小鼠淋巴结基质细胞的分离

本实验的总体目标是分离淋巴结基质细胞。首先通过破坏淋巴结的被膜来实现这一目标；第二步，使用胶原酶IV和DNase I对淋巴结碎片进行消化。

随后用胶原酶D和DNase I替换酶液，并使用自动化多通道移液器对组织片段进行机械解离。最终，可通过流式细胞术对分离得到的淋巴结细胞的细胞表面分子表达情况进行表征。该技术相较于现有方法的主要优势在于：本方法采用标准化的酶消化程序，结合机械解离，用于消化淋巴结SHR细胞，能够有效保持细胞的活力及其表面分子的表达特性。

首先，将解剖得到的淋巴结置于含有两毫升冰上预冷培养基的无菌培养皿中。然后使用两个配备25号针头的1毫升注射器破坏淋巴结的包膜。接着，将破碎的组织转移至含有750微升培养基的5毫升锥形管中，培养基中需添加胶原酶IV和DNA酶I，并使用磁力搅拌器进行搅拌。

然后将试管放入盛有预热至37摄氏度水的烧杯中，置于磁力搅拌器上，以每秒一圈的速度搅拌细胞悬液30分钟。搅拌结束后，让淋巴结碎片沉降，然后小心移除上清液。现在将750微升新鲜培养基转移至富含非基质细胞的淋巴结碎片中，培养基中需添加胶原酶D和DNase I，随后在37摄氏度下继续搅拌组织5分钟。

接下来，使用自动化多通道移液器在700 µL体积中以最大速度对淋巴结组织碎片进行10个循环的解离，然后在10分钟后再次混匀组织碎片。随后，使用自动化多通道移液器以最大速度对组织团块进行99个循环的进一步解离。然后向管中加入7.5 µL的0.5 M EDTA，并使用自动化移液器对组织悬液再进行99个循环的混匀。

最后一次解离循环结束后，向细胞悬液中加入750微升培养基，并通过70微米尼龙滤网过滤细胞。然后在4摄氏度、1500 ×g条件下离心5分钟，收集细胞沉淀。为了通过流式细胞术分析淋巴结基质细胞群体，将适当的细胞样本加入含2% FCS的100微升HBSS缓冲液中，与活死染料及目标抗体在4摄氏度避光孵育至少20分钟。

然后用500微升含FCS的HBSS洗涤细胞并重悬。将沉淀重悬于100微升HBSS和FCS中，上流式细胞仪，设门排除CD45阳性细胞以去除造血细胞，再对活单细胞群体设门。最后，绘制GP38与CD31的散点图，以分辨T区网状细胞、淋巴管内皮细胞、血管内皮细胞及双阴性细胞。

细胞群体。在消化后回收的淋巴结基质细胞亚群总细胞数略高于Link和Fletcher方案，表明本方案分离后淋巴结基质细胞的存活率与已发表方案相当。通过本方案以及Link和Fletcher方案分离的T区网状细胞和淋巴管内皮细胞，其IAB、CD140a、CD80、PD-L1和CD40表达水平进行了比较。

对于两种基质细胞亚群，采用上述已展示的方案和连接方案消化后，所有五种表面分子的表达均更高，表明胶原酶IV和D对某些表面分子的降解作用较胶原酶P和DYS space更弱。观看本视频后，您应能够充分理解如何成功分离淋巴结基质细胞的四个主要亚群，同时保留多种可用于后续鉴定与分析的表面分子的表达。