Name: 使用流细胞测定测量红细胞补充受体1 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 了解如何使用流式细胞术和免疫染色技术测量红细胞CR1受体密度。该方法适用于阿尔茨海默病和系统性红斑狼疮等疾病研究，可精确评估受体表达变化。

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感谢URCACyt、流式细胞术技术平台、免疫学系以及内科和老年病科的全体成员，他们为优化和验证本方案作出了贡献。本工作由兰斯大学医院资助（项目编号：AOL11UF9156）。

人类血液采集和处理的方案已通过地区伦理委员会（CPP Est II）的审查和批准，方案编号为2011-A00594-37。由于以下方案涉及人类血液的处理，应遵循机构关于生物危害材料处置的指导原则。实验人员应穿戴实验室安全装备，如实验服和手套。
1. 红细胞洗涤
注意：操作前一天，用含0.15%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）配制PBS-BSA缓冲液，并将其置于4 °C冰箱中冷藏。该缓冲液将用作洗涤缓冲液和稀释缓冲液。
<ol>
	<li>用移液器将 20 mL PBS-BSA 加入 50 mL 离心管中。</li>
	<li>从血液储存管中吸取 250 µL 乙二胺四乙酸钠（EDTA）抗凝全血，加入含有 20 mL PBS-BSA 的离心管中。拧紧管盖，轻轻倒置混匀 2 次。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 430 ×g 离心 10 分钟。使用 10 mL 移液器吸除并弃去上清液。通过轻柔、小心地移液，将沉淀物重悬于残留的上清液体积中。</li>
	<li>向含有沉淀物的离心管中加入 20 mL 冷的 PBS-BSA（4 °C）。在 4 °C 条件下，以 430 ×g 离心 10 分钟。使用 10 mL 移液器吸除并弃去上清液。</li>
	<li>向含有沉淀物的离心管中加入 20 mL 冷的 PBS-BSA（4 °C）。在 4 °C 条件下，以 430 ×g 离心 10 分钟。将离心管保留在 4 °C 离心机中，进入第 2 节操作。</li>
</ol>
2. 红细胞稀释
<ol>
	<li>用移液器将 3 mL 冷的 PBS-BSA 加入 50 mL 离心管中，并将其置于冰架上，4 °C 保存。</li>
	<li>将含有红细胞的离心管（步骤 1.4）放置于冰架上。</li>
	<li>使用移液器吸取 8 µL 红细胞沉淀，加入含有 3 mL PBS-BSA 的 50 mL 离心管中，制备红细胞稀释液。用手轻轻混匀管内液体，获得均匀的红细胞悬液。</li>
</ol>
3. 红细胞免疫染色
<ol>
	<li>用移液器吸取100 µL红细胞稀释液（来自第4节），加入1.4 mL离心管中。</li>
	<li>将离心管在4 °C、430 ×g条件下离心5分钟。在离心过程中，用PBS-BSA缓冲液配制生物素化抗CR1 J3D3抗体的稀释液，使其浓度为0.05 μg/μL。</li>
	<li>离心结束后，移除并弃去上清液。</li>
	<li>直接向沉淀中加入20 µL生物素化抗CR1 J3D3抗体。对于阴性对照组，加入20 µL PBS-BSA缓冲液。轻轻混匀各管，并在4 °C孵育45分钟。</li>
