，以清除残留血液。切开双侧心房，以便灌注时促进肺循环系统的引流。</li>
		<li>将心肺组织块浸入dH2O中。用60 ml注射器吸取PBS-肝素-SNP溶液。用镊子将动脉插管完全浸入水中，使血管开口处的所有气泡逸出。连接注射器，小心抽出活塞，使液体缓慢流入血管系统。</li>
		<li>取下气管插管上的堵头，让气道内的液体依靠肺的自然回缩力排出。持续向连接血管插管的注射器中添加PBS-肝素-SNP溶液，以维持动脉上方约15-20 cm H2O的压力。持续灌注，直至尽可能清除肺血管系统中的血液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱细胞处理
	<ol>
		<li>第1天：将心肺组织块浸入dH2O中。分别通过连接在浸没状态下的气管和动脉插管上的60 ml&#160;注射器，对肺进行充气和灌注dH2O。重复气道和血管冲洗共5次（包括首次），即用dH2O清洗5轮。</li>
		<li>将肺从水中取出，浸入Triton溶液中。如前法对肺进行Triton溶液的充气与灌注。再次重复灌注一次，随后将浸没的器官置于Triton溶液中于4 °C下过夜孵育。</li>
		<li>第2天：过夜孵育后，将肺组织块从Triton溶液中取出，用dH2O外部清洗，再将组织块浸入新鲜dH2O中。按照步骤&#160;1.3.1的方法重复dH2O清洗5次。</li>
		<li>将肺从dH2O中取出，浸入SDC溶液中。按照步骤1.3.2的方法，以相同方式对肺进行SDC溶液的充气与灌注。将组织块浸没于SDC溶液中于4 °C下过夜孵育。</li>
		<li>第3天：按照步骤1.3.1的方法再次用dH2O清洗组织。</li>
		<li>将组织从dH2O中取出，浸入NaCl溶液中。按照步骤1.3.2的方法，以相同方式对肺进行NaCl溶液的充气与灌注。将组织浸没于NaCl溶液中，在室温下孵育1小时。</li>
		<li>按照步骤1.3.1的方法，用dH2O彻底清洗肺组织以去除NaCl溶液。</li>
		<li>新鲜配制&#34;DNase溶液&#34;（30 µg/ml DNase、1.3 mM MgSO4、2.0 mM CaCl2溶于dH2O）。将肺浸入该溶液中，并如步骤1.3.2所述向气道和血管系统灌注该溶液。将肺在DNase溶液中于室温下孵育1小时。</li>
		<li>新鲜配制&#34;PBS溶液&#34;（1x PBS + 5x抗生素/抗真菌剂）。将肺从DNase溶液中取出，用PBS溶液进行外部清洗。将肺浸入PBS溶液中，按照步骤1.3.1的方法清洗5次。</li>
		<li>将肺置于密封容器中的PBS溶液中，于4 °C下过夜保存。次日（第4天），用新鲜的冰冻PBS溶液按照步骤1.3.1的方法清洗5次，随后将肺保存于4 °C的无菌密封容器内的PBS溶液中，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 大型器官生物反应器
<ol>
	<li>组装与组织安装
	<ol>
		<li>预先组装呼吸回路和血管回路结构，以及气管和血管插管适配器（图1）。除无菌包装的空气过滤器和注射端口外，所有生物反应器组件均需进行高压灭菌。</li>
		<li>在层流罩内按照图2所示示意图组装生物反应器组件。在使用前，立即用已在细胞培养孵箱中平衡至5% CO2环境的培养基填充主腔室。</li>
		<li>将气管和血管插管适配器连接至肺插管，并通过将肺组织浸入培养基中，并将插管适配器连接至改装盖上的相应接口，将器官安装至主生物反应器腔室。连接完成后，牢固密封盖子；在再细胞化期间，腔室将不再打开。</li>
		<li>用培养基填充气管储液罐至约一半高度，并安装改装后的盖帽。</li>
		<li>按图示在所有腔室上安装无菌0.22 µm注射式过滤器、鲁尔堵头和注射端口。</li>
		<li>通过呼吸回路装置将气管储液罐连接至主腔室。按图示连接呼吸回路管道。</li>
		<li>使用注射端口和装有18 G针头的60 ml注射器从管道中抽吸空气；调节三通阀的方向，使液体流向注射器。</li>
		<li>将已密封且连续连接的生物反应器腔室连同已安装的器官一起转移至组织培养孵箱，以平衡温度和气体环境。通过连接至主腔室的注射泵以约每2分钟一次完整&#34;呼吸&#34;的频率对肺进行通气，并通过蠕动泵以约10 ml/min的流速灌注血管系统，持续约30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>气道接种
	<ol>
		<li>制备所需细胞密度的细胞悬液用于气道接种（体积取决于器官大小）。</li>
		<li>通过连接在呼吸回路三通阀上的注射端口，轻柔注入细胞悬液使肺膨胀。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2条件下静置培养过夜，期间不进行气道通气或血管灌注，以使细胞附着于去细胞化肺基质。</li>
