Name: 定量检测抗体诱导补体激活的方法对红血细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 学习使用流式细胞术和光谱法定量检测抗体诱导的红细胞补体激活。该方法通过测量C3/C4沉积和血红蛋白释放，为免疫学和血液学研究提供比传统方法更灵敏的定量分析工具。

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SZ 和 DW 收到了 Viropharma 提供的无限制资助。

1. 溴化酶处理红细胞的制备
<ol>
	<li>用1×PBS洗涤O型红细胞3次（664 × g离心2-5分钟）。</li>
	<li>将1体积压积红细胞与两体积0.5%溴酸蛋白酶溶液在37 °C孵育10分钟。</li>
	<li>用1×PBS洗涤细胞3次。</li>
	<li>细胞可在1×PBS中配制成3%的溶液，于4 °C保存至少一周。</li>
</ol>
2. 通过流式细胞术分析红细胞上的C3和C4沉积
<ol>
	<li>将所需量的患者血清（或其他抗红细胞抗体来源）在56 °C下加热30分钟，以进行热灭活。</li>
	<li>用VBG- （5 mM 巴比妥、150 mM NaCl、0.05% 明胶，pH 7.4）将经菠萝蛋白酶处理的红细胞洗涤三次，然后重悬于VBG++（VBG-- + 2 mM MgCl2 + 10 mM CaCl2）中，配制成0.5%的悬液。</li>
	<li>将以下组分加入含玻璃珠（用于充分混匀）的圆底板孔中：25 µl 0.5% 红细胞悬液、37.5 µl 新鲜AB型血清（补体来源）和37.5 µl 200 µg/ml 抗C5抗体。抗C5抗体价格昂贵且可能难以获得，可考虑使用C5-/C6-/C7-或C8-缺陷型血清替代AB型血清与抗C5抗体。</li>
	<li>向每孔加入患者血清，使其终浓度为0.1–33%。根据每孔血清浓度差异，使用热灭活的AB型血清进行校正。加入VBG++使每孔终体积为150 µl。用ELISA封板膜封闭板孔。</li>
	<li>在37 °C下振荡孵育1.5–2小时。</li>
	<li>用含0.5% BSA的PBS洗涤红细胞三次（664 × g离心2分钟）。</li>
	<li>在含0.5% BSA的PBS中加入荧光标记的抗C3和抗C4单克隆抗体或其Fab片段（以减少凝集），终浓度为1 µg/ml。此处使用定制的抗C3-Alexa Fluor 488和抗C4-Alexa Fluor 647单克隆抗体；选择这两种荧光标记可实现通过FACS同时检测C3和C4。</li>
	<li>室温下轻柔振荡孵育30–45分钟。</li>
	<li>用含0.5% BSA的PBS洗涤红细胞三次。</li>
	<li>将红细胞重悬于150 µl含0.5% BSA的PBS中，并转移至新板（FACS分析前去除玻璃珠）。</li>
	<li>进行FACS分析。在FSC-A散点图中区分单细胞与双联体，对单个红细胞设门；选择适当的荧光检测通道（例如 FITC和APC）。</li>
	<li>采用中位荧光强度对结果进行定量分析。</li>
</ol>
注意：可以使用同型对照（isotype control）例如 荧光标记的抗IL6小鼠IgG1）。但是，建议包含一个真正的阴性对照 例如 通过将红细胞与不含患者血清（仅含AB型血清）或不含补体来源（经热灭活的AB型血清和经热灭活的患者血清）的体系共同孵育，随后使用相同的抗C3-Alexa Fluor 488和抗C4-Alexa Fluor 647抗体进行染色。该对照方式相较于同型对照，在红细胞实验中更具有效性12，尽管这些不同的对照通常会得到相同且为阴性的结果。
3. 定量溶血试验
<ol>
	<li>将所需量的患者血清（或其他抗红细胞抗体来源）在56 °C下加热30分钟以进行热灭活。</li>
	<li>用VBG--洗涤红细胞3次，再用VBG++洗涤1次。</li>
	<li>在含玻璃珠（用于充分混匀）的圆底板中加入以下组分：35 µl 3%红细胞悬液、25 µl新鲜AB型血清（补体来源）以及1–50%患者血清。使用热灭活的AB型血清校正血清浓度差异。加入VBG++使每孔终体积为150 µl。用ELISA封板膜密封板孔。</li>
	<li>在37 °C下振荡孵育1.5–2小时。</li>
	<li>以664 × g离心5分钟，减速设置为较低水平（例如，在2–3分钟内缓慢减速至停止）。</li>
	<li>小心吸取90 µl上清液至新的微孔板中。此步骤中应避免产生气泡，并防止吸取到完整的细胞。</li>
	<li>使用合适的分光光度计测定A414/690吸光度。</li>
	<li>以纯水处理的对照红细胞溶血程度为100%，计算各组溶血的百分比。</li>
</ol>

