Cell的传播分析单细胞显微注射
February 26th, 2017
在这里，我们将介绍如何执行路西法黄色的单细胞显微注射可视化在活细胞通过缝隙连接处蜂窝通信，并提供一些有用的提示。我们希望本文可以帮助大家来评估细胞耦合程度由于功能间隙连接。这里所描述的一切可能的，在原则上，适合于与低于1,000道尔顿分子量其它荧光染料。
嗨，我是 Anael。我在 Oswaldo Cruz 基金会的蜂窝通信实验室工作。我们在这里研究免疫系统和肝脏背景下的 P2 受体和间隙注射。
今天，我将向您介绍细胞的显微注射。间隙注射起着一些生理作用，如突触传递、心脏收缩等。对于这种技术，我们可以研究间隙注射是否有效。
好的，让我们看看显微注射装置的基本组件。在这里，我们有倒置荧光显微镜，我们将在其中看到细胞。这是一台用于记录结果的 CCD 相机。
我们这里有电流发生器，我们将染料引入电池。接下来，我们有连接微电极的支架。以及连接到支架的微纵器，允许微电极在 Z、Y 和 X 三个轴上移动。
我们使用这种硼硅酸盐玻璃毛细管和这种名为 polar 的设备。我们在此处连接硼硅酸盐毛细管。我们将这种钨丝加热以制作两个微电极。
现在钨丝的加热和这里的波，我们将向下拉以制作两个微电极。容易。我们的第一步是将染料填充到微电极中。这里的一个提示是，您只需在尖端中填充几微升即可进行实验。
没有必要填满所有内容。注意更多细节。仅填充小费。
让我们开始一个实验。我们这里有培养皿中的细胞，在钠溶液中。连接到电流发生器的银线。
我们现在必须在头部阶段连接微电极。在头部阶段，我们有另一根银线也连接到电流发生器。一旦连接了微电极，我们就可以将其放入浴槽中。
请注意，移液器的尖端小心地接触浴槽。此过程要非常小心，以避免尖端在培养皿底部碰撞。进入浴槽后，我们可以去显微镜前寻找微量移液器的阴影。
我们建议我们开始查看放大镜。当我们找到移液器的阴影时，我们可以使用显微作器将微电极移向电池。一旦它非常靠近电池，我们就可以做一个测试柱来验证微电极是否没有被阻塞。
我们接下来将如何看待。在这里，我们看到了微量移液器，我们正在非常靠近细胞的地方调整微量移液器。我们可以看到细胞左右移动。
然后我们换成滤光片，荧光滤光片。我们可以应用超极化脉冲来测试移液器的尖端是否没有阻塞。由于微量移液器位于细胞内部，我们可以应用超极化脉冲将染料加载到细胞中。
我们在这里使用松散的游离黄色染料。用染料加载细胞后，如果相邻细胞通过间隙注射连接，我们等待几分钟，我们将看到相邻细胞因这些间隙注射的染料扩散而变亮。在我们的实验中，我们可以看到五个细胞，标有星星，显示荧光。
这里有一个很好的胸腺上皮细胞显微注射实验的例子，在 A 中，B.In 图 C 和 D 中，显示了胸腺惰性细胞中松散游离黄色的显微注射和另一种染料，不能渗透间隙注射，显示在插入物中。图 E 和 F 胸腺上皮细胞系显微注射松散游离黄色，并在插入物中松散游离黄色和间隙注射块。结果表明，松散的游离黄色没有扩散到相邻的细胞。
接下来，我们看到在地塞米松存在下胸腺上皮细胞中进行显微注射，并且 B.Dexamethasone 的定量增加了偶联程度，如图 B.所示，在 100 次注射中，在这种药物存在下，连接的三个或四个细胞的数量更为频繁。我希望我可以帮助初学者进行这项重要的细胞通讯研究技术。谢谢，再见。
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概览
本文介绍了通过单细胞微注射荧光染料黄色荧光素来可视化活细胞中通过间隙连接进行细胞通讯的技术。它为研究人员提供了评估功能性间隙连接导致的细胞耦合的实用技巧。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞通讯
- 神经科学
- 免疫学
背景
- 间隙连接在生理过程中起着关键作用。
- 它们参与突触传递和心脏收缩。
- 理解它们的功能对于各种生物学研究至关重要。
- 黄色荧光素是一种用于可视化的荧光染料。
研究目的
- 展示用于研究间隙连接的微注射技术。
- 评估活细胞中的细胞耦合程度。
- 提供对间隙连接功能的见解。
使用的方法
- 单细胞微注射黄色荧光素。
- 可视化细胞通讯。
- 评估功能性间隙连接。
- 适应该技术用于其他荧光染料。
主要结果
- 成功可视化通过间隙连接的细胞通讯。
- 展示细胞耦合的评估。
- 该技术适用于分子量在1,000道尔顿以下的各种荧光染料。
- 提供了对间隙连接的生理作用的见解。
结论
- 微注射技术对于研究间隙连接是有效的。
- 黄色荧光素是可视化的有用工具。
- 研究结果有助于理解活体系统中的细胞通讯。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single-cell microinjection enables direct assessment of gap junction functionality, a key mechanism in cellular communication relevant to drug target validation in neuroscience, immunology, and tissue engineering. By visualizing real-time dye diffusion, researchers can evaluate compound effects on intercellular coupling, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides quantitative, functional readouts that improve target confidence and inform go/no-go decisions in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether a target modulates gap junction-mediated communication.
- Operational Value: Enables functional validation of connexin or hemichannel targets in live cells.
- Predictive Value: Supports pathway clarification and biological de-risking through direct observation of dye transfer.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated cellular systems for compound screening by establishing baseline coupling.
- Quantitative Output: Measures diffusion kinetics as a functional readout for assay standardization.
- Scalability: Adaptable to high-content imaging platforms for multi-condition comparison.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models physiological processes like synaptic transmission and heart contraction where gap junctions are implicated.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to preclinical models by confirming functional coupling in relevant cell types.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement based on evidence of target engagement in cellular networks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to assess target effects on cellular communication before progressing to phenotypic screening or lead optimization.
- Discovery Biology: Tests hypothesis that a compound or genetic modulator alters intercellular signaling via gap junctions.
- Screening: Generates reproducible, quantitative fluorescence data to compare treatment conditions.
- Analytics: Provides measurable diffusion metrics that enable statistical comparison of coupling efficiency.
- Translational Research: Uses epithelial and immune-relevant cell lines to model tissue-level communication.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating connexin-targeting compounds across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by confirming functional target modulation in a native cellular context.
- Operational Value: Standardizes microinjection and imaging protocols for reproducible results across labs.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by identifying ineffective modulators of cellular coupling early.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of compounds demonstrating gap junction modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, fluorescence microscopy, and dye handling.
- Depends on micromanipulator stability, electrode preparation, and intracellular injection precision.
- Necessitates standardized cell preparation and bath conditions to ensure consistent results.
- Must account for cell type variability in connexin expression and baseline coupling.
- Limited to dyes under ~1,000 Da that can pass through gap junctions, as larger molecules remain cell-autonomous.
