胞外多糖的OLIGO质谱分析（OLIMP）

此处显示的寡核苷酸质量分析或奥林匹克实验使人们能够快速了解生物体的细胞外基质或细胞壁中聚合物的结构。在这种情况下，首先用 70% 乙醇去除细胞成分，从植物幼苗制备细胞壁。接下来，目标壁聚合物用特定的 hydro lace 消解，以所有韧带的形式溶解特定的壁成分。

另一种方法是用 C 2 中的酶直接在组织上消化细胞壁。韧带释放的相对丰度由 MALDI 与质谱和统计分析确定。大家好，我是来自加州大学伯克利分校能源生物科学研究所的 Marcus Polly。

大家好，我是 Marcus Re.我是 Asha Giller。也来自能源生物科学研究所。生物体被细胞外基质包围，根据生物体的不同，这些基质由复杂的聚合物网络组成。

一种快速而灵敏的评估细胞外基质的方法是一种我们称为 oli 质量分析短发烟碱的方法，我们今天将向您展示。该程序也可以直接在植物组织上进行。那么让我们开始吧。

通过分离植物组织的细胞外基质或细胞壁来开始此过程。收获五株拟南芥幼苗或等量的其他植物材料，并将它们转移到 1.5 毫升反应管中。确保将材料放置在管的底部。

向反应管中加入两个 3 毫米的金属球，并在液氮中快速冷冻。然后使用球磨机以 25 赫兹的频率研磨冷冻样品 2.5 分钟。研磨材料后，向样品中加入 1 毫升 70% 乙醇水溶液。

使用磁铁取出金属球并彻底涡旋。这种处理可溶解大多数蛋白质，细胞器以 14， 000 RPM 的速度离心样品 10 分钟，以沉淀不溶性醇的残留物。代表细胞壁材料小心吸出上清液，确保不干扰沉淀。

将 1 毫升氯仿甲醇溶液加入残留在管中的沉淀中，彻底涡旋。为了重悬沉淀并离心，氯仿甲醇会提取疏水性化合物，例如脂质。离心后，去除 snat 并使用真空离心机完全干燥沉淀，从而完成细胞壁材料的分离，现在可以处理产生特异性韧带。

这里演示的示例是 Xlo 葡聚糖的溶解，Xlo 葡聚糖是存在于拟南芥等双子叶植物细胞壁中的主要半纤维素 Xlo 葡聚糖是一种由葡聚糖骨架组成的聚合物，该骨架被其他糖残基严重取代，用于溶解该聚合物。使用真菌内切葡聚糖溶解这种半纤维素 Resus，将干燥的分离细胞壁沉淀悬浮在 25 微升 50 毫摩尔甲酸铵 pH 4.5 中，并添加 0.2 单位的葡萄糖酸内切。涡旋悬浮液并将液体向下旋转。

将试管放入混合器中，让管壁在 16 摄氏度下摇晃消化 37 小时。在 300 RPM 时。当分离的细胞壁消化完成后，使用真空离心机去除溶剂，然后通过质谱法分析释放的寡糖，使用来自 Biox MSD 5 0 1 的阳离子交换树脂珠从消化的样品中去除盐和酶。

首先将所需量的珠子放入空柱中，然后用大量的水清洗珠子，从而对珠子进行调节。向消化和干燥的样品中加入 5 至 10 个条件 biox 阳离子珠。然后加入 10 微升水以减少材料量。

可以使用 5 微升水。短暂旋转试管，将微珠浸入溶液中，在室温下孵育至少 10 分钟，同时消化液与微珠一起孵育。将两微升 DHB 基质点到不良 D 目标板上。

在真空下蒸发基质溶剂，导致基质化学晶体现在点上 2 微升脱盐消解溶液。在目标板上的基质晶体顶部。样品基质点的溶剂再次在真空下蒸发。

在结晶之前保持适当的样品基质液体混合时间非常重要，如随附的书面方案中详细描述。样品干燥后，将目标板放入 maldi 至质谱仪中。将机器设置为正模式，加速电压为 20， 000 伏，延迟为 350 纳米。

这些半纤维素韧带的选择质量范围为 500 至 3000 道尔顿。质量范围应根据预期韧带的大小进行修改。开始发射激光器，每个样品收集 100 到 200 个光谱，这些光谱被编译以产生具有代表性的平均光谱。

这是 Hemi 纤维素 oly 光谱。本视频中演示的 oly 方法也可以直接用于植物组织，省略任何壁准备步骤。这种原位分析程序在深色生长的拟南芥幼苗上得到证明。

将标本直接放在目标板上，并风干到板上的干燥幼苗上。在所需位置添加 0.5 μL 适当的酶缓冲液混合物。确保酶滴部分接触组织和目标板。

将 maldi 靶板放在湿度饱和的密闭容器中，以避免酶滴变干。将板在 16 摄氏度下孵育 37 小时。孵育期结束时，在真空下干燥酶斑点，并在每个干燥的酶斑上加入 0.5 微升液体 DHB 基质。

然后在真空下干燥 MALDI 靶板。要分析 NC，请提供两个样本。使用与分离的细胞壁样品相同的设置，将目标板（包括组织标本酶基质斑点）放入多质谱仪记录质谱中。

开始将激光发射到基质上。在组织旁边对晶体进行采样。确保不要撞击组织本身，因为在这种情况下，分子的飞行时间会关闭。

每个点收集大约 20 到 50 个光谱，并将它们编译以生成具有代表性的平均光谱。这是源自 AOP 中存在的 HemosIL 葡聚糖的低聚糖的代表性平均谱。将幼苗、离子强度或所有目标离子的离子高度相加至 100%，从而得到各种低聚糖的相对丰度。

NC 两个 OMP 方法的结果给出了类似的结果。每个用彩色圆圈标记的酶消化液滴都可以独立分析，并获得和分析相应的质谱。如果有合适的水解酶，也可以在细胞外基质的其他聚合物上进行 Oola。

例如，这是生物能源作物中存在的血纤维素柱状物的 oola 光谱。Ms.Canus 获得呈现的数据，同时用 xin 消化 mecampus 叶子的材料。有关离子的结构分配，请参阅随附的实验步骤。

我们刚刚向您展示了 exo cellular metrics 上的 oligo mar 质量分析程序。聚合物，在执行此程序时，请务必记住，当 OV MS 分析获得均一基质结果时，可以获得最佳结果。就是这样。

感谢您的观看，祝您实验好运。