	<li>孵育45分钟后，向各管中加入750 µL PBS-BSA缓冲液。将离心管在4 °C、430 ×g条件下离心5分钟。移除并弃去上清液。重复该步骤一次。</li>
	<li>在此期间，用PBS-BSA缓冲液配制链霉亲和素-藻红蛋白（streptavidin-phycoerythrin）的1:10稀释液。用移液器吸取20 µL该1:10稀释液加入各管中。轻轻混匀各管，并在4 °C孵育45分钟。</li>
	<li>向各管中加入750 µL PBS-BSA缓冲液。充分混匀后，在4 °C、430 ×g条件下离心5分钟。移除并弃去上清液。重复该步骤一次。</li>
	<li>在离心过程中，用PBS-BSA缓冲液配制生物素化抗链霉亲和素抗体的1:100稀释液。</li>
	<li>离心结束后，移除并弃去上清液。</li>
	<li>用移液器吸取20 µL该1:100稀释的生物素化抗链霉亲和素抗体加入各管中。轻轻混匀各管，并在4 °C孵育45分钟。</li>
	<li>孵育45分钟后，用移液器吸取750 µL PBS-BSA缓冲液加入各管中。将离心管在4 °C、430 ×g条件下离心5分钟。移除并弃去上清液。重复该步骤一次。</li>
	<li>用移液器吸取20 µL前述1:10稀释的链霉亲和素-藻红蛋白溶液加入各管中。轻轻混匀各管，并在4 °C孵育45分钟。</li>
	<li>用移液器吸取750 µL PBS-BSA缓冲液加入各管中。充分混匀后，在4 °C、430 ×g条件下离心5分钟。移除并弃去上清液。重复该步骤两次。</li>
</ol>
4. 免疫染色红细胞的固定
<ol>
	<li>在最后一次离心过程中，使用洗涤缓冲液 PBS-BSA 配制固定缓冲液，即按 1:100 比例稀释 37% 的甲醛溶液。</li>
	<li>用移液器吸取 450 μL 固定缓冲液，在涡旋振荡 5 秒的同时加入已免疫染色的红细胞管（来自步骤 3.13）中。</li>
	<li>将所有固定的细胞转移至 5 mL 圆底管中，并置于冰箱中保存。 
	注意：本实验方案可在此处暂停，最长可暂停 48 小时。</li>
</ol>
5. 染色红细胞的流式细胞术分析
注意：建议参考流式细胞仪的操作手册（见材料表），以了解如何进行流式细胞检测。以下建议的参数适用于所使用的仪器，但必须针对每台流式细胞仪进行优化。
<ol>
	<li>打开流式细胞仪，然后开启计算机。让光学系统预热30分钟以使温度稳定。检查软件中的细胞仪窗口，确保细胞仪已连接到工作站（显示消息 细胞仪已连接）。</li>
	<li>检查缓冲液容器是否已装满，废液容器是否为空。使用排空系统清除缓冲液滤器和缓冲液管路中的气泡。按下细胞仪控制面板上的 启动流路 按钮，对流体系统进行预启动。等待指示灯由红色变为绿色。</li>
	<li>为清洗流路系统，将含有3 mL清洗液的试管安装在样品进样口，以高样品流速运行清洗液5分钟。随后用蒸馏水作为冲洗液重复此步骤。最后将装有水的试管保留在样品进样口。</li>
	<li>准备校准微珠时，用移液器将400 µL PBS加入圆底试管底部。将微珠储备液剧烈涡旋混匀30秒，取一滴加入含PBS的圆底试管中，再轻轻涡旋混匀30秒。</li>
	<li>运行性能检测。在软件中打开细胞仪的 设置与追踪 模块（图1A）。确认细胞仪配置适用于PE免疫染色实验，并核对校准微珠批次与配置一致。</li>
