淋巴结脂肪垫对嵌合体的淋巴结基质细胞起源研究的一代
December 16th, 2013
描述了用于研究淋巴结基质细胞起源的淋巴结/脂肪垫嵌合体的产生。该方法涉及从新生小鼠和胚胎脂肪垫中分离淋巴结，产生嵌合淋巴结脂肪垫，以及将它们转移到宿主小鼠的肾包膜下。
该程序的总体目标是生成淋巴结脂肪垫嵌合体，以评估脂肪组织对淋巴结基质形成的贡献。首先通过从新生小鼠中分离淋巴结和从第 18.5 天小鼠胚胎中分离脂肪垫来实现。淋巴结从胚胎脂肪垫中取出，并被新生淋巴结取代。
淋巴结脂肪垫嵌合体是通过在体外将一个新生儿淋巴结与一个胚胎脂肪垫重新结合然后培养来组装的。然后将嵌合体嫁接到宿主小鼠的肾包膜下。移植后 3 周，收获肾脏并取出嵌合体。
最终，脂肪垫衍生细胞对淋巴结基质的贡献可以通过流式细胞术和免疫荧光显微镜分析来评估。因此，当我们在寻找一种方法来评估脂肪垫中的细胞是否有助于淋巴结的形成以分离新生儿腹股沟淋巴结时，我们首先有了这种方法的想法。切开头部后，用一把剪刀从胸部区域的顶部打开动物的身体到腹部的底部。
小心地从腹腔中取出所有内脏后，将身体放入含有 RF 10 培养基的 90 毫米培养皿中。将培养皿放入无菌组织培养罩中，然后将身体转移到含有新鲜 RF 10 的新无菌 90 毫米培养皿中。然后小心地将腹膜从腹股沟区域的皮肤上分离出来，找到位于脂肪垫中三条血管交汇处的腹股沟淋巴结。
小心地切除淋巴结，确保去除所有脂肪组织。然后将淋巴结放入含有冰上 RF 10 培养基的 50 毫米培养皿中，以将腹股沟脂肪垫与第 18.5 天的胚胎隔离开来。如刚才所示去除内脏后，用无菌 PBS 清洗尸体以消除所有血迹。
将清洁过的身体转移到新的 90 毫米培养皿中，然后分离腹膜，定位腹股沟淋巴结并按照刚刚演示的方式将其取出。丢弃分离的组织。小心去除整个淋巴结，以避免污染脂肪垫嵌合体。
然后取出腹股沟脂肪垫，将其放入含有冰上 RF 10 培养基的 50 毫米培养皿中。要建立体外器官培养系统，首先将一些 Vulcan 包装成 1 到 1.5 平方厘米的块。然后将海绵在蒸馏水中煮沸 2 小时，将过滤器煮 20 分钟，并在细胞培养罩中晾干数小时。
材料干燥后，将一块海绵放入含有 2 毫升培养基的 50 毫米培养皿中。将每个海绵浸入培养基中以润湿两侧，然后在液态空气界面处为每个体外器官培养系统放置一个过滤器。接下来，小心地将一个胚胎脂肪垫与一个新生淋巴结直接重新关联到每个过滤器的顶部。
将培养皿转移到一个矩形塑料盒中，底部有水，盖子上有孔。将盖子粘在盒子上，让孔保持开放。然后将盒子放入 37 摄氏度的 5%CO2 细胞培养箱中。
让盒子平衡 2 小时，然后用胶带密封盖子上的孔。移植后 3 至 4 周，将组织孵育至少两天，让淋巴结附着在脂肪垫上，然后再转移到肾包膜下。分离每个肾脏内的每个淋巴结脂肪垫嵌合体，并解剖出淋巴结。
然后对于每个淋巴结，用一把小剪刀在组织中做一个切口，以帮助酶消化。接下来，将一个淋巴结分别放入含有 600 微升消化缓冲液的 1.5 毫升 einor 管中。将试管在 37 摄氏度下在搅拌热模块上孵育 30 分钟，每 10 分钟上下吹打一次，以帮助解离组织。
然后向试管中加入 6 μL EDTA，并将细胞悬液研磨几次以完成解离。然后可以用所需的目标抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析，以保留增强的黄色荧光蛋白或 EYFP 表达。固定淋巴结 3 到 4 小时。
然后对于每个淋巴结，将一滴冷的 OCT 化合物滴在一小块铝箔上。避免气泡，小心地将一个淋巴结放入每滴的中间，然后将铝箔放在干冰上以冷冻组织。然后可以通过荧光显微镜对淋巴结进行切片、染色和分析。
P 仔细分离淋巴结可以进一步分析 EYFP 阳性脂肪来源细胞的后代。淋巴结的冷冻切片和免疫荧光分析显示，EYFP 阳性脂肪来源的细胞迁移到淋巴结中，在那里它们有助于 GP 38 阳性 E RTR 7 阳性淋巴结基质细胞网络流式细胞术分析证实，淋巴结基质细胞的重要部分来源于局部 EYFP 阳性脂肪组织祖细胞，占 CD 45 阴性 G 38 阳性 CD 31 阴性成纤维细胞的 30%分数，以及 10% 的 CD 45 阴性 GP 38 阴性 CD 31 阳性血液内皮细胞分数高达 80% 的 CD 45，阴性 G 38 阳性 CD 31 阴性成纤维细胞分数可以来自脂肪组织前体细胞，证明脂肪组织在维持淋巴结基质生长中起关键作用。所以曾经与淋巴器官发生的研究人员一起掌握了这项技术，以探索参与淋巴创伤的不同分子的作用。
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概述
本文描述了产生淋巴结/脂肪垫嵌合体以研究淋巴结间质细胞的起源。该方法包括从新生小鼠和胚胎脂肪垫中分离淋巴结，创建淋巴结-脂肪垫嵌合体，并将它们移植到宿主小鼠肾脏包膜下。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 淋巴结在免疫系统中起着关键作用。
- 间质细胞对淋巴结的结构和功能至关重要。
- 了解脂肪组织对淋巴结发育的贡献很重要。
- 嵌合模型可以提供有关细胞起源和相互作用的见解。
研究目的
- 评估脂肪组织对淋巴结间质形成的贡献。
- 创建一个允许研究淋巴结发育的模型。
- 调查淋巴结与周围组织之间的相互作用。
使用的方法
- 从新生小鼠中分离淋巴结。
- 从第18.5天的小鼠胚胎中分离胚胎脂肪垫。
- 在脂肪垫中替换淋巴结以创建嵌合体。
- 将嵌合体移植到宿主小鼠的肾脏包膜下。
主要结果
- 成功产生淋巴结-脂肪垫嵌合体。
- 嵌合体展示了淋巴结和脂肪垫的整合。
- 研究间质细胞起源和相互作用的潜力。
- 了解脂肪组织在淋巴结发育中的作用。
结论
- 该方法为研究淋巴结生物学提供了一种新颖的方法。
- 嵌合模型可以增强对免疫系统发育的理解。
- 进一步的研究可以探索对免疫反应的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding the cellular origin and lineage of lymph node stromal cells is critical for de-risking early immunology target validation and clarifying mechanisms underlying lymphoid organogenesis. The lymph node-fat pad chimera model enables precise lineage tracing of stromal precursors, supporting predictive confidence in stromal cell biology and facilitating risk-adjusted decisions in immunology-focused discovery portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of stromal cell lineage and differentiation pathways.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying adipose-derived contributions to lymph node stroma.
