斑马鱼原位杂交染色的基因分型与定量

突变对基因表达的影响往往通过原位杂交进行定性评估，一般在视觉上得分，这是主观的，并且有研究者的期望。此方法提供了一种更一致的方式来比较原位实验，通过量化图像强度并消除这种偏差。这也可以很容易地适应其他模型系统，使用原位杂交作为基因表达的读者。

首先成像原位杂交或ISH染色胚胎。准备甘油溶液并混合以均质化。用三毫升巴斯德移液器将胚胎转移到甘油溶液中，让它们沉淀至少五分钟。

准备并标记足够的PCR管，在成像后转移ISH染色的胚胎，然后使用三毫升巴斯德移液器将100%甘油添加到玻璃凹陷滑梯底部。将单个 ISH 染色胚胎转移到玻璃幻灯片中，并在配备数码相机、底部和顶部照明的立体显微镜下将其定向。使用第一个胚胎，在所需的放大倍率下调整照明和曝光时间。

根据要求成像尽可能多的胚胎，并给每个图像贴上唯一编号的标签。成像后，将每个胚胎转移到标有相同编号的PCR管中，如果需要，从PCR管中吸入多余的甘油。要提取DNA，请向每个管中加入40至75微升碱性解液缓冲液，如HoTSHOT。

在95摄氏度下孵育管子约30分钟，然后冷却至4摄氏度。添加等量的中和缓冲液，然后继续对感兴趣的突变进行基因分型。若要执行图像分析，请在斐济中选择并打开图像，然后通过单击"编辑"然后反转来反转图像，然后通过单击"图像"选项卡、选择"类型"和"选择 8 位"将图像类型转换为 8 位。

选择多边形工具，并在包含要测量的 ISH 信号的区域周围图像上手动绘制感兴趣区域或 ROI。按 T 打开 ROI 管理器并选择感兴趣的区域，然后单击"度量值"。将平均值从"结果"窗口复制到电子表格。

要测量背景强度，请将 ROI 移动到胚胎中无污渍区域，然后单击"添加 ROI 管理器"。选择背景区域并单击"测量"，然后在电子表格中记录平均强度值。通过从染色区域中减去背景的均值强度，获得 NC2 杂交信号的均像素强度。

确定每个样本的均像素强度后，为每个样本分配一个基因型。如果无法确定基因型，请从后续分析中排除样本。根据基因型对平均样品强度值进行排序，然后进行统计测试。

该技术的实用性在 dnmt3bb 的 ISH 上得到了证明。1 在胚胎从运行 1 异质交叉。dnmt3bb 的减少。

在 Runx1 同源突变体中检测到 1 个表达，而异质胚胎在 dnmt3bb 中无显著差异。1 表达式。在试图确定lmo4突变对 Runx1 表达的影响时，本分析没有显示野生类型和同源 lmo4 突变体在表达上存在显著差异。

然而，单个胚胎 qPCR 检测到 runx1 表达的少量减少。在大约 0.4% 的 runx1 探探胚胎中，ISH 具有高背景，当从信号中减去时，它会导致负数。在这种情况下，胚胎被排除在分析之外。

胚胎上的四个不同区域已经过测试，以优化背景校正。虽然任何背景区域的 ROI 强度差异都相对稳定，但 R3 始终表现出高于 ROI 的强度，不应用于背景校正。R1 和 R4 被证明是最合适的背景校正区域。

找到成像的最佳条件并在整个实验中保持不变非常重要。我们还建议在为每个样本分配基因型之前量化像素强度。