Name: 隔离和肉毒杆菌神经毒素定量从复杂的基质使用BoTest矩阵测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-03T22:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 了解使用BoTest基质测定法从复杂基质中分离和定量肉毒杆菌神经毒素的方法。该技术采用免疫沉淀和荧光蛋白报告系统，适用于食品、环境和药物样品的安全检测。

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作者谨此感谢 H. Olivares 和 D. Ruge 提供的宝贵讨论与建议。本研究部分得到了美国国家科学基金会小型企业创新研究奖（NSF SBIR，项目编号 IIP-1127245，授予 BioSentinel 公司）以及美国国防部合同（项目编号 W81XWH-07-2-0045，授予 BioSentinel 公司）的支持。

1. 检测试剂的制备
<ol>
	<li>在室温（RT）下解冻 200× 二硫苏糖醇（DTT）、10× 基质结合缓冲液（以下简称 10× 结合缓冲液）、10× 中和缓冲液（仅适用于食品或 pH 不平衡样品）和 10× BoTest 反应缓冲液（以下简称 10× 反应缓冲液），时间约为 15 分钟，或直至完全解冻。有关本实验方案所用缓冲液和试剂的列表，请参见表 1。有关本实验方案所需材料和设备的列表，请参见表 2。</li>
	<li>将已解冻的缓冲液涡旋振荡 5 秒以混匀。10× 中和缓冲液、200× DTT 和 10× 反应缓冲液应呈澄清状态，而 10× 结合缓冲液则呈浑浊外观。若 10× 反应缓冲液解冻后仍呈浑浊状，可在 37 °C 下温育 5 分钟后再次涡旋振荡。</li>
	<li>配制 3.8 ml 的 1× 反应缓冲液。
	<ol>
		<li>标记一个 15 ml 锥形管为&#34;1× 反应缓冲液&#34;，加入 3.42 ml 分子生物学级水、380 μl 10× 反应缓冲液和 19 μl 200× DTT。通过反复倒置充分混匀缓冲液。</li>
		<li>使用洁净的刀片将一片不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂片剂切成四等份，并将其中一份加入 1× 反应缓冲液中（剩余部分可于 4 °C 保存以供后续使用）。&#160;注意：若使用纯化的毒素和简单缓冲液（例如 药物样品），可能无需添加蛋白酶抑制剂。</li>
		<li>涡旋振荡 1× 反应缓冲液，直至蛋白酶抑制剂片剂完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 Matrix A 珠（以下简称 IP-A 珠）在室温下预温 20 分钟。</li>
	<li>在避光条件下于室温解冻 BoTest A/E 报告分子（以下简称 A/E 报告分子）。</li>
	<li>标记一个 15 ml 锥形管为&#34;0.5 μM A/E 报告分子&#34;，将 45 μl 的 20 μM A/E 报告分子储备液加入 1.8 ml 1× 反应缓冲液中。通过移液器充分混匀，并置于冰上避光保存。</li>
</ol>
2. 标准曲线样本制备
此处所述的标准曲线范围为每克食物或每毫升缓冲液 10–30,000 mLD50，采用半对数稀释法（表3）。最终使用者可根据实际情况自由选用其他浓度。
<ol>
	<li>加入参考物质并对基质进行孵育。&#160;尽可能使用与待测样本相同基质的稀释液来生成标准曲线，以减少基质效应。若无法获得额外的肉毒神经毒素阴性基质，则可使用明胶磷酸盐缓冲液（GPB）或磷酸盐缓冲液（PBS）作为稀释液。例如 现场或肉毒神经毒素（BoNT）暴发样本检测）。按照以下相应方案，通过将BoNT/A加入所选基质中来生成标准曲线。
	<ol>
		<li>低复杂度样本（例如 PBS、GPB 或药品
		<ol>
			<li>向一个15 ml离心管中加入10 ml适当的缓冲液，备用。该样品将用作标准曲线和未知样品稀释的稀释液（第4节）。</li>
			<li>向微量离心管中加入 1.2 ml 缓冲液。</li>
			<li>警告： 此步骤使用肉毒神经毒素（BoNT），在处理和处置任何与毒素接触的试剂和材料时必须格外谨慎。应根据美国劳工部职业安全与健康管理局（OSHA）关于BoNT的指南（http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html）佩戴个人防护装备，并妥善处置所有材料。向1.2 ml样品中加入BoNT/A，使其终浓度为30,000 mLD50/毫升（36,000 mLD）50 总计。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>液体食品样品（或其他复杂液体样品） 注意：建议先进行初步测试，以确定从澄清样品中回收的上清液体积，因为颗粒物（例如在液体基质中，上清液的体积会有所变化。本方案假设从1.4 ml样品中至少可回收1.2 ml澄清的上清液。如有需要，可增加样品量。
		<ol>
			<li>向15 ml锥形管中加入10 ml液体食物，备用。该样品将用作标准曲线和未知样品稀释的稀释液（第4节）。</li>
			<li>称量一个空的1.5 ml微量离心管，并记录其质量。</li>
			<li>向已称重的微量离心管中加入 1.4 ml 液体食物。</li>
			<li>重新称量微量离心管，通过减去空管的质量计算所添加食物样品的质量。</li>
			<li>警告： 此步骤使用肉毒神经毒素（BoNT），操作过程中须极度谨慎，任何与毒素接触的试剂和材料在处理及处置时均需格外小心。必须根据美国劳工部职业安全与健康管理局（OSHA）关于BoNT的指南（http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html）佩戴个人防护装备，并妥善处置所有相关材料。将BoNT/A加入1.4 ml样品中，使其终浓度为30,000 mLD50/克食物</li>
			<li>将稀释液和加标样品在室温或 4 °C 下孵育 2 小时，使肉毒神经毒素（BoNT）有足够时间与食物基质相互作用，以模拟自然污染情况。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>固体食品样品（或其他固体样品）&#160;注意：建议先进行初步测试，以确定在每克食品加入1 ml GPB后，从匀浆并澄清的样品中可回收的上清液体积。本方案假设从2 g样品中至少可回收1.2 ml澄清上清液。如有必要，可增加样品量。
		<ol>
			<li>称取10 g固体样品至50 ml锥形管中，备用。此样品将用作稀释剂。</li>
			<li>将2 g固体食物样品称量至另一个50 ml锥形管中。</li>
