通过超性能液相色谱对细菌细胞壁进行隔离和制备，进行组成分析

该程序的总体目标是分离和消化细菌细胞壁，以确定不同神经肽的身份和相对组分。使用 UPLC 分析时，首先通过在 ecol 硫酸钠中煮沸来裂解细菌样品来实现。洗掉 SDS 后，第二步是用链霉蛋白酶 E 消化样品，以纯化掉革兰氏阴性菌的外膜。

接下来，用 mease 消化样品，将肽聚糖溶解成单独的神经肽。最后一步是还原神经肽并将 pH 值调节到神经肽等电点。最终，UPLC 用于根据大小和疏水性分离神经肽，有助于定量重要的细胞壁特征，例如交联度和平均聚糖链长度。

这种方法可以帮助揭示微生物学领域关键问题的答案，例如形态发生、细胞壁结构、免疫系统激活和发病机制之间的关系。虽然这种方法已被开发用于纯化革兰氏阴性肽基聚糖，但它也可以通过添加一些酶和化学处理应用于革兰氏阳性菌。为了将细菌培养物重新生长，将过夜培养物稀释到 250 毫升新鲜培养基中，并在稀释的培养物生长时在 600 纳米处生长至所需的光密度。在 1 升烧杯中的热板上设置沸水浴。

水沸腾后，将 6 毫升 6% 硫酸钠或 SDS 分装到 50 毫升聚丙烯管中。向每个试管中加入一个小搅拌棒，然后用手拧紧试管盖。将试管放入沸水浴中，在热板上以 500 RPM 的速度搅拌。

在室温下以 5， 000 倍 G 旋转 10 分钟，收获 250 毫升培养物。将沉淀重悬于 3 毫升培养基或 1 x 磷酸盐缓冲盐水中。将细胞悬液缓慢移液到含有 6% 沸腾 SDS 的 50 毫升试管中，以便在试管浸入沸水浴中时对细胞进行虱子，然后重新合上盖子以用手拧紧。

盖上沸水浴，让细胞沸腾 3 小时，定期检查水位，必要时重新填充水浴。三小时后，关掉热板上的火，继续以 500 RPM 的速度搅拌过夜。如果 SDS 在 50 mL 试管中沉淀过夜，请将水浴再煮沸 1 至 2 小时。

此处显示的是正常培养物在裂解过夜后的样子。在 SDS 中，请注意透明度，而不是与沉淀相关的不透明性。准备 prone e 缓冲液并在 60 摄氏度的加热块中激活 prone E 至少 30 分钟。

使用设置为 400， 000 倍 G 的超速离心机在室温下离心样品 20 分钟，以沉淀大肽醇聚糖或 PG 大分子，从而从其他细胞成分中纯化它们。小心去除上清液，然后在室温下重悬每个沉淀。超纯水复苏悬浮液的体积取决于所用超速离心管的体积。

使用至少填充试管一半但不超过试管最大体积的体积。重复离心和洗涤，直到 Resus 悬浮期间水不形成气泡，表明此时 SDS 已被完全去除。Resus 将样品悬浮在 900 μL 的 tris HCL 缓冲液中，并转移到先前在顶部戳有孔的两毫升试管中。

使用小针头向每个样品中加入 100 μL 活化的链霉蛋白酶 E，然后在 60 摄氏度下孵育 2 小时。向每个样品中加入 200 微升 6% SDS，并在 100 摄氏度的加热块中煮沸样品 30 分钟，以阻止易发性消化不良。和以前一样，使用设置为 400， 000 倍 G 的超速离心机在室温下离心样品 20 分钟，然后用室温超纯水洗涤，直到在最后一个离心洗涤步骤中完全去除 SDS，将样品悬浮在 200 微升 50 毫摩尔磷酸钠缓冲液中。

该体积可根据样品中 Pepto 糖的量进行调整，并且可能取决于物种。如果样品中含有更多的 pep 糖，请增加悬浮液体积。如果样品中的肽聚糖很少。

将复苏悬液量减少到至少 50 微升。将样品转移到 1.5 mL 试管中，每毫升添加 1 毫克，得到 40 μg/mL 的最终浓度。在 37 摄氏度的加热块中孵育 6 到 8 小时或过夜。

要制备用于 UPLC 的样品，请打开加热块至 100 摄氏度。将不含 SDS 的样品煮沸 5 分钟，以 16， 000 次停止酶切离心样品 10 分钟。G 在室温下。

神经肽现在在上清液中。将上清液转移到 13 x 100 毫米的玻璃管中。尝试尽可能多地回收上清液，在不干扰上颚的情况下非常靠近上颚。

通过向样品中加入 500 毫摩尔硼酸盐缓冲液来调节 pH 值，使最终浓度为 100 毫摩尔硼酸盐缓冲液，孔径 8 缓冲液与还原剂相容。硼氢化钠加入几粒硼氢化钠以还原每个样品，并在室温下让反应进行至少 30 分钟。接下来，用含正磷酸的 pH 试纸以 20 微升的增量将样品调节至 pH 值 6，样品应响应添加正磷酸而起泡。

当 pH 值达到 6 时，样品通常会停止冒泡。然后继续用邻位磷酸以 2 微升的增量将样品调节至 pH 值 3 和 4 之间。通过 0.22 微米注射器过滤样品。

直接过滤到 A-U-P-L-C 样品瓶中。如果转移到 UPLC 样品瓶中后，样品中的沉淀物已经重整，则通过火焰加热样品瓶数次。将 UPLC 样品瓶放入自动进样器中，将每个样品 10 μL 注入 A-U-P-L-C 仪器。

配备 C 18 反相 UPLC 色谱柱和用于监测的吸光度检测器。依次进样 202 至 208 nm 样品。将流速设置为 0.25 mL/min，并在 25 分钟内使用线性梯度，以在 30 分钟内实现 100% 溶剂 B 和神经肽的连续 E。

如果在 UPLC 后使用质谱法表征神经肽，请在馏分收集器中收集目标峰的馏分，将馏分转移到 1.5 mL 试管中，然后使用离心蒸发器干燥馏分，必须在 MS 分析前对馏分进行脱盐。在这个典型的UPLC结果中。通过 202 至 208 纳米的紫外吸光度作为时间的函数进行检测，可确定特定的神经肽保留时间。

观察到大多数神经肽种类之间的清晰分辨率和整个谱图的强信号强度，从而能够分析交联平均聚糖链长度的程度以及神经肽的身份及其浓度。此处显示了反映神经肽 C 沉淀的示例色谱图。没有提到峰，因此没有关于 PG 组成的任何数据。

UPLC 分析中没有可辨别的峰可能是由于样品过度浓缩或错误地将 pH 值调整到远低于神经肽的等电点。一旦掌握，这项技术可以在三天内完成，尽管很忙，但它正确执行了此程序。质谱法等其他方法可用于根据质量积极鉴定神经肽种类 开发后。

这项技术为微生物学领域的研究人员探索关键细胞壁酶的生化功能以及化学抑制剂在各种物种和突变体中的作用方式铺平了道路。