生成淋巴结-脂肪垫嵌合体以研究淋巴结基质细胞来源

本实验的总体目标是构建淋巴结脂肪垫嵌合体，以评估脂肪组织对淋巴结基质形成的贡献。首先从新生小鼠中分离淋巴结，并从第18.5天的小鼠胚胎中分离脂肪垫，随后将胚胎脂肪垫中的淋巴结移除，并替换为新生小鼠的淋巴结。

通过将一个新生淋巴结与一个胚胎脂肪垫在体外重新结合并进行培养，构建淋巴结脂肪垫嵌合体。随后将该嵌合体移植至宿主小鼠的肾包膜下。移植后三周，取出肾脏并回收嵌合体。

最终，可通过流式细胞术和免疫荧光显微分析来评估脂肪垫来源的细胞对淋巴结基质的贡献。当我们寻找方法以评估脂肪垫中的细胞是否参与淋巴结形成时，首次提出了该方法。为分离新生小鼠腹股沟淋巴结，先剪去头部，然后使用剪刀从胸部顶端至腹部底端沿中线切开动物体壁。

仔细移除腹腔内所有内脏后，将尸体放入含有 RF 10 培养基的 90 毫米培养皿中。将培养皿置于无菌组织培养罩内，然后将尸体转移至另一个含有新鲜 RF 10 培养基的无菌 90 毫米培养皿中。随后，在腹股沟区域小心地将腹膜从皮肤上分离，并在脂肪垫中三条血管交汇处找到腹股沟淋巴结。

小心地取出淋巴结，确保去除所有脂肪组织。然后将淋巴结放入含有冰上预冷的RF 10培养基的50毫米培养皿中，以分离第18.5天胚胎的腹股沟脂肪垫。按照上述方法去除内脏后，用无菌PBS清洗尸体，以彻底清除所有血迹。

将清理后的组织转移至一个新的90毫米培养皿中，然后剥离腹膜，定位腹股沟淋巴结，并按前述方法将其取出。弃去分离的组织。注意彻底移除整个淋巴结，以避免脂肪垫嵌合物受到污染。

然后取出腹股沟脂肪垫，将其放入含有冰上预冷的RF 10培养基的50毫米培养皿中。为建立体外器官培养系统，首先将Vulcan包裹材料剪成1至1.5平方厘米大小的片状。随后将海绵在蒸馏水中煮沸2小时，滤膜煮沸20分钟，并在细胞培养操作台中干燥数小时。

材料干燥后，将一块海绵放入含有两毫升培养基的50毫米培养皿中。将每块海绵浸入培养基以润湿其两面，然后在每个体外器官培养系统中，于液-气交界面处放置一个滤膜。接着，小心地将一个胚胎脂肪垫与一个新生淋巴结直接重新联合至每个滤膜的顶部。

将培养皿放入底部盛有水、盖子上有孔的长方形塑料盒中。用胶带将盒盖固定在盒子上，但保持孔洞敞开。然后将盒子置于37摄氏度、5% CO2的细胞培养孵箱中。

将盒子静置平衡两小时，然后用胶带密封盖子上的孔。将组织孵育至少两天，以使淋巴结在移植后三至四周前附着于脂肪垫，随后将其转移至肾包膜下。分别从每个肾脏中分离出各自的淋巴结-脂肪垫嵌合体，并解剖出淋巴结。

然后，对每个淋巴结，使用小型剪刀在组织上做单一切口，以促进酶消化。接着，将每个淋巴结分别放入含有600 µL消化缓冲液的1.5 mL离心管中。将离心管置于振荡式恒温金属浴中，在37°C下孵育30分钟，每隔10分钟用移液器吹打混匀一次，以帮助组织解离。

然后向各管中加入 6 µL EDTA，并反复吹打细胞悬液数次以完成解离。随后可用感兴趣的特异性抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术分析以检测增强型黄色荧光蛋白（EYFP）的表达。将淋巴结固定 3 至 4 小时。

然后，对于每个淋巴结，在一小片铝箔上滴加一滴低温OCT包埋剂。小心地将一个淋巴结放入每滴包埋剂的中央，避免产生气泡，随后将铝箔置于干冰上以冻结组织。之后可对淋巴结进行切片、染色，并通过荧光显微镜进行观察与分析。

精细分离淋巴结可进一步分析EYFP阳性脂肪来源细胞的后代。通过对淋巴结进行冷冻切片及免疫荧光分析发现，EYFP阳性脂肪来源细胞迁移至淋巴结内，并参与构成GP38阳性、ERTR7阳性的淋巴结基质细胞网络。流式细胞分析证实，淋巴结基质细胞中有相当一部分来源于局部EYFP阳性脂肪组织前体细胞，其中30%的CD45阴性、GP38阳性、CD31阴性成纤维细胞样细胞群，以及10%的CD45阴性、GP38阴性、CD31阳性血管内皮细胞群均源自脂肪组织。在某些条件下，高达80%的CD45阴性、GP38阳性、CD31阴性成纤维细胞样细胞群可由脂肪组织前体细胞衍生而来，充分证明脂肪组织在维持淋巴结基质生长中发挥的关键作用。掌握该技术后，研究人员可在淋巴器官发生领域进一步探索不同分子在淋巴结基质发育中的功能角色。