- Facilitates functional target validation for stromal cell-related immune modulation.
Screening & Assay Development
- Provides a validated system for quantitative flow cytometric and immunofluorescence analysis of stromal cell populations.
- Enables reproducible preparation of chimeric tissues for downstream phenotypic screening.
- Supports assay standardization by allowing controlled manipulation of precursor cell sources.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by recapitulating stromal cell development in vivo.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of stromal cell function.
- Supports translational biomarker identification through lineage tracing and phenotypic analysis.
Pipeline & Workflow Integration
This chimera model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven lineage tracing, quantitative stromal cell analysis, and mechanistic de-risking of immune targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stromal cell origin and differentiation mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for stromal cell population analysis.
- Analytics: Enables flow cytometric and immunofluorescence readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Facilitates preclinical continuity by modeling in vivo stromal cell integration.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating genetic or pharmacological perturbations in stromal cell development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stromal cell lineage and function.
- Operational Value: Standardizes lineage tracing and stromal cell quantification workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for immunology targets by reducing mechanistic ambiguity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stromal cell-related programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse surgery, tissue isolation, and organ culture techniques.
- Demands access to flow cytometry and immunofluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible chimera assembly and analysis.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization for tissue compatibility.
- Dependent on availability of genetically labeled precursor cells for lineage tracing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:28
Isolation of Newborn Inguinal Lymph Nodes (LN)
2:38
Isolation of E18.5 Fat Pads
3:28
Generation of the LN-fat Pad Chimera
5:14
Isolation and Enzymatic Digestion of the Transferred LN for Flow Cytometric Analysis
6:31
Analysis of the Transferred LNs by Immunofluorescence
7:16
Results: Typical Experimental Results Obtained Using the LN/fat Pad Chimera Method
8:44
Conclusion
