用于适应高通量/高含量筛查的细胞内分枝杆菌定量的微观表型检测

在这里，我们描述了一种表型检测，适用于小干扰合成RNA（siRNA）、化合物和 结核 分枝杆菌突变库的高通量/高含量屏幕。该方法依靠使用自动共聚焦显微镜检测荧光标记的荧光结 核分枝杆菌 。

该程序的总体目标是测量表型调节剂（如宿主基因沉默或小分子对结核分枝杆菌、细胞内复制）的影响。这是通过首先分配小分子和 384 孔板或用 irna 转切细胞并转染成复合物来实现的。下一步是用表达结核分枝杆菌的绿色荧光蛋白或 G-F-P-M-T-B 感染细胞，将细胞添加到含有孔的小分子中，并将微孔板孵育 5 天。

对于 RNAi 方法，将细胞添加到含有 RNAi 转染复合物的孔中。将微孔板孵育 3 天，然后用表达 G-F-P-M-T-B 的结核分枝杆菌感染细胞。对细胞进行染色后，最后一步是使用自动共聚焦显微镜读取板。

最终，使用自动荧光显微镜检查，然后进行基于图像的分析来测量 G-F-P-M-T-V 细胞内生长的变化。现有方法（如菌落形成 uni 狩猎）的这种技术的主要优点是它节省了较长的潜伏期并允许更高的通量。演示此程序的将是 Christophe Keval 或 SONG 以及我研究团队的三名博士后研究员。

SI RNA 文库筛选和化合物库筛选方案利用两周龄的 GFP 表达结核分枝杆菌 H 37 RV 培养物。要制备 G-F-P-M-T-B 细菌悬浮液，首先将培养物以 4， 000 Gs 离心 5 分钟，弃去上清液 Resus，将培养物悬浮到 DPBS 中，然后以这种方式再次离心。用 DPBS 洗涤培养物 3 次。

第三次洗涤后，弃去上浆，将细菌沉淀重悬于 10 毫升含有 RPMI 1640 的 10% FBS 培养基中。将悬浮液在室温下放置 1 小时，让细菌聚集体沉淀。收集细菌上质并测量 600 纳米处的 OD 和 GFP 荧光。

使用酶标仪确定细菌浓度，600 纳米处的 OD 应在 0.6 和 0.8 之间。使用参考回归线计算悬浮液的滴度，将 RFU 值显示为在相同条件下制备的另一种培养物上实验之前生成的 CFU 值的函数。典型浓度为每毫升 10 至 8 个细菌的 1 倍。

通过 Resus 悬浮储存在 96 中的干燥 SI RNA 文库来开始此过程。孔母板含有一个 X-S-I-R-N-A 缓冲液，浓度为 2 微摩尔。将 10 μL 混合物转移到 384 孔子板的每个孔中，将 2.5 μL SI RNA 从子板的每个孔转移到 384 孔检测板中，再转移到同一检测板中。

将阴性和阳性对照 IRNA 各 2.5 微升添加到各自的孔中。如果不立即使用子板，请用可剥离的铝密封件密封。密封板可以在零下 20 摄氏度下储存至少六个月，也可能长达两到三年，具体取决于 IRNA。

库制造商的建议。通过在 1 个 X-D-P-B-S 中稀释来制备转染试剂，以产生足够的溶液，为每个试剂提供 0.1 μL。将稀释的转染溶液在室温下预孵育 5 分钟。

向 384 孔检测板的每个孔中加入 7.5 μL 稀释的转染溶液，并在室温下在 40 μL 人 2 型肺细胞（A 5、4、9 细胞）中孵育 30 分钟，悬浮在补充有 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中。将细胞在 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的环境中孵育三天。这些细胞每 24 小时分裂一次，因此转染后 3 天每个孔中约有 12， 000 个细胞。

si.5 49 个细胞的 RNA 转染制备 MTBH 37 RV GFP 细菌悬液。如前所述。

悬浮液每毫升应含有 2.4 乘以 10 至 6 个细菌，这相当于感染的多重性为 5。去除 384 孔检测板中的培养基，每孔加入 25 微升细菌悬浮液。将 384 孔检测板在 37 摄氏度下在含有 5% 二氧化碳的环境中孵育 5 小时。

五个小时后。取出培养基，用补充有 10% FBS 的 RPMI 培养基轻轻洗涤细胞 3 次，以杀死剩余的细胞外细菌。用 50 微升处理每个孔中的细胞。

一种新鲜的 R-P-M-I-F-B-S 培养基，每毫升含有 50 μg 的阿米卡星。在 37 摄氏度下在含有 5% 二氧化碳的环境中孵育 1 小时。最后，去除含有阿米卡星的培养基，并加入 50 微升新鲜的 RPMI 培养基，每培养基补充 10% FBS。井。

将检测板在 37 摄氏度下在含有 5% 二氧化碳的环境中孵育 5 天，然后通过共聚焦显微镜进行筛选。要开始此过程，解冻包含化合物库的 384 孔母板，在室温下溶解在 100% DMSO 中，将 0.5 微升化合物从母板转移到 384 孔子板中，每孔含有 10 微升 RPMI 1640。培养基补充有 10%FPS，下次在 RPMI 1640 中以 4 倍 10 至 5 个细胞/毫升收获 6 日龄的原代人巨噬细胞。

培养基补充 10%FPS 和每毫升 50 ng。重组人 MCSF 将稀释的原代细胞与 basia 以不同的 MOI （从 1 到 5） 悬浮液中孵育，在 37 摄氏度下以 90 RPM 的转速轻轻摇动 2 小时。通过在 350 GS 离心 5 分钟来洗涤受感染的细胞，以去除细胞外细菌。