			<li>警告： 此步骤使用肉毒神经毒素（BoNT），在操作和处理任何与该毒素接触的试剂及材料时必须格外谨慎。使用个人防护装备并对所有材料进行妥善处置，必须遵循美国劳工部职业安全与健康管理局（OSHA）关于BoNT的指南（http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html）。将BoNT/A加入2 g样品表面，使其终浓度达到30,000 mLD50/克食物（60,000 总 mLD）50).</li>
			<li>在室温或4 °C下将稀释液和加标样品孵育2小时，使肉毒神经毒素（BoNT）有足够时间与食物基质相互作用，模拟自然污染过程。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品均质化与缓冲液调整。 根据样本类型，对上述加标标准曲线样本和稀释液进行处理。
	<ol>
		<li>低复杂度样本
		<ol>
			<li>无需进一步的样品处理。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>液体食品样品（或其他复杂液体样品）
		<ol>
			<li>无需进行样品匀浆处理。</li>
			<li>向1.4 ml加标样品中加入140 μl 10x中和缓冲液，向10 ml稀释剂样品中加入1 ml 10x中和缓冲液。通过倒置充分混匀样品。</li>
			<li>将两个样品在 6,000 x g、4 °C 条件下离心 10 分钟，部分澄清。立即弃去上清液，并转移至新管中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>固体食品样品（或其他固体样品）
		<ol>
			<li>向2 g添加了BoNT/A的固体食品样品中加入2 ml GPB（1 ml GPB/g 食品），向10 g稀释样品中加入10 ml GPB。</li>
			<li>使用研钵充分研磨样品直至彻底混匀。根据样品性质，可能存在少量无法均质化的细小颗粒，此情况可接受。也可选用机械均质化方法。&#160;不建议使用搅拌器，因为它可能导致毒素失活并产生气溶胶。</li>
			<li>根据稀释样品的近似总体积，向其中加入十分之一体积的10倍浓缩中和缓冲液例如 若体积为20 ml，则取2 ml。推算BoNT/A加标样品的总体积，并加入1/10体积的10×中和缓冲液。通过倒置充分混匀样品。</li>
			<li>将两个样品在 6,000 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟，部分澄清。立即弃去上清液并转移至新管中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备用于检测的标准曲线系列稀释液
	<ol>
		<li>使用含BoNT/A加标的标准曲线样品作为D1，未加标的样品作为稀释液，按照以下步骤在1.5 ml微量离心管中配制其余的标准曲线样品 表3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 准备未知样品
本部分可与第 2 部分并行完成。
<ol>
	<li>确定未知样本的数量和稀释度。 若可能，对未知样本进行三份平行测定。
	<ol>
		<li>对于定性检测，按照下述方法处理样本时，未知样品无需进一步稀释即可进行检测。</li>
		<li>对于定量检测，应按照下述方法至少制备两个1:10稀释的样品，以确保一个或多个样品的检测信号落在检测方法的线性范围内。若可能，应使用与待测样品相同基质的稀释液进行稀释，以减少基质效应，具体参见第3节。否则，使用PBS或GPB作为稀释液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据样本类型制备和稀释未知样本。
	<ol>
		<li>低复杂度未知物（例如 PBS、GPB 或药品
		<ol>
			<li>向微量离心管中加入至少 750 μl 待测样本，制备未知样本稀释液 1。</li>
			<li>向两个标记为“未知样品稀释2”和“未知样品稀释3”的微量离心管中各加入675 μl稀释液。该稀释液应与标准曲线制备中所用的材料相同。</li>
			<li>将75 μl的稀释液1转移至稀释2管中并混匀，进行连续稀释。</li>
			<li>将75 μl的稀释液2转移至稀释3管中并混匀，进行系列稀释。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>未知液体食品（或其他复杂液体样品）&#160;注意：建议进行初步测试，以确定第3节中所述从澄清样品中回收的上清液体积。如有必要，可增加样品量。
		<ol>
			<li>向微量离心管中加入 ≥ 875 μl 液体未知样品。</li>
			<li>向样品中加入1/10体积的10×中和缓冲液（例如 87.5 μl（适用于875 μl样本）。</li>
			<li>以 6,000 × g 离心 10 分钟，4 °C 条件下部分澄清样品。立即转移上清液至新离心管中。此为未知稀释液 1。</li>
			<li>向标记为“未知稀释液2”和“未知稀释液3”的两支试管中各加入675 μl稀释液。稀释液应相同 已处理 用于标准曲线生成的材料</li>
			<li>将75 μl的稀释液1转移至稀释2管中并混匀，进行连续稀释。</li>
			<li>将稀释液2中的75 μl转移至稀释3管中并混匀，对稀释液2进行系列稀释。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>固体食品未知样品（或其他固体样品）&#160;注意：建议先进行初步测试，以确定按第3节所述从澄清样品中回收的上清液体积；必要时增加样品量。
		<ol>
			<li>称取2 g固体未知样品至50 ml锥形管中。</li>
			<li>向2 g固体样品中加入2 ml GPB（每克食物加1 ml GPB）。</li>
			<li>按照所述方法均质化样品 &#160;部分&#160;3.2.3.2.</li>
			<li>根据样品的总体积，加入十分之一体积的10×中和缓冲液例如 0.4 ml，如果体积为 4 ml）。通过倒置充分混匀样品。</li>
			<li>以6,000 × g离心10分钟，4 °C，部分澄清样品。立即转移≥750 μl上清液至微量离心管中。此为未知样品稀释液1。</li>
			<li>向标有“未知稀释度2”和“未知稀释度3”的两支试管中各加入675 ml稀释液。稀释液应相同 已处理 用于标准曲线生成的材料</li>
			<li>将75 μl的稀释液1转移至稀释2管中并混匀，进行连续稀释。</li>
			<li>将75 μl的稀释液2转移至稀释3管中并混匀，进行系列稀释。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 最终样品澄清
若检测液体或固体食品样本，需将所有样本在微量离心机中以 ≥14,000 × g 离心 5 分钟，以充分澄清样本。立即移除上清液并转移至新管中。
