Name: 鼠淋巴结基质细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 学习使用胶原酶消化与机械解离相结合的方法分离小鼠淋巴结基质细胞，并通过流式细胞术表征细胞表面分子表达。该技术能有效保持细胞活力与表面标志物完整性，为免疫学研究提供标准化方案。

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作者感谢Sanjiv Luther及其同事在建立当前淋巴结消化方案过程中提供的有益讨论。本研究由瑞士国家科学基金会（SNF）授予S.W.R.的项目PPOOA-_119204和PPOOP3_144918资助。

在本视频出版物和方案中，所有动物实验操作均依照瑞士巴塞尔城市州州级主管部门批准的动物实验方案进行。
1. 淋巴结的制备与消化
<ol>
	<li>将烧杯中的水置于磁力搅拌器加热板上预热至 37 °C。</li>
	<li>配制基础培养基：在不含丙酮酸盐的 DMEM 培养基中添加 2% 胎牛血清（FCS）、1.2 mM CaCl2 以及青霉素/链霉素（青霉素 100 单位，链霉素 100 µg）。</li>
	<li>使用前对所有解剖器械进行灭菌处理。</li>
	<li>采用 CO2 窒息法处死淋巴结供体小鼠，并无菌解剖获取淋巴结。避免解剖周围脂肪组织。注：本方案优化用于外周皮肤引流淋巴结（腹股沟、臂部、腋窝淋巴结）。</li>
	<li>将淋巴结置于含有 2 ml 冰上预冷的基础培养基的无菌培养皿中。</li>
	<li>使用固定在 1 ml 注射器上的两根 25 G 针头破坏淋巴结包膜。</li>
	<li>将破碎后的淋巴结组织转移至含有 750 µl 基础培养基的 5 ml 聚丙烯圆底管中，培养基中添加 1 mg/ml IV 型胶原酶和 40 µg/ml I 型 DNase。</li>
	<li>每管中加入一个无菌磁力搅拌子。</li>
	<li>将试管放入盛有 37 °C 预热去离子水的烧杯中，以缓慢速度（每秒 1 圈）搅拌 30 分钟。</li>
	<li>从磁力搅拌加热板上取出试管，静置使淋巴结碎片沉降。</li>
	<li>小心移除富含&#34;非基质细胞&#34;的上清液。注：若计划分析 T 细胞、B 细胞、树突状细胞及 CD45-gp38-CD31- 细胞，请保存&#34;非基质细胞&#34;组分。</li>
	<li>用 750 µl 基础培养基洗涤残留的淋巴结组织一次。注：此步骤仅在使用免疫功能健全小鼠时需要。</li>
	<li>静置使淋巴结碎片沉降。</li>
	<li>移除漂浮的非基质细胞组分。</li>
	<li>向淋巴结碎片中加入 750 µl 基础培养基，其中添加 3.5 mg/ml D 型胶原酶和 40 µg/ml DNase I。</li>
	<li>将试管重新放回盛有 37 °C 预热去离子水的烧杯中。</li>
	<li>在缓慢搅拌条件下消化淋巴结组织 5 分钟。</li>
	<li>使用自动多通道移液器以最大速度反复吹打 700 µl 液体，进行 10 个循环，以分散淋巴结组织碎片。注：此步骤有助于破坏组织结构，提高消化效率。</li>
	<li>将试管重新放回盛有 37 °C 预热去离子水的烧杯中。</li>
	<li>继续在缓慢搅拌条件下消化淋巴结组织碎片 10 分钟。</li>
	<li>使用自动多通道移液器以最大速度反复吹打混合 99 个循环，进一步分散淋巴结组织碎片。</li>
	<li>加入 7.5 µl 0.5 M EDTA，以维持单细胞悬液状态。</li>
	<li>再次使用自动多通道移液器以最大速度反复吹打混合 99 个循环，进一步分散淋巴结组织碎片。</li>
	<li>加入 750 µl 基础培养基，并将细胞悬液通过 70 µm 尼龙滤网过滤。</li>
	<li>将细胞悬液在 4 °C 条件下以 1,500 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>此时基质细胞可用于后续分析。</li>
</ol>
2. 淋巴结基质细胞染色
<ol>
	<li>使用抗 CD45、抗 podoplanin（gp38）、抗 CD31 抗体组合，可成功识别 TRC、LEC、BEC 和 DN 细胞。</li>
	<li>将消化后的淋巴结组织与活/死细胞标记物、抗-CD45-FITC（1:200）、抗-gp38-PE（1:200）、抗-CD31-APC（1:200）在含有2% FCS的100 μl HBSS中于4 °C避光孵育至少20分钟。</li>
	<li>加入500 μl含2% FCS的HBSS洗涤细胞</li>
	<li>在4°C、1500 × g条件下离心细胞悬液3分钟。</li>
	<li>用含2% FCS的HBSS重悬至100 μl。</li>
	<li>使用配备以下光学系统的流式细胞仪检测染色后的细胞：激发光源最多包含三种激光器，分别为蓝色（488 nm，空气冷却，20 mW 固态）、红色（633 nm，17 mW 氦氖）和紫色（405 nm，30 mW 固态）。</li>
	<li>门控 CD45- 排除造血细胞。</li>
	<li>通过门控单细胞（FSC-W）和活细胞（LIVE/DEAD 示踪剂）排除双联体和死细胞。</li>
	<li>绘制 gp38 与 CD31 用于可视化 TRC（gp38）+CD31-），LEC（gp38+CD31+），BEC（gp38-CD31+）和 DN（gp38-CD31-）细胞（参见 图1).</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+stroma+in+the+initiation+and+control+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses.</a> Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).</li>
<li>Roozendaal, R., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Cell+-+Immune+Cell+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stromal Cell - Immune Cell Interactions.</a> Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).</li>
<li>Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stromal+and+haematopoietic+antigen-presenting+cells+that+reside+in+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).</li>
<li>Bajénoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+networks+regulate+lymphocyte+entry%2C+migration%2C+and+territoriality+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes.</a> Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).</li>
<li>Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+fibroblastic+reticular+cells+construct+the+stromal+reticulum+via+contact+with+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).</li>
<li>Link, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+in+lymph+nodes+regulate+the+homeostasis+of+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).</li>
<li>Malhotra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+stroma+from+inflamed+and+resting+lymph+nodes+defines+immunological+hallmarks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks.</a> Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).</li>
<li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).</li>
<li>Sixt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conduit+system+transports+soluble+antigens+from+the+afferent+lymph+to+resident+dendritic+cells+in+the+T+cell+area+of+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node.</a> Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).</li>