		<li>过夜孵育后，重新启动标准气道通气程序，并将器官继续培养3–7天（或按所需时间）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血管接种
	<ol>
		<li>参照气道细胞接种的方法，制备内皮细胞悬液。</li>
		<li>将细胞悬液转移至含有小型磁力搅拌子的内皮细胞接种储液罐中。</li>
		<li>旋转连接主腔室与内皮接种储液罐之间的管道中的三通阀，改变流路方向，并通过蠕动泵在轻柔搅拌下逐步接种内皮细胞。</li>
		<li>当接种完成（即&#160;内皮细胞接种储液罐中的细胞悬液已耗尽）时，停止灌注，静置孵育约4–6小时。随后以约10 ml/min的流速（或根据监测情况设定所需压力）重新启动主腔室培养基的血管灌注。</li>
		<li>持续进行血管灌注培养3–7天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 故障排除与替代方法
<ol>
	<li>气管插管：如果气管过小，可使用缝线代替扎带固定鲁尔套管。¼英寸&#160;雌性鲁尔接头可作为适用于多种气管直径的足够套管。</li>
	<li>通过肺动脉灌注去除血液由于组织来源于尸体动物，微血栓较为常见，导致肺毛细血管床的部分区域无法完全清除残留血液。然而在脱细胞过程中，这些小血管会变得通透，脱细胞试剂可有效裂解并降解这些血凝块。脱细胞前应进行灌注以尽可能清除血液，但无需完全去除实质组织中的所有血迹。</li>
	<li>肺部液体的排出：猕猴肺部保持较强的自然回缩力 离体即使充满液体时也保持通畅。然而，在脱细胞过程中，细胞被裂解并释放出物质（包括DNA），这些物质会增加灌注液体的黏度，从而使其更难排出。将肺组织浸没在灌注液中于4 °C孵育过夜，通常足以使肺完全排出黏稠液体。或者，尽可能让肺排出液体后，继续灌注后续溶液；加入去垢剂和去离子水冲洗通常有助于清除黏稠液体，使脱细胞过程高效进行。</li>
	<li>向洗涤剂溶液中添加抗生素：抗生素和抗真菌剂可添加至去离子水洗涤液以及洗涤剂溶液中；然而，青霉素/链霉素在存在脱氧胆酸钠时会发生沉淀，这些沉淀物可能干扰脱细胞及洗涤过程。此外，在脱细胞过程中无需添加抗生素/抗真菌剂，因为所用浓度的洗涤剂已足以裂解并杀灭微生物。脱细胞完成后，使用含5倍青霉素/链霉素/两性霉素B的PBS溶液进行冲洗和保存，足以防止大多数污染。</li>
	<li>去除生物反应器管路中的空气使用注射器将针头插入三通旋塞的针口，可有效抽吸生物反应器管路中的空气。或者，也可采用同样方式连接注射器，向管路中灌注1× PBS或培养基，以在安装器官前排出空气。</li>
	<li>脱细胞与再细胞化过程中及之后肺脏的通气与灌注尽管本报告中列出的流速和时间足以实现细胞黏附以及气道液体通气和血管灌注，但这些参数应由使用者通过实验确定。培养时间也可根据接种细胞的生长速率进行调整。</li>
</ol>

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<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Organ+Tissue+Engineering%3A+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. , (2010).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

可采用多种物理、化学和酶学方法高效且有效地对组织进行脱细胞处理12,20。利用大型器官制备三维生物基质所面临的挑战包括需要大量脱细胞溶液、昂贵的商用设备（例如生物反应器），以及为获得最终组织来源产物所需进行的大量方法学调整。我们的方法提供了一种简明的途径，可最大限度减少物理操作、试剂用量和成本。恒河猴肺组织的完全脱细胞和灭菌仅需三天；此外，我们的脱细胞组织可在4 °C下保存数周，无污染或支架降解迹象。我们近期报道了对脱细胞恒河猴肺支架的详细表征，结果发现Triton X-100/脱氧胆酸法（改良自Price 等4）可高效去除细胞，同时对肺基质的影响最小4,19。
我们自主研发的生物反应器由生物实验室中常见的部件组成。该生物反应器的耗材或可更换组件总估算成本为 &#60;500美元。尽管这种生物反应器是一种 &#34;基础模型&#34; 可配备多种组件以监测或改善其功能（例如压力、流量、温度和 pH 传感器）。根据我们对恒河猴肺支架再细胞化的经验，启动再细胞化时的理...

