一种用于高通量/高内涵筛选的细胞内分枝杆菌定量显微表型检测方法

本实验的总体目标是测定表型调节因子（如宿主基因沉默或小分子化合物）对结核分枝杆菌在细胞内复制的影响。首先，将小分子化合物分配至384孔板中，或对细胞进行irna转染以形成转染复合物。下一步，用表达绿色荧光蛋白的结核分枝杆菌（G-F-P-M-T-B）感染细胞，然后将细胞加入含有小分子化合物的孔板中，并将微孔板孵育五天。

对于RNAi方法，将细胞接种到含有RNAi转染复合物的孔中。将微孔板孵育三天，然后用表达G-F-P-M-T-B的结核分枝杆菌感染细胞。染色后，最后一步是使用自动共聚焦显微镜读取微孔板。

最终，通过自动化荧光显微镜结合基于图像的分析，用于检测G-F-P-M-T-V细胞内生长的变化。该技术相较于现有的菌落形成单位计数法，主要优势在于省去了漫长的孵育周期，并可实现更高的通量。演示该实验流程的将是Christophe Keval或SONG，以及我研究团队中的三位博士后研究员。

siRNA文库筛选和化合物文库筛选的实验方案均使用表达GFP的两周龄结核分枝杆菌H37RV培养物。制备GFP-MTB菌液时，首先将培养物在4,000 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，用DPBS重悬菌体，再次离心。用DPBS洗涤菌体共三次。

第三次洗涤后，弃去上清液，并将细菌沉淀重悬于10毫升含10% FBS的RPMI 1640培养基中。室温静置1小时，使细菌聚集体沉降。收集细菌上清液，于600纳米处测定OD值及GFP荧光强度。

使用酶标仪测定细菌浓度时，600纳米处的OD值应在0.6至0.8之间。利用参考回归线计算悬浮液的滴度，该回归线显示了在相同条件下培养的另一菌株实验前测得的RFU值与CFU值之间的函数关系。典型的浓度为每毫升1×10⁸个细菌。

开始此操作时，用一倍体积的X-S-I-R-N-A缓冲液重悬保存在96孔母板中的干燥SI RNA文库，使其浓度为2微摩尔。将10微升该混合物转移至384孔子板的每个孔中，再从子板的每个孔中转移2.5微升SI RNA至同一块384孔检测板中。

向各自的孔中分别加入 2.5 µL 的阴性对照和阳性对照 IRNA。如果子板不会立即使用，请用可剥离的铝膜密封。密封后的板可在 -20 °C 下保存至少六个月，根据 IRNA 的不同，可能可保存长达两到三年。

按照文库生产商的建议操作。将转染试剂用一倍X-D-P-B-S稀释，配制足够的溶液，使每孔加入0.1微升。将稀释后的转染溶液在室温下预孵育5分钟。

向384孔检测板的每孔中加入7.5微升稀释后的转染溶液，然后在每孔中加入40微升悬浮于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中的人2型肺泡上皮A549细胞，室温孵育30分钟。将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳的环境中培养3天。这些细胞每24小时分裂一次，因此转染后3天，每孔约有12,000个细胞。

在siRNA转染549细胞后的第三天，制备MTBH37RV GFP细菌悬液。如先前所述。

菌液浓度应为每毫升2.4×10⁶个细菌，相当于感染复数为5。吸除384孔检测板中的培养基，每孔加入25 µL菌液。将384孔检测板置于含5% CO₂的环境中，37 °C孵育5小时。

五小时后，移除培养基，用添加了10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基轻轻洗涤细胞三次，以杀死残留的细胞外细菌。每孔细胞加入50微升进行处理。

加入含有每毫升50微克阿米卡星的新鲜RPMI-FBS培养基，在37摄氏度、含5%二氧化碳的环境中孵育1小时。最后，移除含有阿米卡星的培养基，并向每孔加入50微升添加了10% FBS的新鲜RPMI培养基。

将检测板置于含5%二氧化碳的环境中，37摄氏度孵育五天，随后通过共聚焦显微镜进行筛选。开始该实验前，将含有化合物库（溶于100%DMSO）的384孔母板在室温下解冻，从母板中转移0.5微升化合物至384孔子板中，子板每孔预先加入10微升含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。接着，在RPMI 1640培养基中收集培养六天的人原代巨噬细胞，浓度为4×10⁵个细胞/毫升。

在37摄氏度、90 RPM轻度振荡条件下，将稀释的原代细胞与不同感染复数（MOI）为1至5的巴斯德菌在补充有10%胎牛血清（FPS）和每毫升50纳克重组人M-CSF的培养基中共同孵育2小时。通过在350 ×g离心5分钟，洗涤感染的细胞以去除胞外细菌。

重悬沉淀于添加了10% FPS的RPMI 1640培养基中，再次离心。最后洗涤完成后，重复此步骤，共洗涤两次。

将感染的细胞重悬于添加了10% FBS和50微克/毫升阿米卡星的RPMI 1640培养基中，37摄氏度下轻柔振荡孵育1小时，然后在350 ×g离心5分钟。弃去含有阿米卡星的培养基，用完全RPMI 1640培养基洗涤感染的细胞。

