鼠淋巴结基质细胞的分离

淋巴结基质细胞的分离是一个多步骤过程，包括酶消化和机械解聚，以获得成纤维细胞网状细胞、淋巴和血液内皮细胞。在所述程序中，短消化与自动机械解聚相结合，以最大限度地减少活淋巴结基质细胞的表面标志物降解。

该程序的总体目标是分离淋巴结基质细胞。这是通过首先破坏淋巴结包膜来实现的。在第二步中，淋巴结片段被胶原酶 4 和 D nase 1 消化。

然后用胶原酶 D 和 D nase one 替换酶，并使用自动多通道移液器机械解聚片段。最终，可以通过流式细胞术表征分离的淋巴结细胞的细胞表面分子表达。与现有方法相比，该技术的主要优点是，使用这种方法，淋巴结 SHR 细胞使用标准化的酶程序进行消化，并辅以机械解聚，以保持细胞的活力和表面分子表达。

首先将解剖的淋巴结放入含有 2 毫升冰冷培养基的无菌培养皿中。然后使用两个配备 25 号针头的 1 毫升注射器破坏淋巴结胶囊。接下来，将破坏的组织转移到含有 750 微升培养基的 5 毫升锥形管中，补充有胶原酶 4 和 DNA 1 以及磁力搅拌。

然后将试管放入装有预热 37 摄氏度水的烧杯中，放在磁力搅拌器上，以每秒一轮的速度搅拌细胞浆液 30 分钟。搅拌后，让淋巴结碎片沉淀，然后小心去除上清液。现在富集用于非基质细胞，将 750 微升新鲜培养基转移到淋巴结片段中，补充胶原酶 D 和 D nase 一，然后在 37 摄氏度下再搅拌组织 5 分钟。

接下来，使用自动多通道移液器以最大速度将 700 微升体积的淋巴结组织碎片解聚 10 个循环，然后在 10 分钟后再次搅拌组织碎片。此外，使用自动多通道移液器以最大速度解聚组织团块 99 个循环。然后向试管中加入 7.5 微升 0.5 摩尔 EDTA，并用自动移液器将组织悬液再混合 99 个循环。

在最后一个解聚循环后，向细胞溶液中加入 750 μL 培养基，并通过 70 μm 尼龙网过滤细胞。然后在 1500 G 和 4 摄氏度下沉淀细胞 5 分钟。为了通过流式细胞术观察淋巴结基质细胞群，用活死追踪器和 100 微升含 2%FCS 的 HBSS 中的目标抗体在 4 摄氏度下在黑暗中染色至少 20 分钟。

然后在 500 微升含 FCS 的 HBSS 中洗涤细胞并重悬。100 μL HBSS 和 FCS 中的沉淀物在流式细胞仪上运行细胞，门控 CD 45 阳性细胞以排除造血细胞，然后在活的单线态群体上步态。最后，绘制 GP 38 与 CD 31 的对比图，以可视化 T 区网状细胞、淋巴内皮细胞、血内皮细胞和双阴性细胞。

细胞群。与 link 和 Fletcher 方案相比，在刚刚演示的方案中，淋巴结基质细胞亚群消化后回收的总细胞数略高，这表明通过该方案分离后淋巴结基质细胞的活力与使用已发布的方案恢复的细胞相似。通过此分离的 T 区网状细胞和淋巴内皮细胞以及 link 和 Fletcher 方案比较了 IAB CD one 40 a CD 80 、 PD L one 和 CD 40 表达。

使用刚刚演示的方案和两个基质细胞亚群的链接方案消化后，所有五个表面分子的表达都较高，这表明胶原酶 4 和 D 对某些表面分子的降解不如胶原酶 p 和 DYS 空间稳健。观看本视频后，您应该对如何成功分离淋巴结基质细胞的四个主要亚群，同时保留有助于其进一步表征和分析的几种表面分子的表达有一个很好的了解。