使用流细胞测定测量红细胞补充受体1
May 19th, 2020
该方法的目的是通过与已知红细胞CR1密度的三个受试者进行比较，确定任何受试者红细胞CR1密度的CR1密度。该方法使用抗CR1单克隆抗体在受试者红细胞免疫染色后使用流细胞学，并结合使用植物素（PE）的放大系统。
该协议可用于测量感兴趣的细胞受体上的抗原位点的数量。这种技术的主要优点是，它产生强大的结果，甚至对于低密度表达的受体。这种方法能够评估CR1红细胞表达的减少，这是如阿尔茨海默氏症，系统性红斑狼疮，艾滋病和疟疾。
该协议可用于细胞受体密度的任何分析，也可用于荧光显微镜对细胞受体表达的研究。我们建议在细胞和抗体分布期间间隔管子，并在可能的情况下在第一次分析期间由细胞测量专家陪同。通过流式细胞学对免疫污染和密度定量进行可视化演示，对于了解如何正确设置分析参数至关重要。
在开始分析之前，将 250 微升 EDTA 钠从血液储存管中解凝全血放入含有 20 毫升 4 摄氏度 PBS-BSA 的 50 毫升锥形管中。通过温和的反转混合管内，通过离心旋转细胞。使用 10 毫升移液器丢弃上一液，并小心地将颗粒重新在溶液的剩余体积中。
加入20毫升的冷PBS-BSA，并再次离心细胞。在离心结束时，将管子放在机架中，放在冰上，将8微升洗涤的红细胞转移到含有三毫升PBS-BSA的50毫升管中。然后通过旋转轻轻混合红细胞，获得均匀细胞悬浮液。
对于红细胞免疫，小心地将100微升稀释红细胞转移到单独的1.5毫升管中，通过离心收集红细胞。丢弃超生剂后，在PBS-BSA中，将生物基化抗CR1 J3D3抗体的每微升浓度20微升，直接加入到每个颗粒中。单独在负对照细胞中加入20微升PBS-BSA缓冲液，轻轻混合，在4摄氏度下孵育样品45分钟。
在孵育结束时，每管洗涤用750微升新鲜PBS-BSA洗两次样品。第二次洗涤后，将PBS-BSA中1至10丁苯二丁的施泰普他丁植物铁蛋白的20微升加入到每根管子中，轻轻混合，在4摄氏度下孵育样品45分钟。孵化结束时，洗两次样品，如证明。
第二次洗涤后，在涡旋过程中用450微升固定缓冲液固定每个细胞样本颗粒，然后将每个样品转移到单独的五毫升圆形底部管中，在4摄氏度下储存长达48小时。要分析流式细胞仪的免疫污染红细胞，请单击流式细胞仪中的新实验按钮，然后重命名新实验。在圆度计设置窗口中选择向前散点、侧散射和 PE。
在打开的实验中，选择圆度计设置应用程序设置，并使用灰色框和十字线创建全局工作表来指导优化。设置所有参数后，将未污染的控制管加载到圆度计上并运行采集，优化正向和侧散射电压，以消除碎屑并确保感兴趣的总体是规模。接下来，在前进和侧散射图的红血球周围绘制一个门，并在PE荧光点图中显示红细胞群体。
如果正群是规模，将染色控制管加载到圆度计上并运行采集。要记录和分析样品，请卸载染色样品，并在新的全局工作表上创建前向与侧散点图和 PE 荧光直方图。将第一个样本加载到圆度计上，运行采集，并在前向和侧散射图的红细胞周围绘制红细胞门。
在PE荧光直方图中显示红细胞群，在统计选项卡下，选择红细胞群PE荧光参数的均值。在采集仪表板中，选择要记录停止门中的所有事件和 10，000 个要记录的事件，然后单击记录数据。事件记录完成后，从测速仪上取出管子。
全局工作表图应如图所示。来自三个已知CR1密度受试者的免疫色红细胞的流细胞测量分析允许测量每个受试者标签的均荧光强度。使用已知红细胞 CR1 密度的受量值绘制曲线，允许将这些数据报告为平均荧光强度的函数。
将这条曲线得出的回归线与其他受试者平均荧光强度的值进行比较，可以确定其CR1红细胞密度。注意红细胞和抗体的分布正确，因此对阴性对照实验样品的校准曲线在细胞仪设置范围内。只需改变原抗体和/或调整扩增层，即可调整此程序以测量其他密度细胞受体。
每当你处理血液，有病原体污染的风险。因此，一定要使用良好的实验室做法，并穿戴适当的个人防护设备。
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概述
该协议概述了一种使用流式细胞术和免疫染色测量红细胞中CR1密度的方法。它特别适用于评估各种情况下的受体表达，如阿尔茨海默症和系统性红斑狼疮。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- CR1是参与免疫反应的受体。
- CR1密度的变化可以指示各种疾病。
- 流式细胞术允许精确测量受体密度。
- 免疫染色增强了特定受体的检测。
研究目的
- 确定受试者红细胞中的CR1密度。
- 将CR1密度与其他受试者的已知值进行比较。
- 评估疾病对CR1表达的影响。
使用的方法
- 流式细胞术用于定量受体密度。
- 使用抗CR1单克隆抗体进行免疫染色。
- 使用藻胆蛋白（PE）以增强检测。
- 与对照受试者进行比较以评估结果。
主要结果
- 对低密度受体的稳健结果。
- 评估各种疾病中CR1表达的减少。
- 视觉演示有助于理解分析参数。
- 该协议适用于荧光显微镜研究。
结论
- 该方法有效测量CR1密度。
- 它提供了健康和疾病中受体表达的见解。
- 建议与细胞术专家合作。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying erythrocyte complement receptor 1 (CR1) density enables mechanistic de-risking in target validation for immune-mediated diseases. This flow cytometry method supports predictive confidence by detecting low-abundance receptor expression changes linked to Alzheimer's, SLE, AIDS, and malaria. It provides a translational biomarker platform for early discovery and portfolio triage in neuroimmunology and infectious disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures CR1 density to interrogate therapeutic hypotheses in complement-mediated pathways.
