Name: 高通量兼容检测，以评估对巨噬细胞传代药物疗效结核分枝杆菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 了解高通量兼容检测方法，用于评估抗结核药物对Mycobacterium tuberculosis感染巨噬细胞聚集体的疗效。该方法采用96孔板格式和刃天青活力染料，可在BSL-2条件下快速、经济地筛选化合物，提高早期药物开发效率并预测体内疗效。

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感谢 Frank Wolschendorf 博士提供 Cytation 3 全自动成像酶标仪的使用权限。本工作部分由 NIH 资助项目 R01-AI104499（资助对象：OK）提供经费支持。部分实验在 UAB CFAR 设施以及 UAB CFAR 流式细胞术核心实验室/联合 UAB 流式细胞术核心实验室完成，这些设施由 NIH/NIAID P30 AI027767 和 NIH 5P30 AR048311 项目资助。

注意：由于M. tuberculosis mc26206 是一种无毒力菌株17,18，本方案中的所有操作均可在生物安全二级实验室（BSL-2）中进行。
1. 表达绿色荧光蛋白的M. tuberculosis mc26206（Mtb-GFP）培养条件
注意： M. tuberculosis H37Rv衍生的营养缺陷型菌株mc26206 (ΔpanCD，ΔleuCD 转化了的 gfp 表达质粒pMN437在本方案中全程使用16可以替换 Mtb-GFP 菌株，具有非-gfp 表达野生型菌株，以便研究人员更便捷地获取该菌株。然而 gfp 表达是可取的，以实现对吞噬作用及吞噬体形成的直观确认 Mtb/巨噬细胞聚集体。用于长期储存时， Mtb-GFP 样品在添加了20%甘油的完全7H9培养基（见步骤1.1）中于-80 °C冷冻保存。
<ol>
	<li>通过在7H9培养基中添加10% Middlebrook OADC、0.02% tyloxapol、24 µg/mL D-泛酸、50 µg/mL L-亮氨酸和50 µg/mL潮霉素B，制备完全的Mtb-GFP培养基（7H9-C）。</li>
	<li>解冻一管Mtb-GFP，加入到30 mL方形底PETG锥形瓶中的10 mL 7H9-C培养基中。</li>
	<li>在37 °C条件下，于旋转摇床（50 rpm）中培养。每隔几天测定一次光密度（OD600），直至OD600达到1.0（约需5–8天）。</li>
	<li>根据需要稀释并传代培养，以维持OD600在0.2–1.0之间。</li>
	<li>用于感染时，应使用处于对数生长期的稳定Mtb-GFP培养物（OD600为0.6–1）。为避免菌体聚集，每周在水浴中超声处理Mtb培养瓶一次或两次（130 W；每次3次，每次5秒脉冲）。</li>
</ol>
2. 培养条件 THP-1 细胞
<ol>
	<li>通过在RPMI 1640培养基中添加10%热灭活胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和10 mM HEPES，制备完全THP-1细胞培养基（RPMI-C）。</li>
	<li>将细胞置于T-75培养瓶中，在37 °C、含5% CO2的湿润环境中孵育。</li>
	<li>每隔一天使用血细胞计数板或流式细胞术对细胞进行计数，并将THP-1细胞密度维持在每毫升0.1至0.6 × 10⁶个细胞之间。</li>
</ol>
3. 用于生成的感染方案 Mtb巨噬细胞聚集结构
<ol>
	<li>THP-1 细胞准备（每块 96 孔板）
	<ol>
		<li>将 7 × 106 个 THP-1 细胞在 250 × g 条件下离心 5 分钟，用 7 mL RPMI-C 重悬细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mtb-GFP 的制备
	<ol>
		<li>使用摇摆转子离心机，在 3,200 × g 条件下离心 2.8 × 108 个 Mtb-GFP 细菌 5 分钟，换算关系为 OD600 1.0 = 3 × 108 细菌/mL。</li>
		<li>用 RPMI-C 洗涤一次，并按照步骤 3.2.1 的条件离心。</li>
		<li>用 7 mL RPMI-C 重悬，涡旋振荡 10 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染 
	注：参见 图 1 中的模板。
	<ol>
		<li>在 96 孔板的 A 和 H 行以及第 1 和第 12 列中各加入 200 µL 无菌水，形成水封边缘，以防止培养基蒸发。</li>
		<li>在第 2 列（B2 至 G2）中加入 200 µL RPMI-C，作为背景对照（空白）。</li>
		<li>将 Mtb-GFP 悬液（步骤 3.2）加入 THP-1 细胞悬液（步骤 3.1）中，通过移液充分混匀。最终 THP-1 细胞密度为每毫升 5 × 105 个，相应的感染复数为 40。</li>
		<li>将 THP-1/Mtb-GFP 混合悬液倒入一个 25 mL 的储液槽中。</li>
		<li>使用多通道移液器向其余所有 96 孔（B3 至 G11）中各加入 200 µL THP-1/Mtb-GFP 悬液。 
		注：若同时处理多块 96 孔板，应定期重新混匀储液槽中剩余的 THP-1/Mtb 悬液，以确保每孔加入的混合物均匀一致。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO2 条件下培养 7–10 天。</li>