	<li>将微珠试管安装在样品进样口，以低样品流速运行。启动性能检测（约需5分钟完成）。检测完成后，确认细胞仪性能符合要求（图1B）。关闭软件中的细胞仪 设置与追踪 模块。</li>
	<li>设置实验并创建应用参数：点击浏览器工具栏上的 新建实验 按钮并打开新实验。通过下拉菜单选择合适的细胞仪参数：前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC）和 PE（图1C）。FSC参数选择 线性模式，SSC和PE参数选择 对数模式。</li>
	<li>在打开的实验中，选择 细胞仪设置（图1D），然后选择 应用设置，并创建一个全局工作表（图1E）。使用灰色方框和十字线辅助优化设置。</li>
	<li>将未染色对照管加载至细胞仪并运行 采集。通过优化FSC和SSC电压，确保目标细胞群（即红细胞）位于量程范围内。优化FSC阈值，以去除碎片信号，同时不干扰目标细胞群。</li>
	<li>在FSC与SSC散点图上围绕红细胞绘制门控。在PE荧光点图中显示红细胞群。如有需要，提高光电倍增管（PMT）电压，使阴性群体落在灰色方框内。完成后从细胞仪卸下未染色对照管。</li>
	<li>确认阳性群体处于量程范围内。将染色对照管加载至细胞仪并运行 采集。若阳性群体超出量程，降低PMT电压，直至阳性群体完全显示在量程内。然后卸下染色样本。</li>
	<li>为记录和分析样本，在新的全局工作表中创建以下用于预览数据的图表：1）FSC vs. SSC散点图，2）PE荧光直方图。将第一个样本加载至细胞仪并运行 采集。</li>
	<li>在FSC与SSC散点图上围绕红细胞绘制门控。在PE荧光直方图中显示红细胞群。在 统计 视图中，选择GR细胞群PE荧光参数的均值（图1F）。</li>
	<li>在 采集 仪表板中，选择停止门控中的所有事件，并设定记录10,000个事件（图1G）。点击 记录数据。事件记录完成后，从细胞仪中移除第一根试管。全局工作表中的图表应与 图2 所示一致。</li>
	<li>加载后续样本并依次记录。</li>
</ol>
6. 红细胞CR1密度的测定
<ol>
	<li>取对应样本的平均荧光强度值 &#34;低&#34; 受试者（图3, 表 I，红细胞MFI）， &#34;培养基&#34; 受试者（图4, 表 D，红细胞MFI）， &#34;高&#34; 受试者（图4, 表 I，红细胞MFI）以及阴性对照样本（图3, 表 I，红细胞MFI）。</li>
	<li>在以平均荧光强度为纵坐标、CR1 密度为横坐标的图上，标出对应于阴性对照的四个数据点， &#34;低&#34; 受试者， &#34;培养基&#34; 受试者，以及 &#34;高&#34; 受试者（蓝色点， 图6).</li>
	<li>绘制回归线以获得校准线及其方程。</li>
	<li>取对应于待测定密度的受试者样本的平均荧光强度值。图5, 表 D 和表 I，红细胞MFI）。</li>
	<li>通过替换得到方程 &#34;Y&#34; 利用平均荧光强度值，计算CR1/E的密度图6).</li>
	<li>检查图表，确认平均荧光强度值和测定的CR1/E密度对应于校准线上的一个点（图6).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

