使用BoTest Matrix检测试剂盒从复杂基质中分离和定量肉毒神经毒素

本实验的总体目标是定量检测肉毒神经毒素在药物、环境和食品等复杂基质中的蛋白水解活性。首先，如有必要，对测试样品和标准曲线样品进行处理，以建立适宜的 pH 值和黏度条件。随后，利用抗体包被的磁性微珠从样品中进行肉毒神经毒素的免疫沉淀。

然后用磁珠充分洗涤以去除任何干扰性化合物，并重悬于优化的反应缓冲液中。最后，将洗涤后的磁珠与蛋白报告分子共同孵育，并通过光谱法随时间测定报告分子的切割情况。最终，通过比较测试样品与标准曲线样品中报告分子的切割程度，可定量检测测试样品中肉毒毒素的活性，其灵敏度接近小鼠生物测定法对小鼠的检测水平。

与小鼠生物测定法、免疫学方法及其他荧光方法相比，该技术的主要优势在于无需使用动物，并且已证明可用于食品、环境和药品样品中高度复杂的基质。通常，初次接触该方法的人员可能会因需要精细的样品处理和稀释步骤而遇到困难。本次实验操作将由Bio Sentinel公司的科学家Dr. Mark Dunning进行演示。

根据文本方案配制缓冲液，用于生成标准曲线以定量检测样本；称取10 ± 0.01克固体食品样本，加入50毫升锥形管中，静置备用，该样本将用作稀释液。在另一管中，称取2 ± 0.01克固体食品样本。将肉毒神经毒素（botulinum neurotoxin）或商品化毒素（bought）加入2克食品样本表面，使其终浓度为每克食品含30,000 MLD50。将稀释液样本和加标样本在室温或4°C条件下孵育2小时，使肉毒毒素有足够时间与食品基质相互作用。

模拟自然污染情况，请参考文本方案以获取其他样品类型的详细信息。接下来，向加标和未加标样品中每克食物加入一毫升 GPB，并使用研杵充分研磨直至均匀混合。根据10克稀释样品的近似总体积，推算出两克加标样品的总体积。

然后根据总体系体积，向10克稀释液样品和2克加标样品中各加入十分之一体积的10倍中和缓冲液。通过倒置充分混匀样品，随后在4°C、6,000 × g条件下离心10分钟，对两份样品进行部分澄清。立即小心移除上清液，并转移至新的离心管中：将加标样品记为D1，未加标样品作为稀释液，用于在1.5毫升微量离心管中配制标准曲线的其余样品。

准备固体食物样品时，首先称取 2 ± 0.01 克固体未知样品，置于 50 毫升锥形管中。加入 2 毫升 GPB，并使用研杵充分匀浆样品。接着，向样品中加入相当于其体积 1/10 的 10 × 中和缓冲液，颠倒混匀。随后将样品在 6,000 × g 条件下、4 °C 离心 10 分钟以进行初步澄清，并立即转移至少 750 微升上清液至微量离心管中。

这是未知稀释度一。向两个标记为未知稀释度二和三的试管中各加入675 µL的稀释液。该稀释液应与用于标准曲线生成的经处理样品相同。

取稀释液一，通过将75微升稀释液一转移至稀释二管中并混匀，进行系列稀释。然后将75微升稀释液二转移至稀释三管中并混匀。为澄清样品，以至少14,000 ×g的离心力离心5分钟。

立即移除上清液并转移至新管中，用于设置样品板，向每个未知样品以及标准曲线样品 D1 至 D8 的每孔中加入 20 微升 10× 结合缓冲液（每个需三孔），样品 D9 需六孔。向各对应孔中加入 200 微升每种样品，并使用微量板混匀器混匀 10 秒。以最高速度涡旋振荡 IPA 磁珠 10 秒，或直至完全重悬。

然后将20微升磁珠移液至每个样品孔中，并混匀30秒。将板置于旋转板式孵育器中，在750 RPM、25摄氏度或室温下孵育2小时，随后使用自动板式洗涤仪洗涤板。运行启动程序后，将板放置于板式洗涤仪的96孔磁珠分离板上。

然后运行主洗程序。程序完成后，从洗板机中取出板。向每个样本孔中加入 50 µL 1× 反应缓冲液，并混匀 30 秒。

为了启动bot测试矩阵实验，向每个样本孔中加入50微升0.5微摩尔的AE报告分子。为防止边缘效应，向每个未使用的孔中加入100微升水。使用封板膜密封培养板，避免光照，并在750 RPM、25摄氏度或室温条件下孵育。

