隔离和肉毒杆菌神经毒素定量从复杂的基质使用BoTest矩阵测定

该程序的总体目标是量化肉毒杆菌神经毒素在复杂基质（如药物、环境和食品样品）中的蛋白水解活性。这是通过首先处理测试和标准曲线样品（如有必要）来建立合适的 pH 值和粘度条件来实现的。接下来，使用抗体包被的磁珠从样品中免疫沉淀肉毒杆菌神经毒素。

然后彻底洗涤磁珠以去除任何干扰化合物，并重悬于优化的反应缓冲液中。最后，将洗涤的磁珠与蛋白质报告基因一起孵育，并在光谱下测量报告基因随时间推移的切割。最终，将测试样品中的报告基因切割与标准曲线样品进行比较，以小鼠至接近小鼠的生物测定灵敏度量化测试样品中肉毒杆菌毒素的活性。

与其他方法（如小鼠、生物测定、免疫学和其他荧光方法）相比，该技术的主要优点是该测定不需要使用动物，并且已被证明可用于食品、环境和药物样品中发现的高度复杂的基质。一般来说，刚接触这种方法的人可能会很困难，因为需要仔细的样品处理和稀释。演示此程序的是 Bio Sentinel 的科学家 Mark Dunning 博士。

根据文本方案制备缓冲液，生成用于定量测试样品的标准曲线，称取 10 个正负 0.01 克固体食品样品放入 50 毫升锥形管中，并放在一边，该样品将用作第二管中的稀释剂，称取两个正负 0.01 克固体食品样品。将肉毒杆菌神经毒素或购买到两克食物样品的表面，使每克食物的最终浓度为 30， 000 MLD 50。将稀释剂和加标样品在室温或 4 摄氏度下孵育 2 小时，让机器人有时间与食物基质互动。

模拟自然污染，请参阅文本实验方案了解其他样品类型。接下来，向加标和 uns 加标样品中加入每克食物 1 毫升 GPB，并使用研杵匀浆直至完全混合。从 10 g 稀释剂样品的近似总体积中推断出 2 g 机器人加标样品的总体积。

然后将 10 倍体积的 10 倍中和缓冲液添加到 10 克稀释剂样品中，并根据其总体积购买 2 克加标样品。通过倒置将样品充分混合，通过在 6， 000 倍重力和 4 摄氏度下离心 10 分钟，部分澄清两个样品。然后立即去除上清液并转移到新试管中，使用机器人将加标样品作为 D 1，将非加标样品作为稀释剂，在 1.5 mL 微量离心管中生成剩余的标准曲线样品。

要制备固体食品样品，首先称取 2 个正负 0.01 克未知固体样品放入 50 毫升锥形管中。加入两毫升 GPB 并使用研杵匀浆样品。接下来，向样品中加入 10 倍体积的 10 x 中和缓冲液，并在 6， 000 倍重力和 4 摄氏度下离心 10 分钟，使样品部分澄清后倒置混匀，立即将至少 750 μL 上清液转移到微量离心管中。

这是未知的稀释一。将 675 μL 稀释剂加入两个标有未知稀释度 2 和 3 的试管中。稀释剂将与用于生成标准曲线的相同加工材料。

使用稀释液 1 进行连续稀释，方法是将 75 微升稀释液 one 转移到稀释液 2 管中并混合。然后将 75 微升稀释液 2 转移到稀释液 3 管中并混合。为了澄清样品，将它们离心至少 5 分钟 14， 000 次。重力。

立即去除上清液并转移到新试管中，为样品设置板，向每个孔中加入 20 微升 10 x 结合缓冲液，每个未知样品和标准弯曲样品 D 1 至 D 8 需要 3 个孔，样品 D 9 需要 6 个孔。将 200 μL 每个样品添加到相应的孔中，并使用微孔板混合器混合板 10 秒钟。以最高速度涡旋 IPA 微珠 10 秒，或直至完全重悬。

然后将 20 微升磁珠移液到每个样品孔中，并将板混合 30 秒。将板在旋转板培养箱中以 750 RPM 和 25 摄氏度或室温孵育 2 小时，以使用自动洗板机清洗板。运行 prime 程序后，将板放在洗板机上的 96 孔磁珠分离板上。

然后运行 master wash 程序。程序完成后，从垫圈中取出板。向每个样品孔中加入 50 μL 的 1 x 反应缓冲液，混合 30 秒。

要开始 bot 测试基质测定，请添加 50 μL 0.5 μmol AE 报告基因。为防止边缘效应，向每个样品孔中加入 100 微升未使用的水。使用天花板胶带密封板，避光并在 750 RPM 和 25 摄氏度或室温下孵育。