5. 培养板设置及BoNT/A下拉
<ol>
	<li>具体的板布局取决于应用；但请勿使用外周孔，以避免边缘效应。每个未知样品和标准曲线样品 D1-D8 需要 3 个孔，而样品 D9 需要 6 个孔。建议的板布局如图 1所示。</li>
	<li>向每个将要使用的孔中加入 20 μl 10x 结合缓冲液。</li>
	<li>向三个孔（D9 为六个孔）中各加入 200 μl 澄清后的稀释液和未知样品，进行三复孔检测。在微孔板混合器上混匀 10 秒。</li>
	<li>加入 IP-A 珠。
	<ol>
		<li>以最高速度涡旋振荡 IP-A 珠 10 秒。如果珠子未完全重悬并形成均一悬浮液，则继续涡旋振荡。</li>
		<li>用移液器向每个样品孔中加入 20 μl IP-A 珠。</li>
		<li>在微孔板混合器上混匀 30 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用旋转式板孵育器在 750 rpm、25 °C 或室温下孵育 2 小时。检测性能高度依赖于在整个孵育过程中生成并维持 IP-A 珠的悬浮状态。每次离心沉淀后，务必使用微孔板混合器重新悬浮珠子，并在所有孵育步骤中使用轨道式微孔板摇床维持悬浮状态。</li>
</ol>
6. 平板洗涤与磁珠重悬
<ol>
	<li>使用手动方法或磁珠兼容&#160;的自动洗板机清洗板。配置用于磁珠的自动洗板机可显著提高检测通量。
	<ol>
		<li>手动洗板
		<ol>
			<li>标记一个50 ml锥形管为&#34;1×洗涤缓冲液&#34;，加入45 ml分子生物学级水和5 ml 10× Matrix洗涤缓冲液。通过倒置充分混匀缓冲液。</li>
			<li>从旋转板孵育器中取出板。</li>
			<li>立即将板置于96孔磁珠分离板上，静置5分钟。</li>
			<li>保持板在96孔磁珠分离板上的同时，使用单通道或多通道移液器小心移除并弃去样本孔中的上清液。不要吸取磁珠——需目视监控移液器吸头中被吸出的液体，防止磁珠意外被移除。若发现磁珠被吸出，应将吸头内容物轻柔地加回孔中，重新分离后再次进行上清移除。</li>
			<li>向每个样本孔中加入300 μl 1×洗涤缓冲液。</li>
			<li>在微孔板混合器上混匀30秒，使磁珠完全重悬。</li>
			<li>将板置于96孔磁珠分离板上孵育2分钟。</li>
			<li>如前所述，移除并弃去样本孔中的上清液。</li>
			<li>重复步骤6.1.1.5–6.1.1.8&#160;共三次，总计完成4次洗涤。</li>
			<li>将板保持在96孔磁珠分离板上，目视检查各孔，确认上清液被均匀移除；必要时使用移液器去除残留的过量缓冲液。部分缓冲液会残留在孔中，操作时需注意避免磁珠被移除或磁珠干燥。</li>
			<li>向每个样本孔中加入50 μl 1×反应缓冲液，并在微孔板混合器上混匀30秒，使磁珠完全重悬。如有需要，可使用移液器辅助使磁珠完全重悬。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>自动洗板
		<ol>
			<li>根据表4设置并编程洗板机。使用高质量（例如纳米纯）水清洗并冲洗洗板机。</li>
			<li>运行程序&#34;Priming&#34;对洗板机进行预冲洗。</li>
			<li>从旋转板孵育器中取出板。</li>
			<li>立即将板放置在洗板机的96孔磁珠分离板上。</li>
			<li>运行程序&#34;Master Wash&#34;。第一个程序步骤为5&#160;分钟的孵育步骤，期间洗板机保持静止。</li>
			<li>程序完成后，将板从洗板机中取出，向每个样本孔中加入50 μl 1×反应缓冲液，并在微孔板混合器上混匀30秒，使磁珠完全重悬。如有需要，可使用移液器辅助使磁珠完全重悬。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 检测启动与孵育
<ol>
	<li>向每个样品孔中加入 50 μl 0.5 μM A/E 报告分子（见第 1 节），并在微量板混合器上混匀 30 秒，以充分重悬珠子。</li>
	<li>向板上每个未使用孔中加入 100 μl 水，以防止边缘效应。</li>
	<li>用封板膜密封板孔，并在 750 rpm、25 °C 或室温条件下，使用旋转孵育仪孵育板。孵育期间需避光。</li>
</ol>
8. 数据收集与分析
注意：该检测为实时检测，可在达到理想灵敏度前多次测量，无需终止试剂。建议初始读取时间分别为孵育2小时、4小时和24小时，检测灵敏度随孵育时间延长而提高。
<ol>
	<li>数据收集
	<ol>
		<li>在每个读数时间点，将微孔板从旋转孵育器中取出，揭去封板膜，立即将微孔板放置于96孔磁珠分离板上，静置2分钟使磁珠完成分离。</li>
		<li>将微孔板放入微孔板读数仪中，在激发波长约为434 nm的条件下，测量发射波长约为470 nm和526 nm处的荧光信号。</li>
		<li>如需进行额外时间点的读数，将磁珠在微孔板振荡器上重悬30秒，重新密封微孔板，并放回旋转孵育器中继续孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>通过将每个样品在526 nm处的相对荧光单位（RFU）值除以470 nm处的RFU值，计算其发射荧光比值。</li>
		<li>以标准曲线数据点的发射比值对[BoNT/A]的对数（log[BoNT/A]）作图。根据所测试的BoNT/A效价范围，将获得一条S型剂量-反应曲线（参见代表性结果）。</li>
		<li>采用可变斜率的S型剂量-反应曲线方程对标准曲线数据进行拟合：Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logEC50-X)*Hillslope))，其中X为浓度的对数，Y为反应信号，曲线从Bottom开始，以S型趋势上升至Top。</li>
		<li>确定检测限（LOD）、定量限（LOQ）以及半数最大有效浓度（EC50）。检测限定义为样品的发射比值低于空白对照组（n = 6）均值3个标准差（SD）的水平；定量限定义为样品的发射比值低于空白对照组均值10个标准差（SD）的水平。EC50由S型剂量-反应曲线拟合得出。</li>
		<li>将未知样品的效价通过S型剂量-反应标准曲线进行插值计算。
		<ol>
			<li>对于定量结果，未知样品的理想情况应落在标准曲线的线性区间内。可通过计算总检测响应范围的20%-80%来估算标准曲线的线性区间（例如，若标准曲线的发射比值范围为0.5–2.5，则线性范围为0.9–2.1之间的部分）。</li>
			<li>对于定性结果，将未知样品的比值与标准曲线的LOD和LOQ进行比较。</li>
			<li>不得将未知样品的测定结果外推至标准曲线范围之外。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