		<li>每 2 天更换一次培养基：使用多通道移液器缓慢吸去每孔上层 100 µL 废培养基，再轻柔加入 100 µL 预热的 RPMI-C。切勿重悬孔内细胞，以免扰动孔底的 Mtb/巨噬细胞聚集体。</li>
		<li>每天使用荧光显微镜（4–10× 物镜）观察各孔，记录 Mtb/巨噬细胞聚集体的大小。至第 7–10 天时，Mtb/巨噬细胞聚集体应已足够大（可参考 图 2），可进入药物疗效检测阶段（第 4 节）。</li>
		<li>如需要，可使用配备明场和 GFP 滤光片组的自动细胞成像系统拍摄 96 孔板图像，以记录 Mtb/巨噬细胞聚集体的形成过程。 
		注：若无自动成像系统，也可使用具备 GFP 和明场成像功能的任意合适显微镜拍摄代表性孔位的图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 评估药物抗肿瘤功效的生长抑制实验 Mtb 源自 Mtb巨噬细胞聚集
<ol>
	<li>药物制备（两种药物，每种三个重复条件） 
	注：参见 图1A 模板。
	<ol>
		<li>在另一个96孔板中，向B2至G10孔各加入125 µL 7H9-C培养基。</li>
		<li>将两种药物分别用1 mL 7H9-C培养基配制成目标最高终浓度的两倍浓度，以补偿步骤4.2.4中的稀释效应。</li>
		<li>使用多通道移液器，将每种药物各250 µL分别加入B11-C11-D11和E11-F11-G11孔，用于三个重复处理。</li>
		<li>使用多通道移液器，通过将125 µL液体从B11-G11孔转移至B10-G10孔，进行两倍梯度稀释。每步用移液器吹打混匀5次。</li>
		<li>继续以125 µL为单位，从右至左逐列转移，直至第4列停止。</li>
		<li>混合第4列后，弃去125 µL至废液容器中。第2列和第3列不应含有任何药物，作为背景对照（空白）和阳性生长对照。 
		注：也可参照 图1B 模板进行药物文库筛选。每块96孔板可容纳58种药物的单浓度测试。由于该药物板将在步骤4.2.4中被稀释一半，因此应以目标终浓度的两倍浓度进行配制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>药物处理：
	<ol>
		<li>取出含有结核分枝杆菌（Mtb）感染的巨噬细胞（Mtb/巨噬细胞聚集体）的96孔板。</li>
		<li>使用多通道移液器小心吸弃所有相关孔（B2至G11）中的液体。分两步进行：首先不倾斜平板吸出150 µL，然后倾斜平板并将移液枪头插入孔底边缘，吸出剩余液体（约50 µL）。由于Mtb/巨噬细胞聚集体贴附于孔底，不应造成样本损失。</li>
		<li>向含有Mtb/巨噬细胞聚集体的96孔板的所有相关孔（B2至G11）中轻柔加入100 µL 7H9-C培养基。</li>
		<li>使用多通道移液器，从含药96孔板（步骤4.1）中吸取100 µL药物溶液，加入感染板的对应孔中。</li>
		<li>将板放入密封袋中，在37 °C条件下孵育3天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用刃天青微孔板法量化药物疗效
<ol>
	<li>用 H2O 配制终浓度为 0.8 mg/mL 的刃天青储备液。使用孔径为 0.22 µm 的 PVDF 膜过滤除菌。</li>
	<li>按 2:1:1 的比例混合刃天青储备液、H2O 和吐温-80（20% 的 H2O 溶液），配制刃天青工作液。终浓度为 0.4 mg/mL 刃天青和 5% 吐温-80。</li>
	<li>使用酶标仪设置程序，在 37 °C 下每 30 分钟读取一次荧光值，激发波长为 530 nm，发射波长为 590 nm，持续 24 小时。提前将酶标仪预热至 37 °C。</li>
	<li>使用多通道移液器向药物处理板（步骤 4.11）的所有相关孔（B2 至 G11）中加入 20 µL 刃天青工作液。</li>
	<li>将板放入酶标仪中，并启动步骤 5.3 中设置的程序。 
	注意：为便于高通量检测板的处理，也可将检测板置于 37 °C 培养箱中孵育，并每隔 24 小时进行一次单次荧光读数。此方法同样适用于不具备具有动力学和孵育功能酶标仪的用户。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在此，我们详细描述了一种替代方法 Mtb 适用于药物疗效测试的感染模型。该模型在早期结核病药物研发过程中考虑了两个应给予更多重视的关键因素：药物渗透的生理相关屏障的存在，以及代谢变化 Mtb 在感染过程中。我们此前已证实了该感染模型的优势，并提出了将其扩大规模以适应高通量需求的可能性16，这里我们通过将系统直接适配到96孔板格式，证明了这一点确实可以实现。该方法能够生成 Mtb/巨噬细胞聚集体直接在96孔板中培养具有优势，因为它避免了将聚集体从大培养瓶通过移液分配至各个孔中的步骤，而这一操作本身存在困难，因为聚集体的尺寸可能达到较大程度 &#62;500 µm。感染的巨噬细胞聚集体体积较大，会阻碍通量检测中必需的P200多通道移液器的使用，因为这可能导致吸头堵塞，或反复移液会破坏聚集体结构。将该感染系统改良至96孔板可减少操作步骤，生成均匀且含有相似数量细胞的孔板 Mtb/巨噬细胞聚集体。因此，该检测系统不仅在早期研发过程中用于预测候选先导化合物的疗效方面具有重要价值 体内，但在药物文库的高通量筛选中...

