斑马鱼原位杂交染色的基因分型与定量
2020年1月28日
基因编辑技术使研究人员能够相对轻松地生成斑马鱼突变体来研究基因功能。在这里，我们提供了一个指南，以执行平行胚胎基因分型和定量的原位杂交信号在斑马鱼。这种无偏的方法在基于原位杂交的表型分析中提供了更高的精度。
突变对基因表达的影响往往通过原位杂交进行定性评估，一般在视觉上得分，这是主观的，并且有研究者的期望。此方法提供了一种更一致的方式来比较原位实验，通过量化图像强度并消除这种偏差。这也可以很容易地适应其他模型系统，使用原位杂交作为基因表达的读者。
首先成像原位杂交或ISH染色胚胎。准备甘油溶液并混合以均质化。用三毫升巴斯德移液器将胚胎转移到甘油溶液中，让它们沉淀至少五分钟。
准备并标记足够的PCR管，在成像后转移ISH染色的胚胎，然后使用三毫升巴斯德移液器将100%甘油添加到玻璃凹陷滑梯底部。将单个 ISH 染色胚胎转移到玻璃幻灯片中，并在配备数码相机、底部和顶部照明的立体显微镜下将其定向。使用第一个胚胎，在所需的放大倍率下调整照明和曝光时间。
根据要求成像尽可能多的胚胎，并给每个图像贴上唯一编号的标签。成像后，将每个胚胎转移到标有相同编号的PCR管中，如果需要，从PCR管中吸入多余的甘油。要提取DNA，请向每个管中加入40至75微升碱性解液缓冲液，如HoTSHOT。
在95摄氏度下孵育管子约30分钟，然后冷却至4摄氏度。添加等量的中和缓冲液，然后继续对感兴趣的突变进行基因分型。若要执行图像分析，请在斐济中选择并打开图像，然后通过单击"编辑"然后反转来反转图像，然后通过单击"图像"选项卡、选择"类型"和"选择 8 位"将图像类型转换为 8 位。
选择多边形工具，并在包含要测量的 ISH 信号的区域周围图像上手动绘制感兴趣区域或 ROI。按 T 打开 ROI 管理器并选择感兴趣的区域，然后单击"度量值"。将平均值从"结果"窗口复制到电子表格。
要测量背景强度，请将 ROI 移动到胚胎中无污渍区域，然后单击"添加 ROI 管理器"。选择背景区域并单击"测量"，然后在电子表格中记录平均强度值。通过从染色区域中减去背景的均值强度，获得 NC2 杂交信号的均像素强度。
确定每个样本的均像素强度后，为每个样本分配一个基因型。如果无法确定基因型，请从后续分析中排除样本。根据基因型对平均样品强度值进行排序，然后进行统计测试。
该技术的实用性在 dnmt3bb 的 ISH 上得到了证明。1 在胚胎从运行 1 异质交叉。dnmt3bb 的减少。
在 Runx1 同源突变体中检测到 1 个表达，而异质胚胎在 dnmt3bb 中无显著差异。1 表达式。在试图确定lmo4突变对 Runx1 表达的影响时，本分析没有显示野生类型和同源 lmo4 突变体在表达上存在显著差异。
然而，单个胚胎 qPCR 检测到 runx1 表达的少量减少。在大约 0.4% 的 runx1 探探胚胎中，ISH 具有高背景，当从信号中减去时，它会导致负数。在这种情况下，胚胎被排除在分析之外。
胚胎上的四个不同区域已经过测试，以优化背景校正。虽然任何背景区域的 ROI 强度差异都相对稳定，但 R3 始终表现出高于 ROI 的强度，不应用于背景校正。R1 和 R4 被证明是最合适的背景校正区域。
找到成像的最佳条件并在整个实验中保持不变非常重要。我们还建议在为每个样本分配基因型之前量化像素强度。
概述
本文介绍了一种用于斑马鱼胚胎并行基因分型和定量原位杂交信号的方法。通过利用这种无偏性方法，研究人员可以在表型分析中获得更高的准确性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 发育生物学
背景
- 基因编辑技术促进了斑马鱼突变体的产生。
- 原位杂交是评估基因表达的常用方法。
- 传统评分方法可能会引入偏见和主观性。
- 本研究旨在提供一种更一致和定量的方法。
研究目的
- 提高斑马鱼表型分析的准确性。
- 提供一种标准化的胚胎基因分型方法。
- 客观地定量原位杂交信号。
使用的方法
- 使用立体显微镜对ISH染色胚胎进行成像。
- 准备甘油溶液以便胚胎转移。
- 使用碱性裂解缓冲液进行DNA提取。
- 使用Fiji软件进行图像分析和定量。
主要结果
- 在runx1纯合突变体中显示dnmt3bb.1表达降低。
- 确定了图像分析的适当背景校正区域。
- 显示野生型和lmo4纯合突变体之间的表达没有显著差异。
- 提供了一种基于像素强度分配基因型的可靠方法。
结论
- 该方法提高了基因表达分析的可靠性。
- 它可以适用于其他模式系统。
- 保持一致的成像条件对准确结果至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ hybridization analysis reduces subjectivity in gene expression assessment, improving data reliability for target validation in zebrafish models. This approach supports mechanistic de-risking by enabling unbiased correlation of genotype with phenotypic expression patterns. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing standardized, replicable measurements across mixed-genotype samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through unbiased quantification of spatially restricted gene expression signals.
- Operational Value: Provides a consistent workflow for comparing mutant and wild-type phenotypes without observer bias.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing significant expression changes from background noise in genetic models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline expression profiles.
- Reproducibility: Standardizes image acquisition and analysis protocols to minimize inter-experiment variability.
- Quantitative Output: Generates measurable pixel intensity data suitable for statistical comparison across treatment groups.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains consistency from discovery through preclinical validation by using objective phenotypic readouts.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of gene expression changes with genotypic status for translational biomarker development.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement decisions by reducing false positives in target validation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking genotypic confirmation with quantitative phenotypic assessment, supporting lead identification through mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing quantitative mRNA distribution data to clarify gene function in developmental pathways.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible imaging and analysis conditions for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative intensity measurements and background-subtracted values that enable statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by ensuring consistent phenotypic scoring across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping and quantification platform applicable to multiple genes and mutant lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in gene expression data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized embryo handling and image analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective data for capital allocation in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by distinguishing true biological effects from technical variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, microscopy, and basic genotyping techniques.
- Dependent on stereo microscopy with digital imaging capabilities and Fiji software for analysis.
- Necessitates cross-team standardization of imaging conditions, exposure times, and background correction regions.
- Involves adaptation considerations for different zebrafish strains and developmental stages.
- Includes practical limitations such as background correction optimization and exclusion of samples with indeterminate genotypes or high background noise.