组织和器官的生物工程是再生医学领域的一个重要补充。组织和器官的构建 &#34;实验室培养的&#34; 获得可用于移植以替代病变器官功能的器官，对于满足当前和未来器官移植的需求具有重要意义。组织工程的基本原理是将特定类型的细胞或其前体细胞接种到支架上，该支架可维持所构建组织的形态，同时提供适当的生长因子和培养条件，以模拟发育或再生过程。尽管已使用合成支架进行组织工程研究，但天然细胞外基质（ECM）可能是实现器官特异性支架的最佳来源。全器官脱细胞是一种可在去除细胞的同时保留天然ECM化学成分和结构特征的技术。所得的无细胞基质支架可作为平台，用于接种并培养再生细胞。 体外1,2.
已开发出多种啮齿类动物肺部脱细胞及后续再细胞化的模型，以研究该技术的可行性3-6。尽管这些模型提供了关键的概念验证，但啮齿类动物模型并不能直接转化为满足人类临床需求的应用。最近一项研究指出，小鼠与人类在创伤性损伤（及相关炎症）中的基因组反应相关性较差；这些发现引发了对使用小鼠作为人类此类复杂生化过程模型有效性的质疑7。非人灵长类动物（NHP）模型的优势在于其在基因组、解剖和生理水平上与人类生物学高度相似，并且允许更灵活的操作，从而更有利于外推至人类应用。猕猴已被广泛用于多种临床前研究，是组织工程研究的优良模型8-11。我们近期报道了利用一种对肺ECM影响最小的方案成功实现猕猴（Macaca mulatta）肺脏脱细胞的过程12。&#160;肺脱细胞通过依次使用四种由去垢剂、盐类和酶组成的脱细胞溶液处理组织实现，期间交替使用去离子水（dH2O）和PBS进行清洗。我们通过改进Price et al.最初描述的方案，对该流程进行了优化4。采用多种组织学和蛋白质分析技术，对所得无细胞基质的组分相对于天然猕猴肺组织的组成进行了表征。
本报告中，我们展示了一种详细的非人灵长类动物肺脏脱细胞方法，以及利用大型器官生物反应器对所得无细胞肺支架进行再细胞化的操作流程，该技术最初由 Calle et al.13&#160;在 JoVE 中报道。&#160;通过修改原始方案以适应大型动物肺脏的尺寸、通气和灌注需求，该技术已成功从啮齿类动物模型过渡至恒河猴模型。本报告中所有研究均按照杜兰国家灵长类动物研究中心现行的机构生物安全委员会（IBC）政策进行。该技术的演示至关重要，因为在缺乏可视化操作步骤的情况下，识别解剖结构并对较大器官进行物理操作有时十分困难。这些方法所支持的研究为在脱细胞恒河猴肺中开展关键的临床前研究奠定了基础，可用于评估以恒河猴间充质谱系干细胞和恒河猴微血管内皮细胞进行再细胞化的效果。我们改进的生物反应器可模拟发育环境，在大型动物肺脏中施加机械牵拉和应变力，从而能够在已知有利于肺组织和内皮发育的条件下研究肺再细胞化过程13-15。

<table><tbody><tr><td>亚硝基铁氰化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71778-25G</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Fisher</td><td>BP2425</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Fisher</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>牛胰 DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td>制备母液，分装并冷冻保存</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Fisher</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Fisher</td><td>C614-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS（不含 Ca/Mg）</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">细胞培养基</td></tr><tr><td>α-MEM 培养基</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>12561-072</td><td></td></tr><tr><td>199 培养基</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11150067</td><td></td></tr><tr><td>优质胎牛血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 