F. M. Dunning、T. M. Piazza、F. Zeytin 和 W. C. Tucker 是 BioSentinel 公司的员工或所有者。&#160;BioSentinel 目前正在生产并已将本报告中所述的部分试剂商业化。

本方案描述了在复杂基质中定量测定肉毒杆菌神经毒素/A（BoNT/A）复合物、全毒素或Clostridium培养上清液的操作步骤。当使用相应的基质检测试剂盒检测其他BoNT血清型（例如 BoNT/B、E和F）时，操作流程相同56,60，但不同血清型和检测试剂盒之间的检测灵敏度可能存在差异。本方案未涵盖所有可能的样本类型，具体样本组成和预期用途可能需要对方案进行某些调整。基质可包括食品样本（例如 食品挑战试验）或药物辅料缓冲液（例如 基于BoNT的药品检测）。复杂的非食品类（例如 动物组织或环境）液体和固体样本应参照食品样本处理。本方案采用每孔200 μl的样本体积，但每孔低至50 μl的样本也可检测，只需相应调整10倍结合缓冲液的体积。小于50 μl的样本应在检测前用GPB或PBS稀释至≥50 μl。
食品成分的高度变异性为食品中肉毒神经毒素（BoNT）的检测与定量带来了特殊挑战。样品的pH值、黏度、离子强度以及颗粒物的存在均可能影响毒素在食品基质中的活性，因此必须将毒素从...