每次读数时，将培养板从培养箱中取出。移除封板膜，并立即将培养板置于96孔磁珠分离板上，静置2分钟使磁珠分离。随后将培养板放入酶标仪中，在约434纳米激发光下，检测约470纳米和约526纳米处的发射光信号。

如果需要额外的读数时间点，在微孔板振荡器上将磁珠重悬并振荡30秒后，重新密封微孔板并将其放回培养箱中继续孵育。图中显示的是将霍洛毒素（holo toxin）加入PBS缓冲液后进行检测的实验结果，分别在与AE报告分子共孵育2小时、4小时和24小时后测定。肉毒杆菌毒素（bot）对报告分子的切割作用表现为检测信号比值的下降，该比值由完整报告分子的约2.7降低至完全切割后的约0.7，使用酶标仪测定荧光发射比值进行量化。

不同酶标仪之间的具体数值会有所不同，这从曲线向左偏移可以明显看出；报告分子与样本孵育时间延长会导致报告分子的切割增加。以三复孔检测的数据点显示出较低的平均标准偏差，并符合预期趋势，即随着毒素负荷降低，发射比率升高。若该检测结果未呈现此预期趋势，则可能表明在稀释液制备或数据绘图过程中出现错误。同时，不含A型肉毒毒素的对照组在孵育过程中其发射比率保持稳定，表明不存在非特异性蛋白酶活性。

该图展示了利用标准曲线检测或定量任何未知样品的通用方法，并对药物中的 bot a 样品进行了定量。标准曲线在 PBS 中用纯化的 bot 和全毒素生成，并与从单支 100 单位冻干 Botox 用 0.9% 生理盐水重悬后制备的药物产品稀释液平行处理。在此检测中，标准曲线的线性范围位于发射比值 2.11 至 1.05 之间，图中以虚线框标示。三种落在该线性范围内的未知样品浓度随后通过标准曲线插值确定。

在本实验中，使用新鲜番茄和2%牛奶作为固体和液体食物基质，并添加了由核心空壳、毒素和神经毒素相关蛋白组成的复合物。选择该组合是因为其类似于自然情况下肉毒梭菌污染所产生的毒素，如图所示。在两种基质中均观察到了A型肉毒毒素的回收。

此外，延长与报告分子的孵育时间可提高检测的灵敏度，但未导致无毒素对照组的发射比率下降，表明所观察到的切割反应由肉毒杆菌毒素A引起，而非来自食品中非特异性蛋白酶的残留干扰。本表总结了在各时间点下两种食品的肉毒杆菌毒素A检测限（LOD）、定量限（LOQ）以及EC50值。检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别定义为发射比率低于背景值三个标准差和十个标准差的最低浓度样品。

由于基质效应可能影响毒素与磁珠的结合以及洗涤过程中磁珠的回收率，因此在不同基质中检测限（LOD）和定量限（LOQ）存在一定的基质间差异是可预期的。尽管数据显示2%牛奶中的毒素回收率高于番茄，但这种差异很大程度上是由于番茄样品在GPB中均质化时需要额外稀释所致。除了属于固体食品基质外，番茄还是一种值得注意的样本类型，其pH值和离子强度的调整对检测的成功至关重要。

该图展示了在检测番茄样本时，加入或不加入10倍中和缓冲液的实验反应结果。若未添加缓冲液，则样本中A型肉毒毒素（bot A）的回收率较低，表现为在所有测试浓度的A型肉毒毒素条件下，发射比值保持恒定。然而，加入10倍中和缓冲液后，可实现对毒素的灵敏检测。非特异性蛋白酶可能内源于食品样本，也可能在使用未纯化的A型肉毒毒素制剂（如梭菌培养物上清液）时被引入，这些蛋白酶可切割AE报告分子，导致假阳性结果。本示例使用了一种不再被A型肉毒毒素切割的改良型报告分子，以展示A型肉毒梭菌（Clostridium bot a）培养上清液中存在的非特异性蛋白酶活性。高水平的报告分子切割表明该培养物中存在显著的非特异性蛋白酶活性。

上清液含有显著的蛋白酶活性，加入蛋白酶抑制剂可有效消除该活性。掌握该技术后，根据样本类型和毒素含量，总检测时间可在4至26小时之间完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用基于荧光蛋白报告系统的免疫沉淀方法，从复杂样本中分离并定量肉毒神经毒素。

请注意，操作肉毒杆菌神经毒素可能具有极高危险性，在进行本实验时应采取防护措施，例如佩戴手套、遵守实验室规范，以及使用化学和生物安全柜。