100x</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长补充剂（ECGS）</td><td>ScienCell</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">细胞接种与生物反应器培养</td></tr><tr><td>止回阀</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-98553-20</td><td></td></tr><tr><td>Y型连接器</td><td>Cole-Parmer</td><td>ED-30614-08</td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>Harvard Apparatus</td><td>721664</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex L/S 14 管路</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-14</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex L/S 16 管路</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-16</td><td></td></tr><tr><td>1/8 英寸雄性锁紧鲁尔接头</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-04</td><td></td></tr><tr><td>1/8 英寸雌性鲁尔接头</td><td>Cole-Parmer</td><td>SI-45502-04</td><td></td></tr><tr><td>雄性鲁尔锁紧堵头</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-56</td><td></td></tr><tr><td>注射端口</td><td>Medi-Dose EPS</td><td>IV2004</td><td></td></tr><tr><td>乳胶管</td><td>St. Louis Medical Suppy</td><td>HN10910</td><td></td></tr><tr><td>软管夹</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06832-02</td><td></td></tr><tr><td>2 L 广口瓶</td><td>Fisher</td><td>05-719-276</td><td></td></tr><tr><td>60 ml 注射器</td><td>Fisher</td><td>NC9035364</td><td></td></tr></tbody></table>

非人灵长类动物肺脏脱细胞与再细胞化：基于专用大型器官生物反应器的方法

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

可用于满足当前及未来器官移植需求的肺源数量严重不足。生物人工组织再生技术是传统器官移植的一种颇具吸引力的替代方案。该技术利用器官天然的生物细胞外基质（ECM）作为支架，将自体细胞或干细胞/前体细胞接种并培养于其上，从而促进原始组织的再生。天然ECM通过一种称为脱细胞化的过程获得。脱细胞化通过使用一系列去污剂、盐类和酶处理组织，有效去除细胞成分，同时保持ECM结构的完整。利用脱细胞化及后续再细胞化技术对啮齿类动物肺脏进行的研究表明，所生成的类似肺组织在气体交换功能方面仅实现了有限的成功。 体内尽管啮齿类动物模型提供了必要的概念验证，但其结果无法直接转化为人类应用。非人灵长类动物（NHP）是更适合用于研究生物人工器官制备以实现最终临床应用的模型。
本文介绍了从恒河猴（NHP）获取肺脏后实现完全脱细胞的实验方案。所得无细胞肺支架可接种多种细胞，包括间充质干细胞和内皮细胞。文稿还描述了一种生物反应器系统的构建方法，该系统可在负压通气产生的机械牵拉与应变以及血管内脉动灌注条件下培养接种细胞的恒河猴肺组织；这些力学刺激已知可分别促进细胞向肺系和内皮系分化。文中提供了脱细胞及细胞接种的代表性结果。

下图所示结果来自分别进行的实验，其中气道或血管腔室分别接种了食蟹猴骨髓来源的间充质干细胞或食蟹猴肺来源的微血管内皮细胞，这些细胞的分离与表征如前所述16-18。
在脱细胞过程中，猕猴肺组织逐渐变白，最终呈现半透明外观；然而，肺组织保持了其宏观解剖结构，仍具有较强的弹性，并能在液体充盈后产生自然回缩（图 3A 和 3B）。在显微水平上，脱细胞后肺组织的组织学超微结构保持完整，即通过低倍显微镜仍可清晰分辨细支气管、呼吸性细支气管、肺泡囊、血管及毛细血管（图 3C 和 3D）。然而，组织学微解剖结果显示，尽管脱细胞过程对肺的宏观结构和超微结构仅造成轻微干扰，但组织中已完全不存在完整的细胞（图 3E 和 3F）。
细胞经去污剂裂解后释放的基因组DNA通过DNase处理被降解，并在后续洗涤步骤中被有效去除。使用Qi...