目前有多种技术可用于测定红细胞CR1的密度（CR1/E）。最早采用的技术包括抗CR1抗体介导的红细胞凝集31以及在C3b包被的红细胞存在下形成花环结构32。这些原始技术很快被使用放射性标记抗CR1抗体的免疫染色方法所取代1,33。此外，也可通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测膜提取物中CR1的浓度34。尽管这些方法准确，但仅能提供CR1/E密度的平均值。只有通过免疫染色后进行流式细胞术分析，才能获得整个红细胞群体中CR1/E密度的分布情况。由于CR1/E密度较低，该技术实施较为困难。然而，目前已有扩增方法可简便地测定CR1/E密度30。
本文介绍一种基于免疫染色细胞荧光信号放大技术，通过流式细胞术定量CR1/E的方法。该信号放大系统采用连续四层染色步骤：首先使用生物素化的抗C...

CR1（补体受体1型，CD35）是一种200 kDa的跨膜糖蛋白，存在于多种细胞表面，如红细胞1、B淋巴细胞2、单核细胞、部分T细胞、滤泡树突状细胞3、胎儿星形胶质细胞4以及肾小球足细胞5。CR1通过与其配体C3b、C4b、C3bi6,7,8,9、第一补体成分的亚单位C1q10以及甘露糖结合凝集素（MBL, mannan-binding lectin）11相互作用，抑制补体系统的活化，并参与体液免疫和细胞免疫应答。
在包括人类在内的灵长类动物中，红细胞上的CR1参与将免疫复合物转运至肝脏和脾脏，以清除血液中的免疫复合物，防止其在皮肤或肾脏等易损组织中积聚12,13,14。免疫复合物与红细胞之间的这种免疫黏附现象依赖于CR1分子的数量15。在人类中，CR1/红细胞的平均密度仅为500（即每个红细胞含有500个CR1分子）。该密度在不同个体之间（100–1,200 CR1/红细胞）以及同一个体的不同红细胞之间均存在差异。某些表现为“&#34;null&#34;”表型的个体，其CR1/红细胞表达量少于2016。
CR1/E 的密度由两个共显性的常染色体等位基因调控，这两个等位基因与编码 CR1*1 的基因第 27 内含子中的一个点突变相关17,18。该突变产生了一个额外的 HindIII 酶切位点。在此情况下，经 HindIII 消化后得到的限制性片段分别为：与 CR1 高表达相关的等位基因（H：高表达等位基因）为 7.4 kb，与 CR1 低表达相关的等位基因（L：低表达等位基因）为 6.9 kb。这种关联存在于高加索人和亚洲人中，但在非洲裔人群中未发现19。
红细胞CR1的表达水平也与第13外显子编码SCR10（I643T）和第19外显子编码SCR16（Q981H）中的单核苷酸突变有关。在643I/981Q纯合个体中表达较高，而在643T/981H纯合个体中表达较低20。因此，&#34;低表达&#34;个体每个红细胞约表达150个CR1分子，&#34;中等&#34;个体约表达500个CR1/红细胞，而&#34;高表达&#34;个体约表达1,000个CR1/红细胞。
除了这种红细胞密度多态性外，CR1还具有长度多态性，对应于四种不同大小的异型体：CR1*1（190 kDa）、CR1*2（220 kDa）、CR1*3（160 kDa）和CR1*4（250 kDa）21，以及与KN血型系统相对应的抗原多态性22。
我们介绍一种基于流式细胞术测定CR1/E密度的方法。利用已知CR1/E密度的三位受试者，其红细胞（RBC）CR1表达水平分别为低密度（180 CR1/E）、中等密度（646 CR1/E）和高密度（966 CR1/E），在使用抗CR1抗体对红细胞进行免疫染色后，可通过流式细胞仪轻松测定其红细胞的平均荧光强度（MFI），即RBC MFI。随后可绘制一条标准曲线，表示MFI与CR1/E密度之间的函数关系。通过测定未知CR1/E密度个体的MFI，并将其与该标准曲线进行比较，即可确定其CR1/E密度。该技术已在实验室中应用多年，使我们能够检测到多种疾病状态下红细胞CR1表达的下调，例如系统性红斑狼疮（SLE）23、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）24、疟疾25，以及近期发现的阿尔茨海默病（AD）26,27。针对CR1开发药物并使其与红细胞偶联（如抗血栓药物）28的研究，需要对CR1/E密度进行评估，因此亟需一种可靠的技术来定量检测CR1。
本方案以单次重复进行。该方法可适用于使用特定的商品化96孔板（参见材料表）测定多个个体红细胞表面CR1/E的密度。为此，可轻松将我们的方法适配至任何96孔板。每个样本每孔加入红细胞悬液（0.5 × 106–1 × 106 个红细胞）。每孔依次加入一抗抗CR1抗体、链霉亲和素-PE、抗链霉亲和素二抗，再重复加入链霉亲和素-PE，所用稀释比例与本方法一致，但需调整体积并保持比例关系。
应同时采集用于设定范围的受试者以及待测定CR1水平的受试者的血液样本，并在4 °C下冷藏保存，所有操作均需在4 °C条件下进行（置于冰上和/或冰箱中）。

