一种基于微球的多重免疫检测法用于定量多种细胞因子靶标

取一个底部带有滤膜的多孔板。

加入含有不同细胞因子的测试样本。

添加不同组的微球，这些微球通过大小和内部荧光强度进行区分。

每组均偶联了一种靶向特定细胞因子的抗体。

在避光条件下振荡孵育该板。

抗体与其靶向的细胞因子结合，将它们固定在微球上。

施加真空以去除未结合的细胞因子。由于膜的孔径较小，与微球结合的细胞因子得以保留。

加入与微球结合的细胞因子结合的生物素标记检测抗体混合物。

加入荧光报告分子偶联的链霉亲和素，在避光、振荡条件下孵育。链霉亲和素与生物素结合，使报告分子固定在微球复合物上。

去除未结合的分子并重悬微球。

通过流式细胞术，测定微球的大小和内部荧光，从而鉴定结合的细胞因子。

为了确定特定细胞因子的含量，需测量报告分子的荧光强度。

进行检测前，需将所有试剂恢复至室温。

本实验演示中使用聚丙烯滤板。在整个检测过程中，包括洗涤步骤，必须始终保持滤板直立，以避免磁珠丢失。

向每个孔中加入 100 微升 1× 洗涤缓冲液，预润滤纸，室温下静置 1 分钟。使用真空 manifold 去除缓冲液体积。将平板压在干净的纸巾堆上，吸去底部多余的洗涤缓冲液。然后将平板放置在倒置的平板盖上。

对于细胞培养上清液样本，向所有孔中加入 25 微升检测缓冲液。向标准品孔中加入每种标准品各 25 微升。最后，向样本孔中加入每种样本各 25 微升。将混合的微球涡旋振荡 30 秒。然后，向每个孔中加入 25 微升混合微球，在加样过程中间歇震荡微球瓶，以防止微球沉淀。

使用封板膜密封反应板。密封后，用铝箔包裹整个反应板，包括倒置的板盖。将反应板置于板式摇床上，固定后在室温下以约500转/分钟的速度振荡两小时。不翻转反应板，直接将其放入真空 manifold 中，按之前方法施加真空。随后，向每个孔中加入200 µL的1×洗涤缓冲液。

通过真空抽滤去除检测板孔中的内容物。用吸水垫或纸巾从板底部吸去多余的洗涤缓冲液，然后重复此步骤一次。接着，向每个孔中加入25微升检测抗体。使用新的板密封膜密封板后，用铝箔包裹整个板，包括倒置的板盖。

将酶标板置于板式摇床上，于室温下以约 500 RPM 的速度振荡 1 小时。无需抽真空，直接向每孔中加入 25 微升链霉亲和素-藻红蛋白试剂。按之前方法密封并包裹酶标板。然后，将酶标板置于板式摇床上，于室温下以约 500 RPM 的速度振荡 30 分钟。

重复真空过滤步骤两次后，向每个孔中加入 200 µL 的 1× 洗涤缓冲液。在平板振荡器上重悬磁珠 1 分钟。使用多通道移液器将样品从滤板转移至流式管中，以便在流式细胞仪上检测样品。