<li>MartIn-Fontecha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+to+the+draining+lymph+node%3A+impact+on+T+lymphocyte+traffic+and+priming%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming.</a> The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).</li>
<li>Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+of+the+chemokines+ELC+and+SLC+by+T+zone+stromal+cells+and+deletion+of+the+ELC+gene+in+the+plt%2Fplt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).</li>
<li>Braun, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+lymph-derived+T+cells+and+DCs+use+different+chemokine+receptor+CCR7-dependent+routes+for+entry+into+the+lymph+node+and+intranodal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration.</a> Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).</li>
<li>Fletcher, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+lymph+node+stromal+cells+reveals+site-dependent+differences+in+fibroblastic+reticular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells.</a> Frontiers in immunology. 2, 35(2011).</li>
<li>Lukacs-Kornek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+release+of+nitric+oxide+by+nonhematopoietic+stroma+controls+expansion+of+the+activated+T+cell+pool+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).</li>
<li>Siegert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+from+lymph+nodes+attenuate+T+cell+expansion+by+producing+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide.</a> PLoS ONE. 6 (11), e27618(2011).</li>
<li>Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+priming+by+lymphoid+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell priming by lymphoid stroma.</a> PLoS ONE. 6 (11), e26138(2011).</li>
<li>Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+direct+local+differentiation+of+regulatory+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells.</a> Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).</li>
<li>Onder, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-specific+lymphotoxin-%CE%B2+receptor+signaling+is+critical+for+lymph+node+and+high+endothelial+venule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).</li>
<li>Fletcher, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+fibroblastic+reticular+cells+directly+present+peripheral+tissue+antigen+under+steady-state+and+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions.</a> The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).</li>
<li>Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+stroma+broaden+the+peripheral+tolerance+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm.</a> Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).</li>
<li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node-resident+lymphatic+endothelial+cells+mediate+peripheral+tolerance+via+Aire-independent+direct+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).</li>
<li>Lee, J. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+antigen+display+by+lymph+node+stroma+promotes+T+cell+tolerance+to+intestinal+self%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self.</a> Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).</li>
<li>Nichols, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletional+self-tolerance+to+a+melanocyte%2Fmelanoma+antigen+derived+from+tyrosinase+is+mediated+by+a+radio-resistant+cell+in+peripheral+and+mesenteric+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes.</a> J Immunol. 179, 993-1003 (2007).</li>
<li>Gardner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletional+tolerance+mediated+by+extrathymic+Aire-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells.</a> Science. 321, 843-847 (2008).</li>
<li>Gardner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+Aire-expressing+cells+are+a+distinct+bone+marrow-derived+population+that+induce+functional+inactivation+of+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells.</a> Immunity. 39, 560-572 (2013).</li>
<li>Magnusson, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+presentation+of+antigen+by+lymph+node+stromal+cells+protects+against+CD8+T-cell-mediated+intestinal+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity.</a> Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).</li>
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</ol>