<ol><li>Zeerleder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+haemolytic+anaemia+-+a+practical+guide+to+cope+with+a+diagnostic+and+therapeutic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Neth.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge.</a> Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).</li>
<li>Reardon, J. E., Marques, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+evaluation+and+transfusion+support+of+patients+with+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia.</a> Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).</li>
<li>Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hemolytic+anemia+with+gel-based+immunohematology+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests.</a> Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).</li>
<li>Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr,, R, D., Cohn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direct+antiglobulin+test%3A+A+critical+step+in+the+evaluation+of+hemolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis.</a> Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).</li>
<li>Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+alloimmunization+from+an+African+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Red blood cell alloimmunization from an African perspective.</a> Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).</li>
<li>Packman, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+anemia+due+to+warm+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Hemolytic anemia due to warm autoantibodies.</a> Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).</li>
<li>Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+cold+agglutinin+mediated+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).</li>
<li>Petz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+antibody+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Cold antibody autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).</li>
<li>Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warm+autoimmune+hemolytic+anemia%3A+recent+progress+in+understanding+the+immunobiology+and+the+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).</li>
<li>Endoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+prewarming+conditions+for+Rh+antibody+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing.</a> Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).</li>
<li>Wouters, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1-esterase+inhibitor+concentrate+rescues+erythrocytes+from+complement-mediated+destruction+in+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).</li>
<li>Arndt, P. A., Garratty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Review+of+Published+Methods+for+Analysis+of+Red+Cell+Antigen-Antibody+Reactions+by+Flow+Cytometry%2C+and+Approaches+for+Resolving+Problems+with+Red+Cell+Agglutination%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

上述检测方法具有良好的可重复性和稳健性。操作简便，可同时对多个样本进行检测（如在96孔板中进行）。因此，该方法也适用于全自动系统，例如 ELISA机器人系统。与目前使用的技术相比，这些检测方法是定量的，这将有助于例如补体抑制剂作用效果的研究。此外，结果判读具有客观性，优于目前使用的检测方法。
两种检测均有一个关键步骤。在FACS分析中，重要的是要圈选单个红细胞，因为聚集的红细胞会被计为一个事件，从而导致信号人为升高。通过使用较低的患者血清浓度来预防红细胞聚集效果更佳，因为低浓度仍可产生良好的信号。在溶血检测中，孵育后需小心地将上清液转移至新板中，因为红细胞的残留（以及气泡）会导致信号不可靠。建议在两种检测中均使用O型红细胞，以避免因ABO血型不匹配引发的补体激活而造成混淆。
由于其可靠性和稳健性，这些检测方法适用于研究补体抑制剂对自身免疫性溶血性贫血（AIHA）的疗效，如参考文献所示11，以定量检测补体活化的细微差异。由于其高敏感性，这些检测方法可能在某些患者中检测到常...

