一种基于微珠的多重免疫检测，用于定量多种细胞因子靶标

取一个底部带有过滤器的多孔板。

添加含有不同细胞因子的测试样品。

添加按大小和内部荧光强度区分的不同微球组。

每组都与靶向特定细胞因子的抗体偶联。

鼓动下在黑暗中孵育板。

抗体与其靶细胞因子结合，将它们固定在微球上。

应用真空以去除未结合的细胞因子。由于膜的孔径较小，微球结合的细胞因子被保留。

添加与微球结合的细胞因子结合的生物素偶联检测抗体混合物。

加入荧光报告偶联链霉亲和素，并在搅拌下在黑暗中孵育。链霉亲和素与生物素结合，将报告基因固定在微球复合物上。

去除未结合的分子并重悬微球。

使用流式细胞术，通过确定微球的大小和内部荧光来识别结合的细胞因子。

要确定特定细胞因子的量，请测量报告基因的荧光强度。

要进行测定，请在使用前让所有试剂加热至室温。

本演示中使用了聚丙烯滤板。在整个测定过程中（包括清洗步骤）保持板直立是绝对必要的，以避免丢失珠子。

通过向每个孔中加入 100 微升 1x 洗涤缓冲液来预润湿滤纸，并让板在室温下静置 1 分钟。使用真空歧管去除缓冲液体积。将板压在一叠干净的纸巾上，从板底部吸干多余的洗涤缓冲液。然后将板放在倒置的板盖上。

对于细胞培养上清液样品，向所有孔中加入 25 微升测定缓冲液。向标准孔中加入 25 微升每种标准品。最后，将每个样品的 25 微升添加到样品孔中。涡旋混合的珠子 30 秒。然后，向每个孔中加入 25 微升混合珠子，间歇性摇动珠子瓶以避免珠子沉淀。

用封板机密封板。密封后，用铝箔包裹整个板，包括倒置的板盖。将板放在摇板器上，固定好，在室温下以约 500 RPM 摇动两小时。在不倒置的情况下，将板放在真空歧管上并像以前一样施加真空。然后，向每个孔中加入 200 微升 1x 洗涤缓冲液。

通过真空过滤去除测定板孔中的内容物。在再次重复此步骤之前，用吸水垫或纸巾吸干板底部多余的洗涤缓冲液。接下来，向每个孔中加入 25 微升检测抗体。用新鲜的封板机密封板材后，用铝箔包裹整个板材，包括倒置的板盖。

将板放在摇板器上，在室温下以约 500 RPM 摇动 1 小时。在不抽真空的情况下，将 25 微升链霉亲和素藻红蛋白试剂直接添加到每个孔中。像以前一样密封并包裹盘子。然后。将板放在摇板器上，在室温下以约 500 RPM 摇动 30 分钟。

重复真空过滤步骤两次后，向每个孔中加入 200 微升 1x 洗涤缓冲液。将珠子重悬于摇床上 1 分钟。使用多通道移液器，将样品从滤板转移到FACS管中，以便在流式细胞仪上读取样品。