作者声明不存在竞争性经济利益。

由于两种已发表的消化方案的出现，淋巴结基质细胞的研究最近成为研究焦点6,13。这两种方案均能够获得单个淋巴结基质细胞，但在消化酶的使用和消化时间上存在差异。由于基质细胞及其表面标志物对酶消化和机械应力敏感，因此需要优化的实验方案。
从新鲜解剖的淋巴结中分离出有活力的淋巴结基质细胞，是进行表型和功能分析的第一步。因此，使用确定浓度的酶、在稳定的温度下并按照指定时间进行仔细消化至关重要。已有两种消化方案被描述6,13，但其消化步骤相对较长。为了缩短消化时间，本方案引入了机械性解离，并使用多通道移液器进行了标准化操作。当前方案的一个优势在于，仅需45分钟即可完成基质细胞的分离，从而最大限度地减少了细胞与消化酶的孵育时间。此外，消化过程中持续搅拌有助于消化酶充分接触淋巴结结构。同时，消化体积被减少至750 µl，从而降低了酶的使用量。
过大的机械力会破坏紧密连接，但同时可能导致细胞死亡。因此，我们测试了多种重悬循环次数与不同解离装置的组合。我们发现，使用自动化多通道移液器仅需两次、每次99个...

淋巴结是特化的结构，在其中启动并协调针对外来和自身抗原的适应性免疫应答。本文所述方法结合了短暂的酶消化与自动化机械移液，以获得淋巴结单细胞悬液，并获取仍维持多种分子表面表达的活性淋巴结基质细胞。
淋巴结基质细胞构成淋巴结的支架结构，并执行三大主要功能：首先，它们过滤体液，以捕获抗原、病原体及其病原体相关分子模式（PAMPs），以及体内存在的细胞因子和损伤相关分子模式（DAMPs）；其次，它们招募并指导抗原呈递细胞（APC）与淋巴细胞相互作用，启动适应性免疫应答；第三，它们为淋巴细胞的稳态维持和分化提供结构环境1-3。在炎症过程中，淋巴结基质细胞产生生长因子、细胞因子和趋化因子，适应淋巴结肿胀，并协调树突状细胞（DCs）、T细胞和B细胞之间的相互作用。这种对免疫应答的协调作用之所以能够实现，依赖于由不同基质细胞群体所形成的复杂结构架构。
淋巴结基质细胞是CD45阴性细胞，可通过成纤维细胞和内皮细胞中CD31或gp38的表达进行区分1-6。Gp38+CD31-标记T细胞区网状细胞（TRC，也称为FRC：成纤维性网状细胞），gp38+CD31+标记淋巴管内皮细胞（LEC），gp38-CD31+标记血管内皮细胞（BEC）。此外，对亚群的进一步表征揭示了其他类型的淋巴结基质细胞的存在。事实上，在gp38-CD31-细胞群中鉴定出一类少量的周细胞样细胞群体7。因此，优化分离步骤有助于鉴定和表征不同淋巴结基质细胞的功能特性。
在开发出淋巴结基质细胞消化方案之前，对淋巴结基质细胞的研究仅限于通过组织切片和显微镜进行的原位观察。然而，结构与功能研究表明，淋巴结基质细胞具有重要的特性。淋巴结基质细胞与podoplanin、胶原蛋白及细胞外基质（ECM）蛋白相关联，形成一种称为导管系统的复杂三维结构，该系统将淋巴液及相关的低分子量蛋白从淋巴结的被膜下窦运输至T细胞区的高内皮微静脉8。树突状细胞（DCs）与基质细胞紧密接触，常可观察到其突起伸入管状导管结构中，以取样液体并检测抗原8。淋巴结基质细胞（TRCs和LECs）与DCs之间的相互作用由趋化因子CCL21和CCL19的释放与呈递所介导9,10。CCL19和CCL21可被CCR7受体识别，从而促进DCs和T细胞迁移至淋巴结的T细胞区4,11。尽管使用相似的趋化因子，DCs和T细胞进入淋巴结的迁移路径却不同12。随后，通过酶消化法处理淋巴结并分离纯化的淋巴结基质细胞，研究人员得以开展功能研究，探讨不同类型淋巴结基质细胞的作用及其与DCs和T/B细胞相互作用的能力6,13。首先，产生IFN-γ的效应T细胞与淋巴结基质细胞之间的相互作用可诱导代谢产物一氧化氮的生成，后者已被证明可抑制次级淋巴器官中T细胞的反应和增殖14-16。其次，已有报道指出，淋巴结基质细胞可通过分泌IL-10支持调节性DC亚群的分化17，并通过产生IL-7调节初始T细胞的稳态6,18。第三，淋巴结基质细胞表达TLR，提示这些基质细胞可能对感染信号或组织损伤过程中释放的自身分子产生响应。事实上，用TLR3配体poly(I:C)处理淋巴结基质细胞可轻微上调主要组织相容性复合体I类分子的表达，并上调共抑制分子PD-L1的表达，但不诱导共刺激分子的表达，从而导致外周组织抗原表达发生显著变化19。多个研究团队已证实，淋巴结基质细胞表达外周组织抗原，并可诱导自身反应性T细胞的耐受19,21-27。因此，深入理解淋巴结基质细胞与其他迁移性和定居性淋巴结细胞之间的相互作用，将有助于发现新的靶分子，以在炎症过程中调控免疫应答的激活或抑制。因此，有必要实施已发表的淋巴结酶分离方法。