肉毒神经毒素（BoNTs）是已知最致命的物质，其静脉注射的人类致死剂量估计为1-3 ng/kg1,2存在七种结构相似的肉毒神经毒素血清型，分别标记为A至G型，每种均由一个负责细胞结合、摄取及转位至胞质的重链结构域和一个编码锌依赖性内肽酶的轻链组成3-5肉毒神经毒素（BoNT）的强烈毒性部分源于其在神经肌肉接头处特异性结合并进入运动神经元的能力。6进入神经元后，轻链内肽酶特异性切割可溶性的 N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）蛋白，该蛋白参与囊泡融合过程，抑制神经递质释放，导致弛缓性麻痹7-14通常称为该疾病 &#34;肉毒中毒&#34; 膈肌和肋间肌因肉毒毒素（BoNT）作用而发生麻痹，最终会导致呼吸衰竭和死亡，除非得到早期诊断和治疗。
人类食源性肉毒中毒最常与肉毒毒素血清型 A、B、E 和 F（BoNT/A、BoNT/B，等）相关，通常由摄入受污染的食物引起15,16；尽管也有数例报道发生于静脉吸毒者中的伤口型肉毒中毒17,18。在美国，婴儿肉毒中毒是肉毒中毒最常见的形式，由一岁以下婴幼儿摄入Clostridium（梭菌）孢子所致19-21。然而，在美国及国外均曾报道因家庭罐头加工或食品处理不当引发的食源性肉毒毒素暴发事件。2000 至 2009 年间，全球共报告至少 338 例食源性肉毒中毒病例，其中包括 6 例死亡22。快速且灵敏地检测食源性肉毒中毒暴发的能力，是实现早期诊断的关键指标23,24。此外，能够实现低成本和常规食品检测的检测方法将有助于提升食品安全水平。
肉毒杆菌神经毒素（BoNT）的神经元特异性和较长的生物半衰期也使其成为一种有效的治疗剂。在美国，基于BoNT的药物已获得食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗多种美容适应症及神经肌肉相关疾病，包括眉间纹、颈肌张力障碍、偏头痛、膀胱过度活动症和斜视。此外，已有大量&#34;超说明书使用&#34;的记录，包括高剂量治疗严重肌肉功能障碍25-28。准确的毒素定量对于正确给药至关重要，因为剂量不足可能导致治疗无效，而剂量过高则会使患者面临潜在有害副作用的风险。然而，目前各生产商之间并未统一使用标准化的效价测定方法，导致基于BoNT的药品在单位定义上存在不一致29-31。
检测肉毒神经毒素（BoNT）的标准方法是小鼠生物测定法，即将含BoNT的样品腹腔注射至小鼠体内，记录1至7天内的死亡数量。16,32,33小鼠生物测定法的检测限（LOD）为5-10 pg BoNT/A，具有很高的灵敏度34然而，由于使用动物引发的伦理问题、培训人员和维护动物设施的高昂成本、检测周期长以及缺乏标准化操作规程，人们呼吁开发标准化的、无需使用动物的肉毒神经毒素检测与定量方法35-39最近，已开发出几种替代性的肉毒神经毒素（BoNT）定量方法，这些方法具有与小鼠生物测定法相近或相当的灵敏度40-49这些方法通常采用荧光、质谱或免疫学技术，检测时间显著短于小鼠生物测定法，且无需使用动物。结合免疫学技术的质谱方法已被证明可检测并定量食品及其他复杂样本中的肉毒神经毒素（BoNT）；然而，这些方法受限于对专业人员培训的要求以及对专用设备的需求。50-55大多数其他替代检测方法难以直接适用于复杂样品的检测，或缺乏常规肉毒毒素检测所需的通量。食品样品在黏度、pH值、盐含量及基质成分方面的高度变异性，在开发此类检测方法时尤其构成严峻挑战。 体外 检测方法需具备与 BoNT 极高活性相匹配的灵敏度。此外，即便是简单且相对温和的缓冲体系，例如由基于 BoNT 的药品制剂重悬所产生的缓冲体系，也含有盐、白蛋白和糖类稳定剂。即 辅料）对产品具有显著影响 体外 BoNT 毒性效价56毒素纯化对于除最简单样本外的所有样品的准确活性检测都是必需的56-59.
BoTest Matrix 检测方法旨在利用研究实验室中常见的设备，对高度复杂的样品中的肉毒神经毒素（BoNT）进行快速、高通量且一致的定量分析56,60。该方法采用共价连接了血清型特异性抗-BoNT 抗体的顺磁性微珠，从样品中结合并富集 BoNT，再通过洗涤步骤去除干扰性的基质成分。洗涤后，在优化的反应缓冲液中，利用与待测 BoNT 血清型相匹配的报告分子来定量检测结合态 BoNT 的蛋白酶活性。这些报告分子为荧光蛋白，由 N 端的青色荧光蛋白（CFP）片段和 C 端的黄色荧光蛋白衍生物（Venus）片段组成，两者之间通过 BoNT 的底物连接：BoTest A/E 或 B/D/F/G 报告分子分别包含 SNAP25 的第 141–206 位残基或突触小泡相关蛋白（synaptobrevin）的第 33–94 位残基45。BoNT 对报告分子的切割作用通过荧光共振能量转移（FRET）进行监测。当报告分子完整时，激发 CFP 会引起向 Venus 的 FRET，从而淬灭 CFP 的发射信号并激发 Venus 的发射信号；而 BoNT 切割报告分子后，FRET 被阻断，导致 CFP 发射信号增强，Venus 发射信号减弱。因此，可通过 CFP 与 Venus 发射信号的比值对 BoNT 活性进行定量测定。采用高通量 96 孔板格式时，多种食品样品中 BoNT 的检测限可低于 3 pg56。由于该方法允许毒素在微珠表面富集，使用更大体积的样品可进一步提高检测灵敏度。
用于检测A、B、E和F型肉毒神经毒素的BoTest Matrix检测试剂盒已在食品、药品和环境样本中完成开发与验证56,60. 本文描述了用于在低复杂性样本中检测肉毒神经毒素（BoNT）的这些检测方法的操作步骤例如 药物，缓冲液中的BoNT）和高复杂性（例如 食品、环境样本。本方案中介绍了多种样本类型的特定处理方法，未在此详述的样本类型通常也可通过组合使用本方案所述方法进行适配。该方案以肉毒神经毒素A型（BoNT/A）为基础开发并验证，但如其他研究已证实的那样，通过采用相应的检测方法，本方案也可适用于其他BoNT血清型。56,60.