尽管抗结核化疗方案已问世40多年，结核病（TB）仍然是一个严重的全球健康威胁1。部分原因在于需要使用多种药物联合治疗，疗程长达6个月以上，导致患者依从性差2。近年来耐药结核病的出现进一步加剧了这一问题，而在该领域中，成功研发并获得临床批准的新药几乎为空白3。事实上，尽管已广泛开展抗结核药物的研发，但在过去40年中，仅有单一药物获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床4。因此，迫切需要新一代抗结核药物来应对这一挑战。
结核病药物发现中的一个关键问题是从具有抗菌活性的化合物到成功临床应用的转化不足 体外 从活性到临床疗效5,6,7最初，采用基于靶点的方法来筛选抗Mtb 药物5，未能成功翻译成完整的细菌细胞。即使在 Mtb 使用细胞时，通常采用液体培养物进行实验，但这种方法无法准确预测药物疗效 体内8,9这些问题已被认识到，并已针对含有巨噬细胞的药物筛选实验开展研究 Mtb 或潜伏的 Mtb 已成功建立8,10,11,12然而，即使是这些更为先进的检测方法，也未能充分考虑药物在无血管化的肺部病灶以及感染部位坏死灶中所遇到的渗透屏障。事实上，即便是作为一线抗结核药物的利福平，其给药剂量是否足够也因药物分布不足而受到质疑 体内 组织和脑脊液（CSF）渗透13,14,15 以及对细胞内病原体的杀灭效果降低 Mtb8,9因此，在早期先导化合物开发过程中若能考虑这些参数，新的模型和检测方法无疑将提升结核病药物发现的效率。
为满足这一需求，我们近期建立了一种低成本、快速且符合生物安全二级（BSL-2）标准的结核分枝杆菌（Mtb）药物疗效检测替代感染模型16。该感染模型可在大型巨噬细胞聚集结构内形成高密度的Mtb，重现了具有生理相关性的细胞渗透屏障，并产生了生理状态发生改变的巨噬细胞传代Mtb，其特征类似于潜伏状态的Mtb。从该感染模型中获得的Mtb与刃天青微孔板法（resazurin microtiter assay, REMA）结合用于评估药物疗效，所得结果与其他胞内感染模型一致，并且与常用抗结核药物在脑脊液中相对于血清浓度的渗透能力报道高度相关16。
本文详细描述了Mtb/巨噬细胞聚集体结构的构建方法，以获得适用于通过REMA进行药物敏感性测试的巨噬细胞传代Mtb。特别是，我们展示了如何将该感染系统调整为96孔板格式，以适用于抗结核候选药物的高通量筛选。