既往发表的实验方案采用不同组合的胶原酶消化法并结合较低的机械剪切力6,19,20。然而，长时间的消化酶孵育或不同的消化酶组合可能会降解多种用于分析活化状态及鉴定新的淋巴结基质细胞所需的表面分子。根据基质细胞分析的类型，Link方案或Fletcher方案可能更为适用。在本描述的方法中，采用稍短时间的酶消化并结合自动化机械解离，以最大程度减少活淋巴结基质细胞表面标志物的降解。该方法可实现高度可重复的淋巴结基质细胞亚群分离与区分，变异度低，细胞存活率超过95%。新分离的淋巴结基质细胞可直接用于表面标志物表达分析、蛋白质分析和转录水平研究，也可用于建立基质细胞系，以开展体外功能实验in vitro。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>LifeTechnologies-Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td></td><td></td><td>终浓度 2%</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>499609</td><td>终浓度 1.2 mM</td></tr><tr><td>胶原酶IV</td><td>沃辛顿生物化学公司</td><td></td><td>&gt;每毫克干重160单位，使用终浓度为1 mg/ml</td></tr><tr><td>胶原酶D</td><td>罗氏</td><td>11088882001</td><td>使用浓度为 3.5 mg/ml</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>罗氏&amp;nbsp;</td><td>11284932001</td><td>40时使用 &amp;micro;微克/毫升</td></tr><tr><td>搅拌磁子</td><td>FAUST</td><td></td><td>5 mm 长-2 mm &amp;oslash;</td></tr><tr><td>5 ml 聚苯乙烯圆底管</td><td>Falcon-BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带加热功能的磁力搅拌器</td><td>IKA-RCT-standard</td><td>9720250</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 无菌培养皿</td><td>TPP</td><td>6223201</td><td></td></tr><tr><td>25 G 针头</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45 抗体</td><td>Biolegend</td><td></td><td>克隆 30-F11</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11c 抗体</td><td>Biolegend</td><td></td><td>克隆 N418</td></tr><tr><td>抗小鼠 Podoplanin 抗体</td><td>Biolegend</td><td></td><td>克隆 8.1.1</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD31 抗体</td><td>Biolegend</td><td></td><td>克隆 MEC13.3</td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Eppendorf Xplorer plus，多通道</td><td>Eppendorf</td><td>4861 000.821/830</td><td>1.250 &amp;micro;最大体积</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD140a</td><td>Biolegend</td><td></td><td>克隆 APA5</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>克隆 16-10A1</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD40</td><td>Biolegend</td><td></td><td>克隆 1C10</td></tr><tr><td>抗小鼠 I-Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>克隆 AF6-120.1</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD274（PD-L1）</td><td>Biolegend</td><td></td><td>克隆 10F.9G2</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定近红外死细胞染色试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠淋巴结基质细胞的分离