<table><tbody><tr><td>BoTest Matrix A 肉毒杆菌神经毒素检测试剂盒</td><td>BioSentinel</td><td>A1015</td><td>适用于 BoNT/B 和 F 的检测试剂盒也可提供。</td></tr><tr><td>Varioskan Flash 荧光酶标仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5250040</td><td>大多数基于单色器或滤光片、具备 434 nm 激发光以及 470 nm 和 526 nm 发射光检测能力的仪器均可使用。</td></tr><tr><td>96 孔磁珠分离板</td><td>V&amp;P Scientific</td><td>VP771H</td><td>可使用其他磁性板，但该板应设计为能将磁珠分离至孔的一侧。</td></tr><tr><td>兼容磁珠的酶标板洗板机</td><td>BioTek</td><td>ELx405 VSRM</td><td>可选，仅在需要自动化洗板时使用。&amp;nbsp; 其他兼容磁珠的洗板机也可使用，但使用前应进行测试。</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td></td><td></td><td>可选，仅在样品需要离心时使用。</td></tr><tr><td>MixMate 酶标板混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>22674200</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td></td><td></td><td>在室温或 25 &amp;deg;C 下使用，若具备温度控制功能</td></tr><tr><td>无 EDTA 蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>仅在食品或环境样本检测时需要。蛋白酶抑制剂必须不含 EDTA。</td></tr><tr><td>BoNT/A</td><td>Metabiologics</td><td></td><td>可选，仅用于标准化和定量目的</td></tr><tr><td>黑色平底 96 孔板</td><td>NUNC</td><td>237105</td><td>板不应经过表面处理</td></tr><tr><td>96 孔板封板膜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr></tbody></table>

使用botest matrix检测试剂盒从复杂基质中分离和定量肉毒神经毒素

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

在复杂基质中准确检测和定量肉毒神经毒素（BoNT）对于药品、环境和食品样品的检测至关重要。在疫情溯源、患者诊断以及食品安全检测过程中，需要对食品中的BoNT进行快速检测；同时，在基于BoNT的药品生产及保障患者安全方面，也必须进行准确的效价测定。目前广泛使用的BoNT检测小鼠生物测定法虽具有高灵敏度，但缺乏快速和常规BoNT检测所需的精确性和通量。此外，由于该生物测定法涉及动物使用，美国及国际上的药品监管机构和动物权益倡导者已呼吁以替代方法取代小鼠生物测定法用于BoNT检测。已有多种 体外 替代性检测方法已在简单缓冲液中对纯化的肉毒神经毒素（BoNT）展现出良好效果，但大多数方法尚未证明可用于高度复杂基质中的检测。本文介绍了一种利用BoTest Matrix检测试剂盒在复杂基质中检测BoNT的实验方案。该检测包括三个部分：第一部分为样品的检测前处理；第二部分为免疫沉淀步骤，使用包被抗BoNT抗体的顺磁性微珠从基质中纯化BoNT；第三部分通过荧光报告分子定量所分离BoNT的蛋白水解活性。本方案适用于96孔板的高通量检测，可处理液体和固体基质样品，需约2小时的手动操作时间，总检测时间根据样品类型、毒素载量及所需灵敏度的不同，约为4至26小时。文中提供了BoNT/A在磷酸盐缓冲液、药品制剂、培养上清液、2%牛奶和新鲜番茄中的检测数据，并讨论了影响检测成功的关键参数。

