使用普洛林来评估阿克森指导受体在细胞培养和小鸡胚胎中的动力学

该程序的总体目标是使用 pH 敏感的 GFP 变体来研究细胞表面轴突引导受体运输的时空动力学。这是通过首先使用适当的克隆策略用 Florin 序列标记目标受体来实现的。该程序的第二步是表征体外转染的 Florin 标记受体的 pH 敏感性。

第三步是在 OVO 中电穿孔 Florin 标记的受体构建体，以实现在脊髓中的表达。最后一步是在所需阶段切出电穿孔胚胎。最终，结果可以通过免疫荧光显微镜检查在空间和时间域中显示细胞表面受体运输的变化。

与现有方法（例如使用 GFP 技术蛋白质构建体）相比，该技术的优势在于 pH 三翼受体的 pH 敏感性允许在体外和体内检测细胞表面受体动力学的时空变化。这种方法可以帮助回答 Axon 引导领域的关键问题。事实上，它可以帮助表征轴突导向受体细胞表面分布的时空调控，并且我们知道失调对于设置大锥体对特定队列的敏感性至关重要。

这种方法可以提供对颊胚胎模型中轴突导向领域的见解，但它也可以应用于其他系统，例如小鼠脑切片。维持培养与生命成像相结合 已在 DMEM 中以 70% 至 80% 的 co fluency 制备了 7 个细胞，并将目标基因克隆到 florin 载体中。首先将 3 μg DNA 添加到 200 μL 150 毫摩尔氯化钠中。

轻轻涡旋混合物，然后短暂旋转。然后加入适量的转染试剂，在本例中为 10 μL 并涡旋。立即让混合物静置 10 分钟。

添加室温。接下来，向细胞中加入 200 微升完整的混合物。轻轻旋转板，然后将其放回 37 摄氏度的培养箱中 48 小时，并按照文本方案中的说明更换培养基。

两天后，准备显微镜室。现在将细胞转移到腔室中。将 5 毫升注射器连接到它，以便可以直接添加组件，同时将腔室保持在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳。

在使用显微镜之前，请确保它已平衡，以避免在记录过程中出现机械漂移。接下来，打开成像软件并选择多维采集程序，找到转染成本的 7 个细胞，用 40 x 物镜标记它们在软件中的每个位置，将 Z 堆栈配置为 15 微米采集深度。请注意，向成像室添加介质时，焦点可能会发生变化。

设置适当的相位、GFP 滤光片的曝光和适当的采集时间，以便在 10 分钟内每 20 秒采集一次图像，这应该就足够了。开始采集并在 DMEM pH 7.4 培养基中拍摄 5 张对照图像。然后暂停购置。

注入 1.25 毫升 pH 3.5，完全 DMEM，使培养基中的 pH 值为 5.5。在软件中标记事件并继续采集图像 5 个时间点。在此期间，绿色荧光应逐渐消失。

然后暂停购置。注入 1.2 毫升 pH 9.5，完全 DMEM，在培养基中达到 pH 7.4。在软件中标记此事件并获取另外五个时间点。

现在，绿色荧光应该再次出现在质膜上。文本方案中提供了有关在电穿孔和其他制备之前处理鸡蛋的详细信息。本节从在 egg 中创建窗口开始。

用胶带覆盖鸡蛋的顶部，那里将要制作窗户。然后用弯曲的剪刀刺穿外壳的大钝面。使用连接到 5 毫升注射器的针头取出 2 毫升白蛋白。

将针头垂直定向，以避免损坏鸡蛋顶部的 ylk 袋。使用相同的过程再打一个孔。然后从第二个孔中，切出一个足够大的窗口，以便看到胚胎并能够对其进行处理。

在大约 2 毫升无菌、温热、改性 PBS 中，这可以防止脱水并增加可及性。现在注射 DNA 并注射胚胎。首先，将 PBS 中的质粒稀释至每微升 0.5 至 2 微克之间，但不能更高。

然后加入固绿染料至终浓度为 0.025%将 DNA 混合物加载到毛细管中，以使用注射器注射 DNA。如果毛细血管的阻力太大，则可能难以注射胚胎。如果阻力太小，毛细血管大小可能会损坏带有负载毛细血管穿刺的胚胎、卵黄袋和幼体侧的神经管，以浅角度插入神经管，并用 DNA 混合物填充从尾部到头部的管腔。

接下来，快速将 4 毫米铂电极放在神经管的两侧，并以每半秒 50 毫秒、31 伏特脉冲进行电穿孔。电极上应形成气泡。避开心脏或大型胚胎外血管。

电穿孔完成后，用针头去除 2 毫升白蛋白。然后用胶带密封窗户和钝面。将鸡蛋放回 38.5 摄氏度，直到它们发育到所需的阶段。

然后按照文本方案中给出的包埋和冷冻切片程序，使用 Florin 提供了质膜上跨膜受体分选的精确时空分辨率。对于演示 plex，一个中标有 Florin。它是一种引导受体，介导 se Forin 3 B 的信号，该构建体在体外表达。

在 CO 中，7 个细胞和活细胞成像在生理 pH 值下进行。受体主要位于质膜上，从而证实仅检测到受体的细胞表面池。经过 innovo 电穿孔，发现 a 中的 plex 分布在底板交叉时生长锥的表面。

在前交叉阶段，在细胞表面未检测到 plex 中的 plex。这表明 SEMA 4 和 3 B 轴突信号转导仅限于交叉后阶段。在尝试此程序时，应注意 pH 流感的使用主要适用于监测生命准备。

在固定组织中使用 pH 流感需要在固定期间和之后特别小心。由于 pH 流感的确认可能只是暂时的，因此所有溶液的 pH 值必须保持在 7 以上，并且应在固定后不久进行观察。该方法为轴突导向和细胞迁移领域的研究人员铺平了道路，以探索不同动物模型中导向受体的细胞表面分布的调节，例如芥子蝇对抗果蝇和小鼠。