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

包括淋巴结在内的次级淋巴器官由基质细胞组成，这些基质细胞为淋巴细胞的稳态维持、活化和分化提供了结构环境。通过黏附分子CD31和糖蛋白podoplanin（gp38）的表达，已在双阴性细胞群体中鉴定出多种基质细胞亚群，包括T细胞区网状细胞或成纤维性网状细胞、淋巴管内皮细胞、血管内皮细胞以及类似成纤维性网状细胞的周细胞。对于这些不同细胞群体，已描述其具有多种功能，包括分隔和衬覆不同区域、吸引并与其他不同类型细胞相互作用、过滤引流液以及收缩淋巴管。近年来，多个研究团队报道了基质细胞在协调和调控可能对宿主造成危害的细胞毒性T细胞反应中的额外作用。
淋巴结是具有多种不同细胞类型的复杂结构，因此需要采用适当的方法来分离所需细胞群体。目前，淋巴结基质细胞的分离方案主要依赖于酶消化法，并采用不同的孵育时间；然而，基质细胞及其表面分子对这些酶较为敏感，容易导致表面标志物表达丢失和细胞死亡。本文提出一种短时间酶消化结合自动机械解离的方法，以获得存活的单细胞悬液，并维持淋巴结基质细胞表面分子的表达。

本方案改编自Link 等于2007年发表的消化法6，由于采用自动化多通道移液器进行机械解离，消化时间更短（最长45分钟）。此外，该方法更具标准化，可最大限度减少不同淋巴结基质细胞表面标志物的降解，并支持同时处理多个样本。
在Links方案6和本方案中使用的胶原酶IV和胶原酶D，或在Fletchers方案13中使用的胶原酶P和中性蛋白酶，均可维持淋巴结基质细胞的活力，并避免消化包括CD45、gp38和CD31在内的多种表面标志物。为验证本方案，切除腋窝、臂部和腹股沟淋巴结并进行消化以分离其基质细胞。对CD45、gp38和CD31表达的分析显示，从C57BL/6小鼠中分离出了滤泡树突状细胞（TRC）、淋巴管内皮细胞（LEC）、血管内皮细胞（BEC）和双阴性细胞（DN）（图1，设门策略）。
机械应力可能在消化过程中降低淋巴结基质细胞的存活率。通过比较三种不同方案分离的基质细胞亚群的存活率，发现Fletcher方案中细...