复苏将颗粒悬浮在 RPMI 1640 中。补充有 10% FPS 的培养基并离心。再次重复此作，最后一次洗涤后洗涤两次。

Resus 将感染细胞悬浮在补充有 10% FBS 和 50 μg/mL 的 RPMI 1640 培养基中。Amikacin 将悬浮液在 37 摄氏度下轻轻摇动孵育 1 小时，在 350 GS 下离心 5 分钟。取出含有 Amikacin 的培养基，并用完全 RPMI 1640 洗涤感染的细胞。

培养基补充有 10% FBS 和 50 ng/mL。重组人 MCSF。重复此洗涤一次。

将每孔 40 微升感染的巨噬细胞悬液添加到先前制备的相同 384 孔测定板中，该测定板已经含有 10 微升化合物的稀释液。每个孔中 DMSO 的最终浓度现在为 1%在含有 5% 二氧化碳的环境中将检测板在 37 摄氏度下孵育 5 天，然后通过共聚焦显微镜筛选 SI RNA 文库。筛选 在图像采集之前，向检测板的每个孔中加入 10 微升新鲜制备的 30 微克/毫升 DPI 的 PBS 溶液，并在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。

化合物筛选 在图像采集之前，用细胞通透性远红荧光染料在 37 摄氏度下对活细胞染色 30 分钟。将检测板加载到自动共聚焦显微镜中。设置曝光参数，使用 405 纳米的激发激光和 450 纳米的发射滤光片记录 DPI 荧光。

使用 488 纳米激发激光和 520 纳米发射滤光片记录 GFP 荧光。选择要采集的井和每个井中的字段，这些字段称为布局和子布局。参数 使用设置的参数生成实验文件并运行自动采集。

在这种情况下，记录同一井和田的四个不同图像将图像传输到远程服务器。随后，使用 acapella 2.6 图像分析软件评估图像以进行 SI RNA 筛选。每个字段包含两个通道或颜色。

绿色代表细菌，蓝色代表细胞。细胞核使用细胞核检测算法检测 DAPI 通道中的细胞核，并使用像素强度特性算法检测 GFP 通道中的细菌区域。通过合并通道并计算细菌和细胞共享的像素数，可以量化细胞内细菌。

以四个字段的平均值表示的最终结果是细菌总面积、细胞总数、感染细胞的百分比和每个细胞的细菌面积。对于化合物筛选，每个字段包含两个通道或颜色，绿色代表细菌，远红色代表细胞。细胞核和细胞质使用像素强度特性算法从远红通道检测细胞区域，从 GFP 通道检测细菌区域。

通过合并通道并计算细菌和细胞核共享的像素数，可以量化细胞内细菌。最终结果表示为四个字段的平均值，即细菌总面积、细胞总面积、细胞内细菌总面积以及细胞内细菌面积与细胞总面积的比率。这里介绍了高通量全基因组 SI RNA 筛选的代表性结果，沉默 din one 与 SI RNA 的表达导致 5 49 个细胞中细胞内分枝杆菌数量减少。

如这些代表性共聚焦图像所示，5、49 个细胞转染了非靶标 IRNA 或 din 1 特异性 SI RNA，并感染了表达 MTB 的 GFP 5 天。GFP MT BH 37 RV 为绿色，细胞为红色。使用基于图像的分析软件确定细胞数量和细胞内 G-F-P-M-T-B-H 37 RV 载量。

该图显示了在蓝色圆圈表示的 5 次加扰 IRNA 的 5 次重复中感染 a 5 49 个细胞的百分比，din 一个 IRNA 由红色圆圈表示。沉默 3 天和感染 5 天后，与转染非靶向加扰 IRNA 的细胞相比，din 1 沉默 5 49 个细胞的感染细胞百分比降低了一半。与加扰相比，采用基于样本的 SI RNA 靶向 DIN 1 归一化来定义 Z 分数。

对于 SI，目标 DIN 获得了负 15 左右的 Z 分数平均值。三个星号表示小于 0.0001 的 P 值。这些结果表明，DIN one 可用作 si 的阳性对照，这是一种筛选，用于发现参与 MTB 定植的其他新宿主因子和肺细胞，这些因子可能具有与高含量化合物筛选中 dins IRNA 相同的表型。

通过建立剂量反应曲线或 DRC 并归一化为参考阳性和阴性化合物来评估化合物对细胞内细菌生长的效率。在这个例子中，将被表达 MTBH 37 RV 菌株的 A GFP 感染的人原代巨噬细胞与 1% DMSO 作为阴性对照或与浓度增加的两种参考化合物 isid、INH 和利福平一起孵育。里夫。巨噬细胞用红色荧光染料标记，绿色表示对感染的人巨噬细胞的共聚焦荧光图像的 MTB 分析显示，活性化合物会影响宿主细胞中 MTB 的细胞内复制，导致分枝杆菌载量降低，这与细胞中 GFP 信号的面积相对应。

计算细胞内细菌面积和总细胞面积之间的比率，然后绘制为化合物浓度的函数以生成 DRC，此处显示的是每张图中 isid 和利福平的 DRC。将化合物的 DRC 归一化为 1% DMSO（阴性对照）和 0.1 μg/mL（阳性对照）的 DRC。这些曲线允许确定抑制 50% 细菌定植所需的浓度和抑制 99% 细菌复制所需的最低浓度一个学期。

这项技术可以在 10 小时内完成，分为以下几点，2 小时用于细胞转染或化合物制备，6 小时用于细胞感染并分配到微孔板中，2 小时用于维持图像采集。这为期八天，不要忘记与结核分枝杆菌合作可能非常像艺术家一样，并且在执行此程序时应始终携带早熟，例如佩戴个人防护设备，包括口罩。