全器官脱细胞技术可制备天然生物支架，用于再生医学。本文介绍了一种非人灵长类动物肺再生模型，其中完整肺脏在生物反应器中进行全器官脱细胞处理，随后接种成体干细胞和内皮细胞，该生物反应器可支持血管循环和液体培养基通气。

可用于满足当前及未来器官移植需求的肺脏数量严重不足。生物人工组织再生是一种……

本实验的总体目标是从恒河猴（Reus Maccas）肺脏中分离完整的器官生物基质，并将这些基质作为支架用于肺组织工程应用的研究。该目标通过以下步骤实现：首先使用去污剂、盐类和酶对恒河猴（Reus Maccas）的完整肺脏进行脱细胞处理；第二步是将脱细胞后的肺支架植入生物反应器中，该反应器能够同时对气道进行通气，并以液体细胞培养基灌注肺血管系统。接下来，通过气道将干细胞接种到肺支架上，同时通过肺血管系统接种内皮细胞。最后一步是在生物反应器提供的通气和灌注条件下，在肺支架内培养细胞至所需时间，随后分析所形成的细胞和组织形态。最终，利用干细胞和内皮细胞对无细胞猕猴肺支架进行再细胞化，可获得具有天然肺组织解剖和组织学特征的工程化肺组织。该方法有助于解答肺组织工程领域中的一些关键问题，例如干细胞或祖细胞是否能够单独或与成熟的肺上皮细胞和内皮细胞协同作用，用于再生肺组织。该技术的应用前景可延伸至终末期肺部疾病的治疗，因为利用患者来源的干细胞或祖细胞对去细胞肺基质进行再细胞化，有望增加可用于肺移植的供体肺数量。此外，利用患者自身干细胞构建的工程化肺组织可能具有抵抗免疫排斥的潜力。我们最初产生这一方法的想法，源于观看了耶鲁大学Laura Nicholson博士实验室成员此前在JoVE上发表的一段视频。本文介绍了对该实验室原有啮齿类动物实验步骤的改进，以满足我们大型动物Resus Meac模型的需求。在处理猕猴组织时，必须格外小心，以防止发生感染暴露事件。在处理非人灵长类动物组织之前，应穿戴个人防护装备，包括外科口罩、面罩、一层外科手套、一次性防护服，以及外层的第二层外科手套。将肺置于解剖盘中并保持平放，使用带有合适尺寸倒刺的雌性接头连接肺动脉。用经酒精消毒的塑料扎带将套管固定到位，并在气管周围套上一根塑料扎带。将雌性诱捕连接器插入气管开口，并用扎带紧固在连接器的凸缘周围，以使气管固定在凸缘上。通过灌注含有每毫升30单位肝素和每毫升5微克硝普钠（sodium nitroprusside，简称SNP）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）来清除肺部滞留的空气，然后利用肺的自然回缩力将溶液排出，之后重复该操作。在第三次气道安装 PBS 肝素 SNP 溶液后，再进行两次灌注。用堵头封闭气管插管。剪开心尖，用 PBS 肝素 SNP 冲洗心室内腔以去除残留血液，并切开两个心房，以便灌注时促进肺循环系统的引流。将装有 PBS 肝素 SNP 溶液的 60 cc 注射器连接至肺动脉插管，小心拔出活塞，使液体流入血管系统。移除气管插管的堵塞物，利用气道的自然回缩力将气道内的液体排出。持续灌注，直至尽可能清除肺血管系统中的血液。该操作中最困难的部分是有效地用液体冲洗和清洗肺部气道。