<table><tbody><tr><td>1000E 防污染吸头</td><td>赛默飞世尔科技，法国伊尔基什-格拉芬什塔登，邮编：F-67403</td><td>2079E</td><td>样品移液</td></tr><tr><td>1-100 &amp;micro;L 型斜面滤芯吸头</td><td>Starlab GmbH，德国阿伦斯堡，D-22926</td><td>S1120-1840</td><td>样品移液</td></tr><tr><td>生物素标记的抗CR1单克隆抗体（J3D3）</td><td>非商业性单克隆抗体的实验室制备，由 J. Cook 博士提供</td><td></td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>上衣</td><td></td><td></td><td>保护</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（7.5%）</td><td>Thermo Fischer Scientific ，F-67403 伊尔基什，法国</td><td>15260037</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>离心</td><td>赛默飞世尔科技公司，法国伊尔基什-格拉芬什塔登，邮编：F-67403</td><td>11176917</td><td>离心</td></tr><tr><td>清洁溶液</td><td>法国勒庞德克莱克斯，BD，邮编 38801</td><td>340345</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>Comorack-96</td><td>Dominique DUTSCHER SAS，法国布马特，67172</td><td>944060P</td><td>架子</td></tr><tr><td>细胞仪设置 &amp;amp; 追踪微球试剂盒</td><td>法国，勒蓬德克莱，BD，邮编：F-38801</td><td>655051</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>36.5% 甲醛溶液</td><td>Sigma Aldrich，法国圣康坦法拉维耶，F-38070</td><td>F8775-25ML</td><td>固定</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L刻度，带滤芯吸头</td><td>Starlab GmbH，德国阿伦斯堡，D-22926</td><td>S1121-3810</td><td>样品移液</td></tr><tr><td>LSRFORTESSA 流式细胞仪</td><td>法国，勒蓬德克莱，BD，邮编：F-38801</td><td>647788</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>微控毛细管活塞</td><td>Dominique DUTSCHER SAS，法国弗鲁马 67172</td><td>067494</td><td>样品移液</td></tr><tr><td>Micronic 1.40 mL 圆底管</td><td>Dominique DUTSCHER SAS，法国布马特，67172</td><td>MP32051</td><td>混合</td></tr><tr><td>微量移液器 Microman - 型号 M25 -</td><td>Dominique DUTSCHER SAS，法国布马特，67172</td><td>066379</td><td>样品移液</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>赛默飞世尔科技，法国伊尔基什-格拉芬什塔登，邮编：F-67403</td><td>10010031</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>移液管 PS 325 mm，10 mL</td><td>Dominique DUTSCHER SAS，法国布马特，67172</td><td>391952</td><td>样品移液</td></tr><tr><td>无粉丁腈检查手套</td><td>Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, 美国</td><td>486802</td><td>样本保护</td></tr><tr><td>参考2号移液器，0.5-10 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf France SAS，法国蒙特松，78360</td><td>4920000024</td><td>样品移液</td></tr><tr><td>参考2号移液器，20-100 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf France SAS，法国蒙特松，78360</td><td>4920000059</td><td>样品移液</td></tr><tr><td>参考2号移液器，100-1000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf France SAS，法国蒙特松，F-78360</td><td>4920000083</td><td>样品移液</td></tr><tr><td>冲洗液</td><td>法国，勒庞德克莱，BD，邮编：F-38801</td><td>340346</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>圆底试管</td><td>Sarstedt，F-70150 Marnay，法国</td><td>55.1579</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>安全锁扣管，1.5 mL</td><td>Eppendorf France SAS，法国蒙特松，78360</td><td>0030120086</td><td>混合</td></tr><tr><td>链霉亲和素-R-藻红蛋白</td><td>Tebu Bio，法国勒佩赖-昂伊夫林，78612</td><td>AS-60669</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>锥形离心管 50 mL</td><td>赛默飞世尔科技公司，法国伊尔基什-格拉芬斯塔登，邮编 F-67403</td><td>10203001</td><td>混合</td></tr><tr><td>抗链霉亲和素生物素化载体</td><td>Eurobio Ingen，法国莱于利斯，91953</td><td>BA-0500</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>美国纽约州博伊米亚，科学工业公司，邮编 111716</td><td>SI-0236</td><td>混合</td></tr></tbody></table>

使用流式细胞术测定红细胞补体受体1

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

CR1（CD35，C3b/C4b 补体受体 1 型）是一种分子量约为 200 kDa 的高分子膜糖蛋白，可调控补体激活、转运免疫复合物，并参与体液和细胞免疫应答。CR1 存在于多种细胞表面，包括红细胞，其长度、结构（Knops 或 KN 血型系统）和表达密度具有多态性。每个红细胞表面的平均 CR1 密度（CR1/E）约为 500 个分子，但在不同个体之间（100–1,200 CR1/E）以及同一人体内不同红细胞之间均存在差异。本文介绍一种可靠的流式细胞术方法，结合信号放大免疫染色系统，用于测定红细胞表面 CR1 密度，尤其适用于低密度表达个体。该方法已帮助我们证实，在阿尔茨海默病（AD）、系统性红斑狼疮（SLE）、艾滋病（AIDS）或疟疾等疾病中，红细胞表面 CR1 的表达水平降低。

已知CR1密度的三位受试者（“低”密度受试者[180 CR1/E]、“中”密度受试者[646 CR1/E]和“高”密度受试者[966 CR1/E]）以及另两位需测定CR1密度的受试者的红细胞，采用与藻红蛋白荧光染料偶联的抗CR1抗体进行免疫染色。最初，通过Scatchard方法29使用放射性标记抗体测定低至高范围受试者的CR1密度。由此确定的标准品（低、中、高）用于绘制标准曲线，使我们可通过流式细胞术方法30对新的标准品或次级标准品进行定量。将免疫染色后的红细胞通过流式细胞仪检测后，观察并测量每位受试者的平均荧光强度（RBC MFI）（图3F、I；图4B、D、F、I；图5B、D、F<...