针对红细胞（RBCs）的抗体可因输注表达受者红细胞所缺乏抗原的红细胞而被诱导产生。这些同种异体抗体在后续输血过程中可通过激活补体，引发严重的急性溶血性输血反应。5在自身免疫性溶血性贫血（AIHA）中，患者体内存在针对自身红细胞的自身抗体。这会导致红细胞通过脾脏中吞噬细胞上的 Fcγ 受体与结合在红细胞上的 IgG 相互作用而加速清除；或者，当自身抗体能够激活补体时，还可通过肝脏中的补体受体介导清除。6,7补体系统暴发性激活导致的血管内溶血虽罕见但常致命。由同种或自身抗体诱导的补体介导的红细胞加速破坏，可引起急性贫血，进而导致潜在致命的组织缺氧。自身免疫性溶血性贫血（AIHA）中的自身抗体根据其与红细胞结合的最适温度分为温抗体型和冷抗体型（分别为37 °C或更低温度）。温抗体通常为IgG亚型，而冷抗体则通常为IgM亚型。8,9. AIHA 可继发于 例如 淋巴增殖性疾病、结缔组织病、实体瘤、感染或药物均可引起自身免疫性溶血性贫血，但在50%的病例中，该病为特发性9.
通过半定量直接抗球蛋白（Coombs）试验（DAT）检测患者红细胞（RBC）表面结合的γ球蛋白（例如 IgG 或 IgM）及补体成分。在 DAT 中，将患者的红细胞与抗 IgG 或抗 C3d 抗体孵育，若出现红细胞凝集，则表明红细胞表面已结合补体成分或 IgG。通过间接抗球蛋白试验（IAT）检测患者血清中的同种或自身抗体。在 IAT 中，先将经菠萝蛋白酶处理的试剂红细胞与患者血清孵育，洗涤后加入抗人 IgG 抗体。若患者血清中存在针对红细胞的 IgG 抗体并已致敏试剂红细胞，则会发生凝集反应。针对红细胞的 IgM 抗体在将经菠萝蛋白酶处理的试剂红细胞与患者血清孵育时可直接引起凝集。直接 Coombs 试验或 IAT 中的红细胞凝集现象可通过肉眼在试管中观察，也可将样本加样至小型 Sephadex 柱上，利用凝集红细胞与单个红细胞的体积差异进行分离后判读1。
另一种常用于检测红细胞补体激活的技术是溶血试验1，该方法通过评估患者血清诱导木瓜蛋白酶处理的红细胞发生（补体介导的）溶血的能力来实现10。离心后若上清液因释放的血红蛋白而呈红色，则判定为试验阳性；若上清液仍无色，则判定为阴性。抗球蛋白试验和溶血试验均为半定量试验，因为其结果以试验仍呈阳性的最高血清稀释度表示。
抗球蛋白试验和溶血试验是诊断中常规使用的可靠检测方法。由于这些试验为半定量性质，且依赖于操作人员的技术经验，因此不适合用于研究红细胞补体激活的细微差异——而在评估补体抑制剂疗效时恰恰需要这种高灵敏度的检测方法。因此，我们开发了两种定量检测方法，用于测定（自身）抗体介导的红细胞补体激活，本文将对此进行详细描述。
首先，我们建立了一种检测补体C3和C4活化片段在红细胞（RBC）表面沉积的实验方法（图1A）。在该实验中，将经菠萝蛋白酶处理的人O型红细胞与经热灭活的患者血清（抗红细胞抗体来源）、新鲜AB型血清（补体来源）以及抗C5单克隆抗体（依库珠单抗）共同孵育。若患者血清中含有可激活补体的抗红细胞抗体，则在此过程中会发生C3和C4在红细胞上的沉积。为了防止补体级联反应下游活化导致的红细胞裂解，实验中加入了阻断性的抗C5单克隆抗体。随后，通过流式细胞术（FACS）使用荧光标记的抗C3和抗C4单克隆抗体或Fab片段分别检测红细胞表面C3和C4的沉积情况。设门圈选单个红细胞对于确保结果的可靠性至关重要。该技术的优点包括仅需少量患者样本、可评估补体级联反应早期阶段的活化情况，且方法具有良好的重复性和定量性。同时检测C3和C4的另一个优势在于，可根据沉积模式区分经典途径和凝集素途径活化（C3与C4均有沉积）与替代途径活化（仅C3沉积）。使用菠萝蛋白酶处理的红细胞而非未处理的红细胞可提高该实验的灵敏度。
第二种检测基于目前使用的溶血试验（图1B）。将人经菠萝蛋白酶处理的O型红细胞与热灭活的患者血清（抗红细胞抗体来源）以及新鲜的AB型血清（补体来源）共同孵育。如果患者抗红细胞抗体激活了补体，则会发生剂量依赖性的红细胞裂解，导致血红蛋白释放。通过在离心去除完整及碎片化的红细胞后，测定上清液在414 nm处的吸光度，来定量所释放的血红蛋白量。吸光度值与发生的溶血程度呈正相关。与目前使用的检测方法相比，本实验方案可提供客观、可量化的溶血数值，具有高度可重复性，且不依赖于操作人员对结果的主观判读。
已有研究11描述了这些方法的应用，其中探讨了C1抑制剂作为补体抑制剂在自身免疫性溶血性贫血（AIHA）中的潜在用途。