<table><tbody><tr><td>7H9</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>遵循制造商的建议</td></tr><tr><td>Middlebrook OADC</td><td>BD 生物科学</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tyloxapol</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td>配制20%的H储备液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；滤膜除菌</td></tr><tr><td>D-泛酸半钙盐</td><td>Sigma</td><td>P5710</td><td>制备 24 mg/mL 储存液于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；滤膜除菌</td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>MP Biomedicals</td><td>194694</td><td>配制50 mg/mL的储存液于H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；经滤膜除菌</td></tr><tr><td>潮霉素B</td><td>EMD Millipore</td><td>400051</td><td>配制 200 mg/mL 储存液于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Nalgene 方形 PETG 培养基瓶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>2019-0030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Corning</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 酶标仪</td><td>Biotek</td><td></td><td>可与任何荧光酶标仪和显微镜互换使用</td></tr><tr><td>Gen5 软件</td><td>Biotek</td><td></td><td>记录与分析刃天青的转化</td></tr><tr><td>利福平&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2679250</td><td>配制 10 mg/mL 储存液于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>盐酸莫西沙星</td><td>Acros Organics</td><td>457960010</td><td>在 H 中配制 10 mg/mL 储存液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>刃天青钠盐</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td>准备 800 &amp;mu;g/mL 储存液于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；滤膜除菌</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164500</td><td>配制20%的H储备液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；经滤膜除菌</td></tr></tbody></table>

一种适用于高通量筛选的药物疗效评估方法，用于检测药物对巨噬细胞传代后病原体的有效性 结核分枝杆菌

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

抗结核药物的早期药物开发过程因化合物转化效率低下而受到阻碍 体外 从活性到临床效果的转化。这可能是由于未充分考虑感染宿主体内存在的生理相关细胞穿透屏障。我们近期建立了一种替代性感染模型，可形成包含紧密堆积的大型巨噬细胞聚集体结构 M. tuberculosis (Mtb其核心适用于药物敏感性测试。该感染模型成本低、速度快，且最重要的是符合生物安全二级（BSL-2）标准。本文描述了构建该模型的实验操作步骤 Mtb/巨噬细胞聚集结构，可产生经巨噬细胞传代的 Mtb 用于药物敏感性测试。特别是，我们展示了该感染系统可直接适配于96孔板格式，具备高通量能力，可用于化合物库的筛选 Mtb总体而言，该检测方法是对现有可用方法的重要补充 Mtb 因其简便性、成本效益和可扩展性，已成为药物发现工具箱中的重要组成部分。

为了验证将该感染模型适配于96孔板格式的稳健性，我们在此根据图1A提供的模板，检测了来源于96孔板适配感染模型的Mtb对利福平（RIF）和莫西沙星（MOXI）的药物敏感性。我们证明，该检测所依赖的Mtb/巨噬细胞聚集体结构可在96孔板格式中稳定生成（图2），从而实现高通量兼容性（图1B）。以此方式经巨噬细胞传代获得的Mtb可直接用于药物疗效检测，方法为成熟的刃天青微孔板检测法（图3）。
由于刃天青检测依赖于代谢活跃的结核分枝杆菌（Mtb）产生的氧化性物质，将蓝色的刃天青转化为荧光粉红色的试卤灵，因此颜色和荧光的变化可作为替代指标，用于判断细菌的生长量。在图3A中，我们显示刃天青检测具有足够的灵敏度，仅需3天培养即可...