本方法旨在通过与三位已知红细胞CR1密度的受试者进行比较，测定任意受试者红细胞中的CR1密度。该方法采用流式细胞术，通过与藻红蛋白（PE）偶联的抗CR1单克隆抗体对受试者的红细胞进行免疫染色后检测。

CR1（CD35，C3b/C4b 补体受体 1 型）是一种分子量约为 200 kDa 的高分子膜糖蛋白，可调控补体激活，……

本方案可用于测定目标细胞受体上抗原位点的数量。该技术的主要优势在于即使对于低密度表达的受体，也能获得可靠的结果。该方法能够评估红细胞CR1表达的减少情况，这种减少与阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮、艾滋病和疟疾等疾病相关。该方案适用于任何细胞受体密度的分析，也可用于通过荧光显微镜研究细胞受体表达。我们建议在分配细胞和抗体时将试管间隔放置，并尽可能在首次分析时由流式细胞术专家陪同操作。通过流式细胞术对免疫染色及密度进行可视化演示，对于正确设置分析参数至关重要。开始分析前，从血液储存管中加入250微升含钠EDTA抗凝剂的全血至一个含有20毫升4摄氏度PBS-BSA的50毫升锥形管中。通过轻柔倒置混匀管内物质，并通过离心沉淀细胞。使用10毫升移液器弃去上清液，并小心地将沉淀物在残留的溶液中重新悬浮。加入20毫升冷的PBS-BSA，再次离心细胞。离心结束后，将离心管置于冰上放置的试管架中，取8微升洗涤后的红细胞转移至含有3毫升PBS-BSA的50毫升离心管中。然后通过轻轻涡旋混合红细胞，以获得均匀的细胞悬液。进行红细胞免疫染色时，将100微升稀释后的红细胞小心转移至各1.5毫升离心管中，通过离心收集红细胞。弃去上清液后，直接向每份细胞沉淀中加入20微升PBS-BSA缓冲液配制的生物素化抗CR1 J3D3抗体（浓度为0.5微克/微升）。向阴性对照细胞中仅加入20微升PBS-BSA缓冲液，并轻轻混匀，随后将所有样本在4°C条件下孵育45分钟。孵育结束后，每次用750 µL新鲜的PBS-BSA缓冲液洗涤样品，每管洗两次。第二次洗涤后，每管加入20 µL用PBS-BSA稀释的链霉亲和素-藻红蛋白（1:10稀释），轻轻混匀，在4°C孵育45分钟。孵育结束后，按上述方法将样品洗涤两次。第二次洗涤后，在涡旋振荡的同时，用450微升固定缓冲液固定每个细胞样品沉淀，然后将每个样品转移至各自的5毫升圆底管中，在4摄氏度条件下最多可保存48小时。为分析用于流式细胞术的免疫染色红细胞，请点击流式细胞仪中的“新建实验”按钮，并为新实验重命名。在细胞仪设置窗口中选择前向散射光、侧向散射光和PE。在开放实验中，选择流式细胞仪设置的应用程序设置，并创建一个全局工作表，使用灰色方框和十字线来指导优化。当所有参数设置完成后，将未染色对照管加载到流式细胞仪上并开始采集数据，优化前向散射和侧向散射电压，以去除碎片信号，并确保目标细胞群处于量程范围内。接着，在前向散射与侧向散射图上围绕红细胞绘制门控区域，并在PE荧光的点图中显示红细胞群体。如果阳性细胞群在量程范围内，将染色后的对照管上机并开始采集。为记录和分析样本，卸下染色样本，在新的全局工作表中创建前向散射光与侧向散射光图以及PE荧光直方图。将第一个样本上机，开始采集，并在前向散射光与侧向散射光图中围绕红细胞绘制红细胞门。在PE荧光直方图中显示红细胞群体，并在统计选项卡中选择红细胞群体PE荧光参数的平均值。在采集仪表板中，选择停止门控中的所有事件以及要记录的10,000个事件，然后点击记录数据。当事件记录完成后，从流式细胞仪上取下试管。全局工作表的图示应如图所示。通过对三名已知CR1密度的受试者红细胞进行免疫染色后的流式细胞术分析，可测量每位受试者标记的平均荧光强度。利用已知红细胞CR1密度受试者的数值绘制曲线，可将这些数据表示为平均荧光强度的函数。将由此曲线得到的回归线与其他受试者的平均荧光强度值进行比较，可确定其红细胞CR1受体密度。需注意确保红细胞和抗体充分混匀分布，使实验样本相对于阴性对照的校准曲线处于流式细胞仪设置的检测范围内。通过更换一抗和/或调整信号放大层，该方法可适用于测量其他细胞表面受体密度。每次处理血液时，均存在病原体污染的风险。因此，务必遵循良好的实验室操作规范，并穿戴适当的个人防护装备。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用流细胞测定测量红细胞补充受体1