由于气道原本并非用于输送液体，因此与气体相比，液体流动会受到限制，完成这些步骤需要耗费时间和耐心。我们建议继续执行方案，即使气道中仍有少量残留液体；随着脱细胞过程的推进以及细胞碎片被冲洗出来，液体黏度将保持较低水平，肺组织将能够高效地排出液体。第一天，将心肺组织块浸入去离子水中，使用连接在浸没状态下的气管和动脉套管上的60 mL注射器，对肺部进行充气并灌注去离子水。重复进行气道和血管的去离子水冲洗步骤。再重复四次，总共进行五次洗涤，每次洗涤使用约0.5至1升水。五次洗涤后，将肺脏从水中取出，并将组织块浸入Triton溶液中。用Triton溶液充气并灌注肺脏。同前，再次重复灌注操作一次，并将浸没的器官在4摄氏度下于Triton溶液中过夜孵育。经过过夜孵育后，将肺组织块从曲拉通溶液中取出，并用去离子水进行外部清洗。然后将组织块浸入新鲜的去离子水中。向气管和肺动脉内注入去离子水，重复冲洗五次，以彻底清除曲拉通溶液及细胞碎片。将肺组织从去离子水中取出，浸入2%脱氧胆酸钠（Sodium deoxycholate，SDC）溶液中。以相同方式用SDC溶液进行充气和灌注。在第三天，将肺组织置于SDC溶液中，于4°C条件下孵育过夜。用去离子水对外部组织以及气道和血管系统再冲洗五次。同前，将组织从去离子水中取出，浸入1摩尔氯化钠溶液中。同前，用氯化钠溶液进行膨胀和灌注，并在用五次去离子水冲洗肺部以清除氯化钠溶液后，将组织浸入氯化钠溶液中，在室温下孵育1小时。同前，将肺组织浸入新鲜的DNA溶液中，并将该溶液注入气道和血管系统。在室温下用DNA溶液孵育肺组织1小时。随后将肺组织从DNA溶液中取出，并用PBS溶液进行外部清洗。将肺组织浸入 PBS 溶液中，并通过气道和血管系统用该溶液冲洗五次。与之前相同，在第四天将肺组织置于密封容器中的 PBS 溶液内，于 4°C 下过夜保存。用新鲜的预冷 PBS 溶液通过气道和血管系统冲洗肺组织五次。然后将它们置于无菌密封容器中的 PBS 溶液内，于 4 摄氏度保存，直至使用。在层流罩内根据示意图组装生物反应器组件。在文字版实验方案中，使用前立即用已在细胞培养孵箱的 5% CO2 环境中平衡过的培养基填充主腔室，将气管和血管插管适配器连接至肺插管。通过将肺脏浸入培养基中，并将套管适配器连接至改装盖子上的相应接口，将器官安装至主生物反应器腔室。连接完成后，牢固且紧密地固定盖子。在反应持续期间，腔室将不再打开；使用注射器接口和装有18号针头的60 mL注射器，调节三通旋塞阀的流向，将管路中的空气抽出，使液体流入注射器。将已安装器官且密封连续连接的生物反应器腔室转移至组织培养孵育箱中，以平衡温度和气体环境。通过连接至主腔室的注射泵对肺进行通气，大约每两分钟完成一次完整呼吸，同时通过蠕动泵以约10毫升/分钟的速度灌注血管系统，总时长30分钟，以实现气道定位。通过呼吸回路中三通旋塞阀连接的注射端口，缓慢注入细胞悬液，使肺膨胀。将肺脏在37摄氏度、5% CO2条件下静态保持过夜，不进行气道或血管灌注，以允许细胞附着于去细胞化肺基质。过夜孵育后，重新启动标准气道通气程序，并对器官进行3至7天的培养以实现血管定植。