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>B-4287</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>巴比妥</td><td>Fagron</td><td>0261</td><td>该化学品受药品监管限制。</td></tr><tr><td>苯巴比妥钠</td><td>Fagron</td><td>0263</td><td>该化学品受药品监管限制。</td></tr><tr><td>明胶</td><td>Merck</td><td>1.0470.0500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Merck</td><td>1.05833.0250</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Merck</td><td>1.0238.0500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 488 胺反应性染料</td><td>Pierce</td><td>46402</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 650 胺反应性染料</td><td>Pierce</td><td>62265</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;alpha;C5（依库珠单抗）</td><td>Alexion Pharmaceuticals</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FACS（Canto）</td><td>BD</td><td></td><td>任何具备合适激光器的流式细胞仪均可使用。</td></tr><tr><td>分光光度计（例如 Multiskan spectrum）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Labsystems</td><td>1500-193</td><td>任何具备合适波长范围的分光光度计均可使用</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 软件 v 6.1.2</td><td>BD</td><td>643629</td><td>任何兼容的流式细胞分析软件均可使用</td></tr><tr><td>菠萝蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>Sanquin</td><td>K1121</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

红细胞上抗体诱导补体活化的定量检测方法

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

针对红细胞（RBCs）的抗体可导致补体激活，从而通过肝脏中的补体受体加速清除红细胞（血管外溶血），或导致红细胞发生血管内溶解。同种抗体（例如 ABO 血型不合或红细胞抗原的自身抗体（如在自身免疫性溶血性贫血，AIHA 中所见）可导致补体激活，具有潜在危害性，尤其当引起血管内溶血时，可能致命1目前，红细胞上（自身）抗体引起的补体活化情况的评估 体外 通过使用反映补体在红细胞上沉积的Coombs试验，或反映红细胞裂解的非定量溶血试验1-4然而，为了评估补体抑制剂的疗效，必须具备定量检测技术。本文介绍了两种此类技术。首先，介绍一种检测患者血清中抗体诱导的红细胞表面C3和C4沉积的实验方法。该方法采用流式细胞术（FACS），使用荧光标记的抗C3或抗C4抗体进行检测。其次，描述一种定量溶血试验。该实验通过分光光度法测定患者血清诱导的补体介导溶血程度&#160;检测释放的血红蛋白。这两种检测方法均具有高度可重复性和定量性，有助于开展抗体诱导补体激活的相关研究。

图2A 显示了红细胞的代表性散点图。在FSC-W与FSC-A图中可见针对单个红细胞的合适设门（P1）。通常约95%的红细胞位于该P1门内（单细胞），但当使用较高比例的患者血清时，这一比例可能下降至70-80%，尤其是当患者血清中存在抗红细胞IgM时。
AIHA患者血清对C4沉积影响的代表性结果见图2B，对C3沉积的影响见图2C。从这些图中可以看出，患者血清量越多，补体沉积越多，这符合预期。值得注意的是，补体沉积呈现出两个明显分离的阳性峰。这种现象可能并非由红细胞群体的异质性引起，因为红细胞来自单一供体。我们仍在探究这一现象的原因。图2D和图2E展示了C4（图2D）和C3（图2E）沉积实验的可重复性，同时也显示了不同AIHA患者样本在补体沉积能力方面存在广泛差异。
在图3A</stron...

