定量检测抗体诱导补体激活的方法对红血细胞

以下实验的总体目标是评估患者血清中针对红细胞或红细胞的抗体的补体激活。这是通过在阻断抗 C 5 抗体存在的情况下将红细胞与患者血清一起孵育以诱导 C 4 和 C3 沉积在红细胞表面来实现的。接下来，用荧光标记的抗 C 4 和抗 C3 抗体对红细胞进行染色，然后可以通过流式细胞术以另一种方法分析红细胞上的补体沉积量。

在不存在抗 C 5 的情况下，将红细胞与患者血清一起孵育，以诱导补体介导的裂解。然后可以通过光谱法测量细胞释放的血红蛋白量来确定裂解红细胞的百分比。与常规诊断中使用的溶血或抗球蛋白测试等现有方法相比，这种新技术的主要优点是它本质上是定量的，我们可以检测补体激活的次优差异。

我们实验室的博士后 Elizabeth Brook 将演示程序首先用 PBS 洗涤零型红细胞 3 次，然后将沉淀在 0.5% Roma 泳道溶液中以 1：2 的比例在 37 摄氏度下孵育 10 分钟，再洗涤细胞 3 次后，将它们作为 3% 溶液储存在 4 摄氏度的新鲜 PBS 中，以通过流式细胞术分析补体在红细胞上的沉积。首先，在热处理血清时，在 56 摄氏度下将所需量的患者血清热灭活 30 分钟。最后一次洗涤后，在 Roal 缓冲液中洗涤 brola 处理的红细胞 3 次。

复苏将沉淀以 0.5% 稀释度悬浮在 vbg plus plus 中。接下来，在玻璃珠中，向 96 孔圆底板的每个孔中加入 25 微升 0.5% 红细胞、37.5 微升新鲜 AB 血清和 37.5 微升 200 微克/毫升，抗 C 5。然后将热灭活的患者血清以适当浓度添加到每个孔中，根据需要补充热灭活的 AB 血清，并包括阴性对照。

使用 VBG plus plus 使每个孔的最终体积为 150 微升，然后将覆盖有 E IA 箔的板在 37 摄氏度下孵育一个半小时到两个小时，孵育后摇动。用补充有 0.5% BSA 的 PBS 洗涤细胞 3 次，然后用每毫升 1 微克标记细胞。荧光标记的抗 C3 和抗 C 四种单克隆抗体在室温下轻轻摇动孵育细胞 30 至 45 分钟，然后在洗涤板 3 次后，将红细胞重悬于 150 微升 PBS 加 0.5% BSA 中。

将细胞悬液转移到新的 96 孔圆底板中，然后将板加载到流式细胞仪上，使用前向散点图将单个细胞与双合体分离。在单个 RBC 上设置门控，然后为荧光信号选择合适的检测通道。使用用于定量溶血分析的中位荧光强度量化结果，加热并激活患者血清并洗涤长叶莴苣处理的红细胞，如刚刚所示。

然后，如刚才所示，将红细胞与补体和患者血清一起孵育，但没有抗 C 5，在 664 GS 下将细胞离心 5 分钟，减少减速。接下来，小心地将 90 微升上清液转移到新的微量滴定板中，注意不要转移完整的细胞并避免产生气泡，然后在分光光度计中测量 4 14 到 6 90 的吸收。溶血占纯水中孵育的红细胞样品裂解的百分比。

在第一个图中，显示了 brola 处理的 RBC 的代表性散点图，显示了适合单个 RBC 的门控。通常，大约 95% 的红细胞位于这个单细胞门内。在这些直方图中，自身免疫性溶血性贫血或 aha 影响的代表性结果。

C 4 和 C3 沉积的患者血清如预期所示，患者血清越多，补体沉积越多。奇怪的是，补体沉积发生在两个不同的正峰中。这可能不是由 RBC 群体的异质性引起的，因为 RBC 来自单个供体，尽管这种现象的原因仍在调查中，但样品的中位荧光强度绘制在这些折线图中，以显示 C 4 和 C3 沉积测定的可重复性。

请注意各种 AH H 患者样本沉积的巨大差异。最后，在这些图表中可以观察到含有红细胞自身抗体的 ahha 患者血清样本的溶血检测数据。用血清样品滴定可产生清晰、可重现的曲线，其中含有合适的补体抑制剂，例如抗 C 5。

溶血信号可以滴定掉，如下图所示。观看本视频后，您应该对如何通过 C3 或 C 4 沉积的流式细胞术分析或定量溶血测定来测量红细胞特异性抗体的补体活化有很好的了解。