分离淋巴结基质细胞是一个多步骤过程，包括酶消化和机械解离，以获得纤维状网状细胞、淋巴管和血管内皮细胞。在本描述的方法中，采用短时间消化结合自动化的机械解离，以最大程度减少活的淋巴结基质细胞表面标志物的降解。

包括淋巴结在内的次级淋巴器官由基质细胞组成，这些细胞为稳态、活化和……提供了结构性环境

本实验的总体目标是分离淋巴结基质细胞。首先通过破坏淋巴结的被膜来实现这一目标；第二步，使用胶原酶IV和DNase I对淋巴结碎片进行消化。随后用胶原酶D和DNase I替换酶液，并使用自动化多通道移液器对组织片段进行机械解离。最终，可通过流式细胞术对分离得到的淋巴结细胞的细胞表面分子表达情况进行表征。该技术相较于现有方法的主要优势在于：本方法采用标准化的酶消化程序，结合机械解离，用于消化淋巴结SHR细胞，能够有效保持细胞的活力及其表面分子的表达特性。首先，将解剖得到的淋巴结置于含有两毫升冰上预冷培养基的无菌培养皿中。然后使用两个配备25号针头的1毫升注射器破坏淋巴结的包膜。接着，将破碎的组织转移至含有750微升培养基的5毫升锥形管中，培养基中需添加胶原酶IV和DNA酶I，并使用磁力搅拌器进行搅拌。然后将试管放入盛有预热至37摄氏度水的烧杯中，置于磁力搅拌器上，以每秒一圈的速度搅拌细胞悬液30分钟。搅拌结束后，让淋巴结碎片沉降，然后小心移除上清液。现在将750微升新鲜培养基转移至富含非基质细胞的淋巴结碎片中，培养基中需添加胶原酶D和DNase I，随后在37摄氏度下继续搅拌组织5分钟。接下来，使用自动化多通道移液器在700 µL体积中以最大速度对淋巴结组织碎片进行10个循环的解离，然后在10分钟后再次混匀组织碎片。随后，使用自动化多通道移液器以最大速度对组织团块进行99个循环的进一步解离。然后向管中加入7.5 µL的0.5 M EDTA，并使用自动化移液器对组织悬液再进行99个循环的混匀。最后一次解离循环结束后，向细胞悬液中加入750微升培养基，并通过70微米尼龙滤网过滤细胞。然后在4摄氏度、1500 ×g条件下离心5分钟，收集细胞沉淀。为了通过流式细胞术分析淋巴结基质细胞群体，将适当的细胞样本加入含2% FCS的100微升HBSS缓冲液中，与活死染料及目标抗体在4摄氏度避光孵育至少20分钟。然后用500微升含FCS的HBSS洗涤细胞并重悬。将沉淀重悬于100微升HBSS和FCS中，上流式细胞仪，设门排除CD45阳性细胞以去除造血细胞，再对活单细胞群体设门。最后，绘制GP38与CD31的散点图，以分辨T区网状细胞、淋巴管内皮细胞、血管内皮细胞及双阴性细胞。细胞群体。在消化后回收的淋巴结基质细胞亚群总细胞数略高于Link和Fletcher方案，表明本方案分离后淋巴结基质细胞的存活率与已发表方案相当。通过本方案以及Link和Fletcher方案分离的T区网状细胞和淋巴管内皮细胞，其IAB、CD140a、CD80、PD-L1和CD40表达水平进行了比较。对于两种基质细胞亚群，采用上述已展示的方案和连接方案消化后，所有五种表面分子的表达均更高，表明胶原酶IV和D对某些表面分子的降解作用较胶原酶P和DYS space更弱。观看本视频后，您应能够充分理解如何成功分离淋巴结基质细胞的四个主要亚群，同时保留多种可用于后续鉴定与分析的表面分子的表达。

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