通过超高效液相色谱进行组分分析的细菌细胞壁分离与制备

本实验的总体目标是分离并消化细菌细胞壁，以确定不同神经肽的种类及其相对比例。通过超高效液相色谱（UPLC）分析，首先将细菌样品在十二烷基硫酸钠（SDS）中煮沸以实现裂解；随后洗去SDS，第二步使用嗜热蛋白酶E（pronase E）对样品进行消化，从而去除革兰氏阴性菌的外膜，实现纯化。

接下来，用酶消化样品，将肽聚糖溶解为单个神经肽。最后一步是还原神经肽，并将pH值调节至神经肽的等电点。最终，采用超高效液相色谱（UPLC）根据神经肽的大小和疏水性进行分离，从而实现对细胞壁重要特征的定量分析，例如交联程度和平均聚糖链长度。

该方法有助于揭示微生物学领域中一些关键问题的答案，例如形态发生、细胞壁结构、免疫系统激活与致病性之间的关系。尽管该方法最初是为纯化革兰氏阴性菌的肽聚糖而开发的，但通过添加少量酶和化学处理步骤，也可应用于革兰氏阳性菌。将过夜培养物按1:100比例稀释至250毫升新鲜培养基中，于600纳米波长下培养至所需的光密度。在稀释后的培养物生长期间，将一个1升烧杯置于加热板上，设置沸水浴。

水沸腾后，将6%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液6毫升分装至50毫升聚丙烯管中。每管加入一个小型搅拌子，用手拧紧管盖。将管子放入沸水浴中，并在加热板上以500转/分钟的速度搅拌。

在室温下以5,000 × g离心10分钟，收集250毫升培养物。将沉淀重悬于3毫升培养基或1×磷酸盐缓冲液中。将细胞悬液缓慢移入装有6%煮沸SDS的50毫升离心管中，同时将离心管浸入沸水浴中进行细胞裂解，然后将管盖拧紧至手指力度。

盖上沸水浴锅盖，使细胞煮沸三小时，期间定期检查水位，并在必要时向水浴中补充水。三小时后，关闭电热板的加热功能，并继续在500 RPM转速下搅拌过夜。若在50毫升离心管中过夜后出现SDS沉淀，将水浴重新设置为继续煮沸额外一至两小时。

图中显示了正常培养物在过夜裂解后应有的状态。在 SDS 中，注意其透明性，与沉淀相关的不透明性相对。配制易解聚缓冲液，并在加热块中于 60 摄氏度激活易解聚 E 至少 30 分钟。

使用超速离心机，在 400,000 × g 条件下于室温离心 20 分钟，使大分子肽聚糖（PG）沉淀，从而与其他细胞组分分离以实现纯化。小心移除上清液，然后将每份沉淀物重新悬浮于室温的超纯水中。重悬体积取决于所用超速离心管的体积。

使用能够至少填充离心管一半体积但不超过其最大容量的液体量。重复离心和洗涤步骤，直至水中在重悬时不再产生气泡，表明此时 SDS 已完全去除。将样品重悬于 900 µL 的 Tris-HCl 缓冲液中，并转移至预先在管盖上扎有小孔的 2 mL 管中。

使用细针向每个样品中加入 100 µL 激活的蛋白酶 E，然后在 60 °C 下孵育 2 小时。向每个样品中加入 200 µL 6% SDS 以终止蛋白酶消化反应，并将样品置于 100 °C 的加热块中煮沸 30 分钟。与之前相同，使用超速离心机在 400,000 ×g 条件下于室温离心 20 分钟，并用室温超纯水洗涤，直至最后一次离心洗涤步骤完全去除 SDS，最后将样品重悬于 200 µL 50 mmol/L 磷酸钠缓冲液中。

该体积可根据样品中肽聚糖的含量进行调整，可能因物种而异。如果样品中含有较多肽聚糖，则增加悬浮液的体积；如果样品中肽聚糖含量较少，则相应减少体积。

将重悬液的体积浓缩至最少50微升。将样品转移至1.5毫升离心管中，并加入终浓度为每毫升1毫克的mease，使最终浓度为每毫升40微克。在37摄氏度的加热块中孵育6至8小时或过夜。

为进行UPLC样品制备，将加热块调至100摄氏度。将不含SDS的样品煮沸5分钟以终止酶解反应，然后在室温下以16,000 ×g离心10分钟。

神经肽现在位于上清液中。将上清液转移至13 mm × 100 mm的玻璃管中。尽量回收尽可能多的上清液，接近 palate 时需十分小心，避免扰动。

通过加入500毫摩尔的硼酸盐缓冲液调节样品pH值，使最终硼酸盐缓冲液浓度为100毫摩尔。硼酸盐缓冲液与还原剂相容。向每个样品中加入数粒硼氢化钠以进行还原反应，并在室温下反应至少30分钟。接着，使用邻磷酸将样品调节至pH 6（用pH指示试纸测定），每次加入20微升，样品在加入邻磷酸后应产生气泡。

当 pH 值达到 6 时，样品通常停止冒泡。然后继续用正磷酸以 2 µL 的增量将样品的 pH 值调节至 3 到 4 之间。通过 0.22 µm 的注射器滤膜过滤样品。

直接过滤至UPLC小瓶中。若样品转移至UPLC小瓶后再次出现沉淀，可用火焰短暂加热小瓶数次。将UPLC小瓶放入自动进样器，每份样品进样10 µL至UPLC仪器中。

使用C 18反相UPLC柱，并设置吸光度检测器监测202至208纳米。依次进样，流速设为0.25毫升/分钟，采用线性梯度在25分钟内达到100%溶剂B，于30分钟内实现神经肽的依次洗脱。

如果在超高效液相色谱（UPLC）后使用质谱法表征神经肽，请使用馏分收集器收集目标峰的馏分，将这些馏分转移至1.5毫升离心管中，然后使用离心蒸发仪干燥馏分；在进行质谱分析前，馏分必须经过脱盐处理。在此典型的UPLC结果中，通过202至208纳米波长下的紫外吸光度检测随时间变化的情况，可确定特定神经肽的保留时间。

大多数神经肽种类之间具有清晰的分辨，且在整个谱图中信号强度高，从而能够分析交联程度、平均糖链长度以及神经肽的种类和浓度。此处展示了一个反映神经肽C沉淀的色谱图实例。未出现任何峰，导致无法获得有关肽聚糖组成的任何数据。

UPLC 分析中无法观察到明显峰的原因可能是样品过度浓缩，或 pH 值调节不当，远低于神经肽的等电点。一旦掌握，该技术可在三天内完成，尽管操作过程较为紧张，但只要严格按照本方案执行即可。在该方法建立后，还可采用质谱等其他方法，根据质量对神经肽种类进行确切鉴定。

该技术为微生物学领域的研究人员探索多种物种及突变体中关键细胞壁酶的生化功能以及化学抑制剂的作用机制铺平了道路。