肉毒神经毒素，免疫沉淀，荧光报告分子，复杂基质，蛋白水解活性，高通量检测，BoTest Matrix

图 2 展示了所述实验方案步骤的示意图。图 2。该检测所需时间根据样本类型和所需的检测灵敏度而定，介于 4 至 26 小时之间，但实际操作时间仅需约 2 小时。检测在 96 孔板中进行，根据检测类型的不同，每块板可对最多 20 个样本（包括标准品）进行三复孔检测。
图3展示了使用在PBS中添加的BoNT/A全毒素，并按照所述方案与A/E报告分子分别孵育2、4和24小时后的代表性检测结果。本实验选用纯化的BoNT/A全毒素，因其分子量明确（约150 kDa），相较于毒素复合物较宽泛的700–900 kDa范围，且纯度较高，可实现精确浓度的准确添加。每个时间点的发射比值（在434 nm激发后，526 nm与470 nm处发射光强度的比值）随BoNT/A浓度作图（mLD50值基于BoNT/A生产商的效价测定结果）。BoNT对报告分子的切割作用表现为发射比值的降低，在本实验所用酶标仪上，完整报告分子的发射比值约为2.7，完全切割后的比值约为0.7。需要注意的是，由于不同酶标仪检测荧光信号的单位为相对荧...

BoTest Matrix 肉毒神经毒素（BoNT）检测试剂可快速从多种样本基质中纯化并定量 BoNT。&#160;本文介绍了一种从固体和液体基质中检测和定量 BoNT 的实验方案，并以 BOTOX、番茄和牛奶为例演示了该检测方法。