通过旋转连接这两个腔室的管路中止流阀上的阀门，可将流动路径的方向从主腔室改变至内皮定植储液器；在接种内皮细胞时，使用蠕动泵逐步接种，同时利用磁力搅拌器轻轻搅拌；接种完成后停止搅拌。停泵灌注并静置孵育约4至6小时。以主腔室培养基重新启动血管灌注，流速约为10毫升/分钟。在持续血管灌注的同时，与气道通气培养期同步，共同培养3至7天。在脱细胞过程中，MCCA 肺逐渐变白，最终呈现半透明外观。然而，肺组织保持了其宏观解剖结构，仍具有较大的弹性，并能在液体充盈后产生自然回缩。在显微水平下。脱细胞后，组织的组织学超微结构仍保持完整，即支气管、呼吸性细支气管、肺泡囊以及血管和毛细血管在低倍显微镜下仍可清晰分辨。然而，组织学微细解剖结果显示，尽管脱细胞过程对肺的大体解剖结构和超微结构仅造成轻微影响，但组织中已完全缺乏完整的细胞，如图所示。脱细胞组织中仅残留微量DNA。此外，通过酒精沉淀浓缩并显示在0.8%琼脂糖凝胶中的微量DNA主要由低分子量的降解片段组成。通过蛋白质印迹法分析天然肺组织和脱细胞肺组织中的蛋白质，评估细胞蛋白的去除效率。使用β-肌动蛋白抗体检测裂解液时，β-肌动蛋白在天然肺组织裂解液中可被明显检测到，而在脱细胞肺组织裂解液中则无法检测到，这表明在气道接种恒河猴骨髓来源的间充质干细胞（BMCs）并进行生物反应器培养约14天后，每两分钟经历一次吸气-呼气循环，细胞已被显著清除，且与细胞相关的蛋白质材料基本被去除。恒河猴脱细胞肺组织的实质部分已被有效脱细胞化。BMC排列在肺泡隔上，同时保持肺泡腔清晰开放。利用生物反应器，BMC也定植于大气道的去细胞基质上；培养14天后，主支气管的管腔表面被一层类似扁平的BMC单层覆盖。此处所示的生物反应器中，是一个去细胞化的兔肺叶，在向血管系统接种微血管内皮细胞并以每分钟5毫升的流速持续灌注内皮细胞培养基五天后的情况。组织学分析显示，肺实质中小血管壁内衬有细胞。在某些情况下，细胞似乎通过跨越管腔的多个细胞突起附着于基质；而在其他血管横切面中，可见细胞沿内皮表面排列，管腔清晰。按照本操作步骤进行。还可以采用其他方法，如免疫组织化学、蛋白质印迹（Western blot）和定量实时 PCR，以回答进一步的问题，例如：接种的干细胞在脱细胞肺基质上或在生物反应器内与成熟的上皮细胞和内皮细胞共同培养后，是否分化为肺谱系细胞。观看本视频后，我们应能够充分掌握如何对非人灵长类动物的肺组织进行脱细胞处理，并将所得的脱细胞肺用作支架，在生物反应器系统中培养干细胞、上皮细胞和内皮细胞。请务必注意，操作非人灵长类动物组织可能具有极高危险性，因此在执行该操作时，必须采取充分的预防措施，例如穿戴完整的个人防护装备，包括面罩以及双层乳胶或丁腈手套。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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非人灵长类动物肺脏脱细胞与再细胞化：基于专用大型器官生物反应器的方法

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