斑马鱼原位杂交染色的基因分型与定量分析

突变对基因表达的影响通常通过原位杂交进行定性评估，并主要依赖视觉评分，这种方法具有主观性，且易受研究人员预期的干扰。本方法通过量化图像强度，为比较原位杂交实验提供了更为一致的手段，从而消除了这种偏差。此外，该方法也可轻松适用于其他将原位杂交作为基因表达检测手段的模式系统。

首先对原位杂交（ISH）染色的胚胎进行成像。配制甘油溶液并混匀。用3毫升巴斯德移液管将胚胎转移至甘油溶液中，静置至少5分钟。

准备并标记足够数量的PCR管，用于成像后转移原位杂交染色的胚胎，然后使用3毫升巴斯德吸管向玻璃凹孔载玻片的孔底加入100%甘油。将一个原位杂交染色的胚胎转移至玻璃载片上，并在配备数码相机及透射光和反射光照明的体视显微镜下调整其方向。使用第一个胚胎，在所需放大倍数下调节光照强度和曝光时间。

根据需要对尽可能多的胚胎进行成像，并为每张图像标注唯一的编号。成像后，将每个胚胎转移至带有相同编号的PCR管中，如有需要，吸除PCR管中多余的甘油。为提取DNA，向每个PCR管中加入40至75微升碱性裂解缓冲液（例如HoTSHOT）。

将试管在 95 摄氏度下孵育约 30 分钟，然后冷却至 4 摄氏度。加入等体积的中和缓冲液，并继续对目标突变进行基因分型。进行图像分析时，在 Fiji 中选择并打开图像，通过点击“Edit”然后选择“Invert”来反转图像，再通过点击“Image”选项卡，选择“Type”，然后选择“8-bit”，将图像类型转换为 8 位。

选择多边形工具，并在图像上围绕需要测量的原位杂交信号区域手动绘制感兴趣区域（ROI）。按 T 键打开 ROI 管理器，选择感兴趣区域，然后单击“测量”。从“结果”窗口复制平均值并粘贴到电子表格中。

为测量背景强度，将 ROI 移动至胚胎中无染色的区域，然后在 ROI 管理器中点击“添加”。选中背景区域并点击“测量”，随后在电子表格中记录平均强度值。通过从染色区域的平均强度中减去背景的平均强度，获得 NC2 杂交信号的平均像素强度。

在确定每个样本的平均像素强度后，为每个样本分配基因型。如果无法确定基因型，则将该样本从后续分析中排除。根据基因型对样本的平均强度值进行排序，并进行统计学检验。

该技术在 runx1 杂合子互交胚胎中 dnmt3bb.1 的原位杂交（ISH）中已显示出其实用性。dnmt3bb.

在 runx1 纯合突变体中检测到 dnmt3bb.1 的表达，而杂合胚胎在 dnmt3bb.1 表达上未显示出显著差异。在尝试确定 lmo4 突变对 runx1 表达的影响时，该分析未显示野生型与 lmo4 纯合突变体之间在表达上存在显著差异。

然而，通过单胚胎 qPCR 检测到 runx1 表达量略有下降。在约 0.4% 的 runx1 探针胚胎中，原位杂交（ISH）背景值较高，导致信号值减去背景后为负数。此类情况下，这些胚胎被排除在分析之外。

已对胚胎上的四个不同区域进行测试，以优化背景校正。尽管在任何背景区域中，ROI的强度差异相对稳定，但R3的强度始终高于ROI，因此不应用于背景校正。R1和R4被证明是进行背景校正最合适的区域。

找到成像的最佳条件并在整个实验过程中保持这些条件不变非常重要。我们还建议在为每个样本指定基因型之前，先对像素强度进行定量分析。