使用BoTest Matrix检测试剂盒从复杂基质中分离和定量肉毒神经毒素

在制药、环境和食品样本等复杂基质中，准确检测和定量肉毒神经毒素（BoNT）是必要的……

本实验的总体目标是定量检测肉毒神经毒素在药物、环境和食品等复杂基质中的蛋白水解活性。首先，如有必要，对测试样品和标准曲线样品进行处理，以建立适宜的 pH 值和黏度条件。随后，利用抗体包被的磁性微珠从样品中进行肉毒神经毒素的免疫沉淀。然后用磁珠充分洗涤以去除任何干扰性化合物，并重悬于优化的反应缓冲液中。最后，将洗涤后的磁珠与蛋白报告分子共同孵育，并通过光谱法随时间测定报告分子的切割情况。最终，通过比较测试样品与标准曲线样品中报告分子的切割程度，可定量检测测试样品中肉毒毒素的活性，其灵敏度接近小鼠生物测定法对小鼠的检测水平。与小鼠生物测定法、免疫学方法及其他荧光方法相比，该技术的主要优势在于无需使用动物，并且已证明可用于食品、环境和药品样品中高度复杂的基质。通常，初次接触该方法的人员可能会因需要精细的样品处理和稀释步骤而遇到困难。本次实验操作将由Bio Sentinel公司的科学家Dr. Mark Dunning进行演示。根据文本方案配制缓冲液，用于生成标准曲线以定量检测样本；称取10 ± 0.01克固体食品样本，加入50毫升锥形管中，静置备用，该样本将用作稀释液。在另一管中，称取2 ± 0.01克固体食品样本。将肉毒神经毒素（botulinum neurotoxin）或商品化毒素（bought）加入2克食品样本表面，使其终浓度为每克食品含30,000 MLD50。将稀释液样本和加标样本在室温或4°C条件下孵育2小时，使肉毒毒素有足够时间与食品基质相互作用。模拟自然污染情况，请参考文本方案以获取其他样品类型的详细信息。接下来，向加标和未加标样品中每克食物加入一毫升 GPB，并使用研杵充分研磨直至均匀混合。根据10克稀释样品的近似总体积，推算出两克加标样品的总体积。然后根据总体系体积，向10克稀释液样品和2克加标样品中各加入十分之一体积的10倍中和缓冲液。通过倒置充分混匀样品，随后在4°C、6,000 × g条件下离心10分钟，对两份样品进行部分澄清。立即小心移除上清液，并转移至新的离心管中：将加标样品记为D1，未加标样品作为稀释液，用于在1.5毫升微量离心管中配制标准曲线的其余样品。准备固体食物样品时，首先称取 2 ± 0.01 克固体未知样品，置于 50 毫升锥形管中。加入 2 毫升 GPB，并使用研杵充分匀浆样品。接着，向样品中加入相当于其体积 1/10 的 10 × 中和缓冲液，颠倒混匀。随后将样品在 6,000 × g 条件下、4 °C 离心 10 分钟以进行初步澄清，并立即转移至少 750 微升上清液至微量离心管中。这是未知稀释度一。向两个标记为未知稀释度二和三的试管中各加入675 µL的稀释液。该稀释液应与用于标准曲线生成的经处理样品相同。取稀释液一，通过将75微升稀释液一转移至稀释二管中并混匀，进行系列稀释。然后将75微升稀释液二转移至稀释三管中并混匀。为澄清样品，以至少14,000 ×g的离心力离心5分钟。立即移除上清液并转移至新管中，用于设置样品板，向每个未知样品以及标准曲线样品 D1 至 D8 的每孔中加入 20 微升 10× 结合缓冲液（每个需三孔），样品 D9 需六孔。向各对应孔中加入 200 微升每种样品，并使用微量板混匀器混匀 10 秒。以最高速度涡旋振荡 IPA 磁珠 10 秒，或直至完全重悬。然后将20微升磁珠移液至每个样品孔中，并混匀30秒。将板置于旋转板式孵育器中，在750 RPM、25摄氏度或室温下孵育2小时，随后使用自动板式洗涤仪洗涤板。运行启动程序后，将板放置于板式洗涤仪的96孔磁珠分离板上。然后运行主洗程序。程序完成后，从洗板机中取出板。向每个样本孔中加入 50 µL 1× 反应缓冲液，并混匀 30 秒。为了启动bot测试矩阵实验，向每个样本孔中加入50微升0.5微摩尔的AE报告分子。为防止边缘效应，向每个未使用的孔中加入100微升水。使用封板膜密封培养板，避免光照，并在750 RPM、25摄氏度或室温条件下孵育。每次读数时，将培养板从培养箱中取出。移除封板膜，并立即将培养板置于96孔磁珠分离板上，静置2分钟使磁珠分离。随后将培养板放入酶标仪中，在约434纳米激发光下，检测约470纳米和约526纳米处的发射光信号。如果需要额外的读数时间点，在微孔板振荡器上将磁珠重悬并振荡30秒后，重新密封微孔板并将其放回培养箱中继续孵育。图中显示的是将霍洛毒素（holo toxin）加入PBS缓冲液后进行检测的实验结果，分别在与AE报告分子共孵育2小时、4小时和24小时后测定。肉毒杆菌毒素（bot）对报告分子的切割作用表现为检测信号比值的下降，该比值由完整报告分子的约2.7降低至完全切割后的约0.7，使用酶标仪测定荧光发射比值进行量化。不同酶标仪之间的具体数值会有所不同，这从曲线向左偏移可以明显看出；报告分子与样本孵育时间延长会导致报告分子的切割增加。以三复孔检测的数据点显示出较低的平均标准偏差，并符合预期趋势，即随着毒素负荷降低，发射比率升高。若该检测结果未呈现此预期趋势，则可能表明在稀释液制备或数据绘图过程中出现错误。同时，不含A型肉毒毒素的对照组在孵育过程中其发射比率保持稳定，表明不存在非特异性蛋白酶活性。该图展示了利用标准曲线检测或定量任何未知样品的通用方法，并对药物中的 bot a 样品进行了定量。标准曲线在 PBS 中用纯化的 bot 和全毒素生成，并与从单支 100 单位冻干 Botox 用 0.9% 生理盐水重悬后制备的药物产品稀释液平行处理。在此检测中，标准曲线的线性范围位于发射比值 2.11 至 1.05 之间，图中以虚线框标示。三种落在该线性范围内的未知样品浓度随后通过标准曲线插值确定。在本实验中，使用新鲜番茄和2%牛奶作为固体和液体食物基质，并添加了由核心空壳、毒素和神经毒素相关蛋白组成的复合物。选择该组合是因为其类似于自然情况下肉毒梭菌污染所产生的毒素，如图所示。在两种基质中均观察到了A型肉毒毒素的回收。此外，延长与报告分子的孵育时间可提高检测的灵敏度，但未导致无毒素对照组的发射比率下降，表明所观察到的切割反应由肉毒杆菌毒素A引起，而非来自食品中非特异性蛋白酶的残留干扰。本表总结了在各时间点下两种食品的肉毒杆菌毒素A检测限（LOD）、定量限（LOQ）以及EC50值。检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别定义为发射比率低于背景值三个标准差和十个标准差的最低浓度样品。由于基质效应可能影响毒素与磁珠的结合以及洗涤过程中磁珠的回收率，因此在不同基质中检测限（LOD）和定量限（LOQ）存在一定的基质间差异是可预期的。尽管数据显示2%牛奶中的毒素回收率高于番茄，但这种差异很大程度上是由于番茄样品在GPB中均质化时需要额外稀释所致。除了属于固体食品基质外，番茄还是一种值得注意的样本类型，其pH值和离子强度的调整对检测的成功至关重要。该图展示了在检测番茄样本时，加入或不加入10倍中和缓冲液的实验反应结果。若未添加缓冲液，则样本中A型肉毒毒素（bot A）的回收率较低，表现为在所有测试浓度的A型肉毒毒素条件下，发射比值保持恒定。然而，加入10倍中和缓冲液后，可实现对毒素的灵敏检测。非特异性蛋白酶可能内源于食品样本，也可能在使用未纯化的A型肉毒毒素制剂（如梭菌培养物上清液）时被引入，这些蛋白酶可切割AE报告分子，导致假阳性结果。本示例使用了一种不再被A型肉毒毒素切割的改良型报告分子，以展示A型肉毒梭菌（Clostridium bot a）培养上清液中存在的非特异性蛋白酶活性。高水平的报告分子切割表明该培养物中存在显著的非特异性蛋白酶活性。上清液含有显著的蛋白酶活性，加入蛋白酶抑制剂可有效消除该活性。掌握该技术后，根据样本类型和毒素含量，总检测时间可在4至26小时之间完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用基于荧光蛋白报告系统的免疫沉淀方法，从复杂样本中分离并定量肉毒神经毒素。请注意，操作肉毒杆菌神经毒素可能具有极高危险性，在进行本实验时应采取防护措施，例如佩戴手套、遵守实验室规范，以及使用化学和生物安全柜。

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