一种通过流式细胞术直接在新鲜分离的小鼠骨髓、脾脏或胎肝中鉴定和分析分化阶段特异性小鼠红系祖细胞和前体细胞的分子方法。该检测基于细胞表面标志物CD71、Ter119以及细胞大小。...

利用CD71/TER119流式细胞术检测鉴定与分析小鼠红系祖细胞

本视频演示了在小鼠眼内玻璃体腔注射后，通过流式细胞术检测小胶质细胞对荧光生物颗粒的摄取。流式细胞术可检测表达 CD11b 的活细胞，并能将表现出绿色荧光的吞噬性小胶质细胞与其他髓系细胞（包括表达 Ly6C 的单核细胞和表达 Ly6G...

使用流式细胞术检测小胶质细胞对玻璃体内递送的荧光颗粒的摄取

本视频展示了一种基于流式细胞术的技术，使用两种荧光染料对人类外周血单个核细胞（PBMCs）中的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞、γδ T 细胞、B...

一种用于鉴定外周血单个核细胞中免疫细胞亚群的流式细胞术检测方法

本方案描述了一种利用多光谱成像流式细胞术鉴定正在脱核的晚幼红细胞群体的新方法，可实现对红细胞脱核过程的可视化观察。...

通过多光谱成像流式细胞术鉴定富含排核事件的小鼠成红细胞亚群

本文介绍了两种用于检测抗红细胞抗体诱导补体活化的检测方法。与现有检测方法相比，其主要优势在于具有定量性且结果易于解读。...

红细胞上抗体诱导补体活化的定量检测方法

单核细胞是人类先天免疫系统的重要组成部分，在活化时依赖糖酵解代谢。本文介绍一种流式细胞术方案，用于检测新鲜全血中总单核细胞及单核细胞亚群的葡萄糖转运蛋白表达和葡萄糖摄取能力。...

一种简单的流式细胞术方法用于检测全血中单核细胞亚群的葡萄糖摄取及葡萄糖转运蛋白表达

小胶质细胞的吞噬作用对于维持组织稳态至关重要，而吞噬功能不足已被认为与多种病理过程相关。然而，评估小胶质细胞功能 体内...

评估视网膜小胶质细胞的吞噬功能 体内 使用基于流式细胞术的检测方法

本文介绍了一种利用成像流式细胞术在混合T细胞群体中检测同种反应性的方法。...

使用成像流式细胞术测量T细胞同种异体反应性

本文描述了一种基于流式细胞术的细胞结合实验，主要用作筛选工具，用于鉴定能够抑制荧光标记的CXC趋化因子配体12（CXCL12）与CXC趋化因子受体4（CXCR4）结合的化合物。...

一种基于流式细胞术的检测方法，用于鉴定可破坏荧光标记的CXC趋化因子配体12与CXC趋化因子受体4结合的化合物

本研究展示了如何使用流式细胞术检测由 FcγR 激活引发的活性氧（ROS）产生。该方法可用于评估吞噬细胞在免疫复合物、调理微生物或直接 FcγR...

流式细胞术检测FcγR交联诱导的巨噬细胞ROS产生

本文介绍一种新型的流式细胞术方法，可直接从新鲜的小鼠骨髓和脾脏中前瞻性分离早期红系爆式集落形成单位（BFU-e）和红系集落形成单位（CFU-e）前体细胞。该实验方案基于单细胞转录组数据开发，是首个能够以高纯度分离出全部组织中红系前体细胞的方法。...

通过流式细胞术从小鼠组织中鉴定与分离红系爆式形成单位和集落形成单位祖细胞

了解如何使用流式细胞术和免疫染色技术测量红细胞CR1受体密度。该方法适用于阿尔茨海默病和系统性红斑狼疮等疾病研究，可精确评估受体表达变化。

使用流式细胞术测定红细胞补体受体1

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