本文介绍了两种用于检测抗红细胞抗体诱导补体活化的检测方法。与现有检测方法相比，其主要优势在于具有定量性且结果易于解读。

针对红细胞（RBCs）的抗体可导致补体激活，进而通过肝脏中的补体受体加速清除

以下实验的总体目标是评估患者血清中针对红细胞（RBC）的抗体所介导的补体激活。该过程通过在存在阻断性抗C5抗体的条件下，将红细胞与患者血清共同孵育，从而诱导C4和C3在红细胞表面的沉积。随后，使用荧光标记的抗C4和抗C3抗体对红细胞进行染色，并可通过流式细胞术分析红细胞表面补体沉积的量，这是一种替代性检测方法。将红细胞与患者血清在无抗C5的条件下孵育，以诱导补体介导的溶血。随后可通过分光光度法测定细胞释放的血红蛋白量，从而确定溶血红细胞的百分比。与常规诊断中使用的溶血试验或抗球蛋白试验等现有方法相比，该新技术的主要优势在于其具有定量性质，能够检测补体激活的亚优化差异。本实验室的博士后Elizabeth Brook将演示以下实验步骤：首先，用PBS洗涤零型红细胞三次，然后按1:2的比例将细胞沉淀重悬于0.5%罗麻兰（Roma lane）溶液中，在37摄氏度孵育10分钟。再用PBS洗涤细胞三次后，将细胞以3%的浓度悬浮于新鲜PBS中，并在4摄氏度保存。为通过流式细胞术分析红细胞（RBCs）上的补体沉积，首先将所需量的患者血清在56摄氏度加热灭活30分钟。在血清进行热处理的同时，用罗艾尔（Roal）缓冲液洗涤经罗麻兰处理的红细胞三次，最后一次洗涤完成后即可进行后续实验。将沉淀重悬于VBG Plus Plus中，稀释至0.5%。接下来，在玻璃珠中加入25微升0.5%红细胞、37.5微升新鲜AB血清以及37.5微升浓度为200微克/毫升的抗C5，分别加入96孔圆底板的每个孔中。然后，按适当浓度向每孔加入经热灭活的患者血清，必要时补充经热灭活的AB血清，并设置阴性对照。使用VBG++将每孔补至终体积150 µL，然后在37°C下以E IA封板膜覆盖，振荡孵育1.5至2小时。孵育结束后，用含0.5% BSA的PBS洗涤细胞3次，随后以每毫升1 µg的浓度加入荧光标记的抗C3和抗C4单克隆抗体，室温下轻柔振荡孵育30至45分钟。再次将板洗涤3次后，将红细胞重悬于每孔150 µL含0.5% BSA的PBS中。将细胞悬液转移至新的96孔圆底板中，然后将该板放入流式细胞仪，利用前向散射图将单细胞与双联体分离开。在单个红细胞群体上设门，随后选择适当的检测通道以检测荧光信号。采用中位荧光强度进行定量溶血分析来量化结果，按照前述方法加热并激活患者血清，并洗涤经罗马生菜处理的红细胞。随后，将红细胞与补体及患者血清孵育（操作如前所述），但不加入抗C5抗体，于664 ×g条件下以降低的减速速度离心5分钟。接着，小心转移90微升上清液至新的微孔板中，注意避免转移完整的细胞并防止产生气泡，然后使用分光光度计在414至690 nm波长范围内测定吸光度。溶血程度以在纯水中孵育的红细胞样本完全裂解的百分比表示。在本图中，展示了经brola处理的红细胞的代表性散点图，其中可见适用于单个红细胞的门控设置。通常，约95%的红细胞位于此单细胞门控范围内。在这些直方图中，展示了自身免疫性溶血性贫血（autoimmune hemolytic anemia，aha）作用的代表性结果。如预期所示，患者血清中C4和C3的沉积量随血清量增加而增加。令人好奇的是，补体沉积呈现出两个明显分离的阳性峰。这种现象可能并非由红细胞群体的异质性引起，因为红细胞来自单一供体；尽管该现象的确切原因仍在研究中，但本实验通过折线图展示了各样本的中位荧光强度，以说明C4和C3沉积检测的可重复性。请注意各种AH H患者样本在沉积上的显著差异。最后，这些图表中显示了来自含有针对红细胞自身抗体的ahha患者血清样本的溶血试验数据。使用该血清样本进行滴定，结合适当的补体抑制剂（如抗C5），可得到一条清晰且可重复的曲线。溶血信号可以如本图所示进行滴定消除。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过流式细胞术分析C3或C4的沉积，或通过定量溶血试验来检测红细胞特异性抗体介导的补体激活。

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Research

科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

定量检测抗体诱导补体激活的方法对红血细胞

经典途径由抗体激活，最终导致靶细胞裂解。CH50 测定法用于评估血清样本的补体活性。本视频演示了测定血清样本 CH50...

