高通量兼容检测，以评估对巨噬细胞传代药物疗效结核分枝杆菌

将改善下一代抗结核药物的早期药物开发过程的新模型和检测是非常可取的。在这里，我们描述了一种快速、廉价且与 BSL-2 兼容的测定法，用于评估对结核分枝杆菌的药物疗效，该测定法可以很容易地适应高通量筛选。

该程序的总体目标是在 96 孔板格式中可重复地生成结核分枝杆菌感染的巨噬细胞聚集体结构，用于使用活力染料进行药物敏感性测试。这种方法可以改善抗结核化合物的早期药物开发过程，而候选化合物在临床环境中的转化效率低下会受到阻碍。这种简单、廉价、兼容 BSL 2 的感染模型的主要优点是它概括了生理相关的细胞渗透屏障，让人想起结核肉芽肿。

这产生的药物敏感性结果更能预测体内疗效。通过制备表达结核分枝杆菌 MC 平方 6206 的绿色荧光蛋白（以下简称 MTBGFP）来开始此过程，用于感染。请记住，这是无毒菌株，因此此处描述的方案中的所有工作都可以在生物安全二级设施中进行。

对于每个待设置的 96 孔板，在水平吊篮离心机中以 2.8 倍 10 至第 8 个 MTBGFP 以 3,200 倍 G 离心 5 分钟。离心后，吸出上清液并加入 5 毫升 RPMIC 以洗涤细菌。上下移液以重悬细胞。

然后再次离心。第二次离心后，倒出上清液，将细菌细胞重悬于 7 mL RPMIC 中，然后涡旋 10 秒。接下来，对于每个要设置的 96 孔板，以 250 倍 G 离心 7 乘以 10 至第六个 THP1 人单核细胞 5 分钟。

离心后，倒出上清液，将 THP1 细胞重悬于 7 ml RPMIC 中。接下来，通过向 A 行和 H 行以及第 1 列和第 12 列的孔中加入 200 微升无菌水，准备 96 孔板用于感染。这个水边将防止培养基蒸发。

向第 2 列添加 200 微升 RPMIC，向第 2 列添加 B 2 向第 2 列添加 200 微升 RPMIC，用于背景对照或空白。为了感染 THP1 单核细胞，使用移液器将整个准备好的 MTBGFP 细菌悬浮液转移到 THP1 细胞悬液中，并通过上下移液混合。最终的 THP1 细胞密度为每毫升 10 的 5 倍到 5 分之一，相应的感染孔重复性为 40。

接下来，将 THP1 MTBGFP 悬浮液倒入 25 mL储液槽中，然后使用多通道移液器，在其余 96 个孔（E 3 到 G 11）中加入 200 μL THP1 MTBGFP 悬浮液。将板在 37 摄氏度、5% CO2 中孵育 7 到 10 天。在整个孵育过程中，每两天使用多通道移液器更换培养基，从每个孔的顶部缓慢去除 100 微升用过的培养基，然后轻轻加入 100 微升预热的 RPMIC。

更换培养基时，重要的是要注意不要干扰孔底部的 MTB 巨噬细胞聚集体。每天使用荧光显微镜目视检查孔，该显微镜配备明场和 GFP 滤光片组，具有 4 至 10 X 物镜。如果需要，请记下 MTB 巨噬细胞聚集体的大小并捕获图像。

到第 7 至 10 天，MTB 巨噬细胞聚集体应足够大，可以进行药效测试，如视频后面所述。对于药物测试，在新的 96 孔板上准备两种抗结核药物，一式三份，如下所示。首先，将 125 微升 7H9C 培养基添加到 B 2 至 G 10 孔中。

接下来，在一毫升 7H9C 中制备两种药物，其浓度是最高所需最终浓度的两倍。使用移液管将每种药物 250 微升加入 B、C 和 D 11 孔中，然后分别向 E、F 和 G 11 孔中加入，一式三份处理。接下来，使用多通道移液器将 125 微升从 B 11 到 G 11 移动到 B 10 到 G 10 中，将测试药物连续稀释两倍。

每一步移液 5 次，混合。继续在板中从右到左移动 125 μL，并在第 4 列后停止。混合色谱柱 4 后，将 125 μL 丢弃到废液容器中。

第 2 列和第 3 列不应包含任何药物。这将允许它们用作背景，并用于积极的生长控制。接下来，从培养箱中取出含有 MTB 感染巨噬细胞的 96 孔板。

在不倾斜板的情况下，使用多通道移液器从 B 2 至 G 11 孔中去除 150 μL 培养基。然后如图所示倾斜板，将移液器吸头插入孔的底部边缘，并去除剩余的培养基，约 50 微升。由于 MTB 巨噬细胞聚集体粘附在孔底，因此不应损失任何材料。

但是，培养基的去除应尽可能轻柔，并且在此过程中必须注意避免重悬。将 100 微升 7H9C 培养基轻轻加入板的 B 2 至 G 11 孔中，其中含有 MTB 巨噬细胞聚集体。使用多通道移液器将 100 微升含有 96 孔板的药物转移到感染板的相应孔中。

然后将板放入密封袋中，在 37 摄氏度下孵育 3 天。刃天青测定依赖于代谢活性 MTB 产生的氧化物质，将蓝色刃天青转化为荧光粉红色试卤灵。颜色和荧光的变化可以用作确定细菌生长量的替代标志物。

在水中制备终浓度为 8 毫克/毫升的刃天青储备液。通过 22 微米孔径的 PVDF 膜过滤进行灭菌。通过将储备液、水和 Tween-80 以 2 比 1 的比例混合，制备刃天青中的工作溶液。

最终浓度为 4 毫克/毫升刃天青和 5% 吐温-80。使用读板器，设置一个程序，在 37 摄氏度下每 30 分钟读取 530 纳米激发和 590 纳米发射 24 小时的荧光。将读板器预热至 37 摄氏度。

使用多通道移液器，将 20 微升刃天青工作溶液加入药物处理板的孔 B 2 至 G 11 中。将板放在读数仪上并启动程序。为了确认将这种感染模型适应 96 孔板格式的稳健性，按照本视频中的描述评估了 MTB 利福平 RIF 在莫西沙星莫西中的敏感性。

如图所示，MTB 巨噬细胞聚集体结构以 96 孔板形式成功生成，从而实现了吞吐量兼容性。为了定量测量刃天青的转化率，作为单个孔细菌生长荧光的指标，对 24 小时进行动力学监测。活的 MTB 细胞的存在是通过蓝色刃天青染料转化为粉红色还原形式来确定的，这由饱和时间点的相对荧光 z 网络定量反映。

这些具有代表性的迷你图显示了 Y 轴上显示的荧光单位与 X 轴上显示的时间。为了生成药物敏感性杀伤曲线，将利福平和莫西沙星处理的孔标准化为无药物对照最大 MTB 生长为 100% 存活率。从每个样品孔中减去背景对照空白信号。

绘制每种单独药物治疗浓度的生存百分比，以生成杀伤曲线。这些数据表明，对于利福平和莫西沙星对源自我们的感染模型的 MTB，最小抑制浓度定义了观察到 90% 生长抑制的抗生素的最低浓度大于 2 微克/毫升。因此，使用我们的感染模型和测定法，这两种药物对 MTB 的最小抑制浓度更能反映这些药物在体内的活性。

观看本视频后，您应该对如何使用刃天青测定法可靠且可重现地生成 MTB 感染的巨噬细胞聚集体结构进行药物敏感性检测有很好的了解。按照此程序，可以轻松地将药物模板从所示的两种药物修改为 58 个药物库面板，以实现高吞吐量药物筛选。