开发能够改进下一代抗结核药物早期药物研发流程的新模型和新检测方法具有重要意义。本文介绍了一种快速、经济且符合生物安全二级（BSL-2）标准的检测方法，可用于评估药物对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的疗效，并可轻松适用于高通量筛选。

抗结核药物早期研发过程受到体外活性化合物向体内转化效率低下的阻碍。

本实验的总体目标是，在96孔板中以可重复的方式生成结核分枝杆菌感染的巨噬细胞聚集体结构，并利用活性染料进行药物敏感性测试。该方法可改善抗结核化合物的早期药物研发流程，克服候选化合物在向临床转化过程中效率低下的问题。这种简单、低成本且符合生物安全二级（BSL-2）要求的感染模型的主要优势在于，能够重现生理相关的细胞渗透屏障，类似于结核病肉芽肿的微环境。这能够获得更能预测体内疗效的药物敏感性结果。开始本实验前，需准备表达绿色荧光蛋白的结核分枝杆菌MC² 6206（以下简称MTBGFP），用于感染实验。请注意，该菌株为无毒力菌株，因此本方案中描述的所有操作均可在生物安全二级实验室中进行。每设置一块96孔板，需将2.8 × 10⁸ MTBGFP在水平转子离心机中以3,200 × g离心5分钟。离心后，吸去上清液，并加入5毫升RPMIC洗涤细菌。用移液器反复吹打以重悬细胞。然后再次离心。第二次离心后，弃去上清液，并将菌体细胞重悬于7毫升RPMIC中，涡旋振荡10秒。接下来，针对每块待准备的96孔板，将7 × 10⁶个THP1人单核细胞在250 × G下离心5分钟。离心后，倒掉上清液，并将THP1细胞重悬于7 mL RPMIC中。接下来，通过在A行和H行以及第1列和第12列的孔中加入200 µL无菌水，为感染实验准备一块96孔板。此水层可防止培养基蒸发。向第二列B2至G2中加入200微升RPMIC，作为背景对照或空白对照。为感染THP1单核细胞，使用移液器将全部制备好的MTB-GFP菌液转移至THP1细胞悬液中，并通过上下吹打混匀。最终THP1细胞密度为每毫升5 × 10⁵，相应的感染复数（MOI）为40。接下来，将 THP1 MTBGFP 悬液倒入一个 25 毫升的储液槽中，然后使用多通道移液器，向其余 96 个孔（E3 至 G11）中每个孔加入 200 微升 THP1 MTBGFP 悬液。将培养板置于 37 摄氏度、5%CO2 条件下孵育 7 至 10 天。在整个孵育期间，每隔两天使用多通道移液器更换培养基：缓慢从每个孔的上层移除 100 微升废培养基，并轻柔加入 100 微升预热的 RPMIC 培养基。更换培养基时，需注意避免扰动培养板底部的结核分枝杆菌-巨噬细胞聚集体。每天使用配备明场和GFP滤光片组、放大倍数为4至10倍物镜的荧光显微镜观察各孔，记录结核分枝杆菌-巨噬细胞聚集体的大小，并可根据需要采集图像。到第7至10天时，结核分枝杆菌-巨噬细胞聚集体应已足够大，可进行药物疗效检测，具体操作如视频后续部分所述。进行药物检测时，需在新的96孔板中以三复孔形式准备两种抗结核药物，步骤如下：首先，在B2至G10孔中各加入125 µL的7H9C培养基。接下来，在1毫升7H9C培养基中配制两种药物，使其浓度为所需最高终浓度的两倍。使用移液器将每种药物各250微升分别加入

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高通量兼容检测，以评估对巨噬细胞传代药物疗效<em&gt;结核分枝杆菌</em

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了解高通量兼容检测方法，用于评估抗结核药物对Mycobacterium tuberculosis感染巨噬细胞聚集体的疗效。该方法采用96孔板格式和刃天青活力染料，可在BSL-2条件下快速、经济地筛选化合物，提高早期药物开发效率并预测体内疗效。

一种适用于高通量筛选的药物疗效评估方法，用于检测药物对巨噬细胞传代后病原体的有效性结核分枝杆菌

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