- Operational Value: Enables detection of low-density receptor expression using amplifying immunostaining for robust quantification.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by correlating CR1 reduction with disease phenotypes in neurodegenerative and autoimmune conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative mean fluorescence intensity (MFI) data for receptor density calibration across subjects.
- Operational Value: Standardizes erythrocyte preparation and immunostaining workflow for reproducible flow cytometry analysis.
- Scientific Value: Enables assay adaptation to other cellular receptors by substituting primary antibody and amplification layers.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links CR1 density measurements to disease states such as Alzheimer's and SLE for biomarker validation.
- Operational Value: Facilitates cross-functional collaboration through standardized cytometric protocols and global worksheet analysis.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying receptor expression changes in preclinical disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing quantitative receptor density data that informs target confidence and assay readiness for downstream screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of complement receptor involvement in immune complex clearance and cellular immune responses.
- Screening: Delivers standardized, quantitative PE fluorescence outputs for reliable compound effect evaluation on receptor expression.
- Analytics: Enables MFI-based calibration curves to determine unknown CR1 densities from fluorescence intensity readings.
- Translational Research: Connects erythrocyte CR1 measurements to disease-associated expression changes for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable immunostaining and flow cytometry platform for measuring diverse cell surface receptors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through precise, low-density receptor quantification.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized cell washing, antibody titration, and fixation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking receptor density changes to disease mechanisms.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on measurable biomarker modulation in disease states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, compensation, and gating strategies for erythrocyte analysis.
- Dependent on access to cytometer capable of PE fluorescence detection and low-temperature sample handling.
- Necessitates standardization across teams for antibody dilution, incubation timing, and wash consistency.
- Involves adaptation considerations when transferring protocol to other receptor systems or cell types.
- Includes practical limitations such as erythrocyte stability, antibody specificity, and background fluorescence from non-specific binding.