加入10% FBS和每毫升50纳克重组人MCSF的培养基。此洗涤步骤重复一次。

将感染的巨噬细胞悬液每孔 40 微升加入先前准备的同一 384 孔检测板中，该检测板中已含有 10 微升化合物稀释液。此时每孔中 DMSO 的终浓度为 1%。将检测板在 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的环境中孵育五天，随后通过共聚焦显微镜对 SI RNA 文库进行筛选。在图像采集前的筛选过程中，向检测板的每孔中加入 10 微升 freshly prepared 的 PBS 配制 30 微克/毫升 DPI 溶液，并在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。

进行化合物筛选时，在图像采集前，将活细胞与细胞通透性远红荧光染料在37摄氏度下孵育30分钟进行染色。将检测板加载到自动共聚焦显微镜中。设置曝光参数，使用405纳米激发激光和450纳米发射滤光片记录DPI荧光。

使用488纳米激发激光和520纳米发射滤光片记录GFP荧光。选择待采集的孔以及每孔中的视野，这些选择随后被称为布局和子布局。根据设定的参数生成实验文件，并运行自动采集。

在此情况下，会记录同一孔和视野的四幅不同图像，并将这些图像传输至远程服务器。随后，使用acapella 2.6图像分析软件对图像进行评估，用于siRNA筛选。每个视野包含两个通道或颜色。

细菌显示为绿色，细胞显示为蓝色。通过使用核检测算法分析DAPI通道以识别细胞核，并使用像素强度特性算法分析GFP通道以识别细菌区域。通过合并通道并计算细菌与细胞共有的像素数量，对胞内细菌进行定量。

最终结果以四个视野的平均值表示，包括总细菌面积、细胞总数、感染细胞百分比以及每个细胞的细菌面积。对于化合物筛选，每个视野包含两个通道或颜色，细菌为绿色，细胞为远红。利用基于像素强度特性的算法，通过远红通道检测细胞核和细胞质以确定细胞面积，通过GFP通道确定细菌面积。

通过合并通道并计数细菌与细胞核共有的像素数量，可对胞内细菌进行定量。最终结果以四个视野的平均值表示，包括总细菌面积、总细胞面积、胞内细菌总面积，以及胞内细菌面积与细胞总面积的比值。此处展示了高通量全基因组siRNA筛选的代表性结果，用siRNA沉默din基因的表达导致549个细胞中胞内分枝杆菌数量减少。

如这些代表性的共聚焦图像所示，将549细胞转染非靶向siRNA或针对din one的特异性siRNA，并用表达GFP的结核分枝杆菌（MTB）感染五天。GFP标记的MTB H37RV以绿色显示，细胞以红色显示。使用基于图像的分析软件测定细胞数量及细胞内GFP-MTB-H37RV载量。

该图显示了五组重复实验中，转染对照序列siRNA（蓝色圆圈表示）和DIN one siRNA（红色圆圈表示）的A549细胞的感染百分比。在沉默处理三天并感染五天后，与转染非靶向对照siRNA的细胞相比，DIN one沉默的A549细胞中感染细胞的比例降低了一半。通过对靶向DIN one的siRNA组与对照组进行基于样本的标准化处理，计算得出Z值。

针对SI靶向DIN1，获得的Z分数平均值约为-15。三个星号代表P值小于0.0001。这些结果表明，DIN1可作为si的阳性对照，用于筛选其他参与结核分枝杆菌（MTB）在肺泡上皮细胞中定植的新宿主因子，这些因子在高含量化合物筛选中可能表现出与DIN1干扰RNA（dins IRNA）相同的表型。

通过建立剂量反应曲线（DRC）并将结果相对于参考阳性与阴性化合物进行归一化，评估化合物对细胞内细菌生长的抑制效果。在此示例中，用表达绿色荧光蛋白（GFP）的结核分枝杆菌H37Rv菌株感染人原代巨噬细胞，随后分别加入1% DMSO作为阴性对照，或加入浓度递增的两种参考化合物异烟肼（INH）和利福平（RIF）。巨噬细胞用红色荧光染料标记，绿色信号代表结核分枝杆菌。对感染的人巨噬细胞进行共聚焦荧光成像分析显示，活性化合物可影响结核分枝杆菌在宿主细胞内的复制，导致分枝杆菌负荷量减少，表现为细胞内GFP信号面积的减小。

计算细胞内细菌面积与总细胞面积的比值，并将其作为化合物浓度的函数进行绘图，从而生成此处所示的剂量-反应曲线（DRC）。每张图中显示的是isid和利福平的DRC。化合物的曲线以1% DMSO（阴性对照）和0.1 微克/毫升 isid（阳性对照）为基准进行归一化处理。这些曲线可用于确定抑制50%细菌定植所需的浓度，以及抑制99%细菌复制所需的最低浓度。一个学期。

该技术可在8天内完成，总耗时约10小时，具体分配如下：2小时用于细胞转染或化合物制备，6小时用于细胞感染及向微孔板中分液，2小时用于持续进行图像采集。请注意，操作结核分枝杆菌时存在极高风险，因此在执行本实验过程中，必须始终采取必要的预防措施，例如佩戴个人防护装备，包括口罩。