测定血清50%溶血补体（CH50）活性

来源：Nagre, N., 等．小鼠肺泡巨噬细胞吞噬作用与细菌清除实验．J. Vis. Exp.

利用体外致敏红细胞模拟补体介导的吞噬作用

本视频展示了一种用于评估血清中抗体介导的补体依赖性杀菌活性的技术。该方法将分离的血清与致病菌及外源性补体蛋白混合。经过孵育后，将细菌接种于琼脂平板上培养，并通过定量生成的菌落来测定血清的杀菌滴度。...

一种用于检测抗体补体介导杀菌活性的血清杀菌试验

该视频演示了用于检测血清中针对特定抗原的抗体的血凝抑制试验。通过不同的视觉模式，可确认检测孔中出现血凝抑制现象，而对照孔中出现血凝现象。该试验在病毒学和免疫学领域中对于评估免疫反应、疫苗有效性以及研究病毒感染具有重要作用。...

检测血清中针对目标抗原抗体的血凝抑制试验

本视频展示了一种检测抗体介导的T细胞效应功能激活的实验方法。将针对流感病毒血凝素（HA）的特异性单克隆抗体加入表达HA的转染哺乳动物细胞中，可形成与HA的免疫复合物。当引入表达Fc受体和荧光素酶报告基因的工程化T细胞后，抗体-HA复合物可激活T细胞，通过添加荧光素酶底物并检测产生的生物发光信号，即可检测T细胞的激活程度。...

测量HA抗体介导的Fc效应功能的激活

本视频展示了一种检测乳汁吞噬细胞介导的抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）的实验方法。将荧光标记的、与抗原-抗体复合物偶联的微球与从乳汁中分离的细胞悬液混合，以诱导吞噬性白细胞发生抗体依赖性细胞吞噬作用。通过使用针对常见白细胞抗原（CD45）的抗体对细胞进行标记后，采用流式细胞术检测微球阳性且具有活力的吞噬性白细胞的荧光强度，从而反映ADCP活性水平。...

一种体外检测吞噬细胞介导的抗体依赖性细胞吞噬作用的实验方法

单核细胞单层试验（MMA）是一种 体外...

使用单核细胞单层法评估Fcγ受体介导的吞噬作用

本文介绍了利用旋转盘共聚焦显微镜对小鼠腹腔常驻巨噬细胞的单个吞噬事件进行成像的方法。该方案可拓展应用于其他吞噬性细胞。...

小鼠巨噬细胞吞噬作用的延时三维成像

本方法旨在通过与三位已知红细胞CR1密度的受试者进行比较，测定任意受试者红细胞中的CR1密度。该方法采用流式细胞术，通过与藻红蛋白（PE）偶联的抗CR1单克隆抗体对受试者的红细胞进行免疫染色后检测。...

使用流式细胞术测定红细胞补体受体1

捕获无核红细胞中蛋白质活化过程的动态变化存在方法学上的挑战，例如如何保存急性刺激引起的动态变化以供后续分析。本方案描述了样本制备和染色技术，可实现相关蛋白质变化的保存与分析，并支持后续检测。...

基于免疫染色的红细胞蛋白质动态变化检测

我们对现有的单核细胞-单层试验（MMA）进行了改进并更新了方法，该试验利用巨噬细胞帮助更好地预测输血医学和免疫学中红细胞同种抗体的临床相关性。该试验被命名为单核细胞-巨噬细胞试验（M-MA）。...

利用单核-巨噬细胞试验预测红细胞抗体的临床意义

学习使用流式细胞术和光谱法定量检测抗体诱导的红细胞补体激活。该方法通过测量C3/C4沉积和血红蛋白释放，为免疫学和血液学研究提供比传统方法更灵敏的定量分析工具。

红细胞上抗体诱导补体活化的定量检测方法

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