每次读取时，从培养箱中取出板。撕下吊带，立即将板放在 96 孔磁珠分离板上，让磁珠分离两分钟。将板放入酶标仪中，在约 470 纳米激发下测量约 526 纳米和约 434 纳米的发射。

如果需要额外的读取时间，在微孔板混合器上将微珠悬浮 30 秒后，重新密封板并将其放回培养箱中。此处显示的是使用机器人将全息香浑溶酶加标到 PBS 中，并在与 AE 报告基因孵育 2 小时、4 小时和 24 小时后进行测试的检测结果。机器人对报告基因的切割是通过我们的读板器测量的发射比的减少，完整报告基因约为 2.7，完全切割的报告基因约为 0.7。

板机之间的特定值会有所不同，如曲线的左移所示，与报告基因的孵育时间延长会导致报告基因切割增加。一式三份测试的数据点显示平均值的低标准差，并遵循排放率增加和毒素载量减少的预期趋势。测定未能遵循这一预期趋势可能表明稀释生成过程中存在错误，或者绘制不含机器人 A 的对照的发射比率的数据在孵育过程中也保持稳定，表明缺乏非特异性蛋白酶活性。

该图展示了用于根据标准曲线检测或定量任何未知样品并定量制药机器人样品的通用方法。在该测定中，使用纯化的机器人、全息肉毒杆菌在 PBS 中生成标准曲线，并与由单个 100 单位小瓶在 0.9% 盐水中再水化的冻干肉毒杆菌毒素产生的药品稀释液平行处理，标准曲线的线性部分介于 2.11 和 1.05 的发射比之间，由图中的虚线框表示。然后从标准曲线对落在此线性范围内的三种未知物的浓度进行插值。

在本实验中，新鲜西红柿和 2% 牛奶用作固体和液体食品基质，并加入 bot，这是一种由核心 hollo、toin 和神经毒素相关蛋白组成的复合物。之所以选择这种组合，是因为它类似于天然梭菌污染过程中产生的毒素，如图所示。在两种基质中都观察到机器人 A 的恢复。

此外，与报告基因的孵育时间增加会增加检测灵敏度，但不会导致无毒素对照的发射率降低，这表明观察到的切割结果来自机器人 A，而不是检测中食物中的非特异性蛋白酶携带。下表总结了所示每个时间点两种食物的机器人 A-L-O-D-L-O-Q 和 EC 50。LOD 和 LOQ 定义为排放比分别低于背景 3 和 10 个标准差的最低浓度样品。

LOD 和 LOQ 存在一些基质间差异，因为基质效应可能会影响毒素与微珠的结合以及洗涤过程中微珠的回收率。虽然从数据中可以看出，2% 牛奶的毒素回收率高于西红柿，但这种差异在很大程度上是由于在 GPB 中均质化番茄样品所需的额外稀释造成的。除了是一种固体食物基质外，西红柿还是一种值得注意的样品类型，其中 pH 值和离子强度的调整对于检测成功至关重要。

该图说明了在检测含有或不含有 10 x 中和缓冲液的番茄时的检测反应。未添加缓冲液会导致 bot A 从样品中回收率差，并且通过添加 10 x 中和缓冲液的所有测试的 bot A 浓度的恒定发射比来证明，但是，会导致敏感的毒素检测，非特异性蛋白酶可能是食品样品的内源性或在使用未纯化的 bot 制剂（如梭状芽胞杆菌培养物）时引入的， 上清液，并可能裂解 AE 报告基因，导致假阳性结果。本例展示了梭状芽胞杆菌机器人（一种培养物上清液）中发现的非特异性蛋白酶活性，该上清液使用不再被机器人 A 切割的修饰报告基因

上清液含有显著的蛋白酶活性，添加蛋白酶抑制剂可有效抵消其活性。掌握后，该技术可在 4 至 26 小时的总检测时间内完成，具体取决于样品类型和毒素载量。观看本视频后，您应该对如何在基于荧光的蛋白质报告基因系统中使用免疫沉淀从复杂样品中分离和定量肉毒杆菌神经毒素有很好的了解。

不要忘记，使用肉毒杆菌神经毒素可能非常危险，因此在执行此程序时应采取预防措施，例如手套、实验室代码以及化学和生物安全柜。