Name: 胞外多糖的OLIGO质谱分析（OLIMP） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学习OLIMP技术快速分析植物细胞壁多糖结构，通过酶解与MALDI-TOF质谱联用实现高通量检测。该方法仅需少量样本即可揭示胞外基质糖结构特征，适用于生物能源研究。

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本工作由能源生物科学研究所的资助项目OO0G01资助。

本实验以双子叶植物细胞壁中主要的半纤维素——木葡聚糖为例，采用内切葡聚糖酶作为糖基水解酶，展示了OLIMP方法的应用。实验以完整的拟南芥（Arabidopsis）幼苗作为植物组织来源。根据所需的分析目标，可替换不同的酶和细胞外基质材料，但操作流程保持不变。 1. 细胞壁的分离 <ol> <li>收获五株5天大的完整Arabidopsis幼苗，或等量的所需材料，转移至1.5 mL离心管中。确保材料位于管底。</li> <li>在样品上方加入两颗3 mm金属珠，随后在液氮中迅速冷冻。</li> <li>使用球磨仪研磨冷冻样品（2分30秒，25 Hz）。</li> <li>向样品中加入1 mL 70%乙醇水溶液。用磁铁移除金属珠，充分涡旋振荡。</li> <li>以14,000 rpm离心10分钟，使含有细胞壁材料的醇不溶性残渣沉淀。</li> <li>小心抽吸去除上清液，注意不要扰动沉淀。</li> <li>加入1 mL氯仿/甲醇（1:1 v/v）溶液，充分涡旋振荡以重新悬浮沉淀。</li> <li>以14,000 rpm离心10分钟，小心抽吸去除上清液，注意不要扰动沉淀。</li> <li>使用浓缩仪将样品干燥。</li> </ol> 2. 寡糖的溶解 <ol> <li>为了将特定多糖以其寡糖形式溶解，将干燥的沉淀重悬于25μl适当的缓冲液中。对于内切葡聚糖酶，使用50mM甲酸铵缓冲液（pH 4.5）。加入0.2U内切葡聚糖酶。涡旋混匀后离心收集液体。</li> <li>将样品在37°C孵育器中孵育16小时，以300rpm振荡。</li> <li>使用浓缩仪除去消化产物中的溶剂（水）。</li> </ol> 3. 释放的寡糖的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析 <ol> 
 <li>使用 BioRex MSZ 501 阳离子交换树脂珠去除消化后样品中的盐分和酶。将适量树脂珠装入空柱中，并用大量水洗涤树脂珠以进行预处理。</li> 
 <li>向已消化并干燥的样品中加入 5–10 个 BioRex 树脂珠。然后加入 10 μl 水；若样品量较少，可使用 5 μl 水。短暂离心试管使树脂珠浸入溶液中。室温孵育至少 10 分钟。</li> 
 <li>取 2 μl 基质溶液（2,5-二羟基苯甲酸（DHB），10 mg/ml 溶于水）点样至 MALDI 目标板上。在真空条件下蒸发基质溶剂，形成均匀的基质化学晶体。</li> 
 <li>将 2 μl 脱盐后的样品溶液点加在目标板上的基质晶体表面。 若需点样大量样品，每次点样操作时间不应超过 3 分钟。此时间范围可确保最先点样的样品尚未完全干燥。所有样品点样完毕后，额外等待 2 分钟，以确保最后点样的样品中重新溶解的基质与寡糖分子充分混合。随后将目标板置于真空下干燥。 样品与基质的混合物应在 1 分钟内结晶，以实现均匀结晶。</li> 
 <li>将目标板放入 MALDI-TOF 质谱仪中。仪器应设置为正离子反射模式，加速电压为 20000 V，延迟时间为 350 nm；选择的质量范围应为 500–3000 Da（可根据预期的寡聚物适当调整）。启动激光，每样品采集 100–200 张谱图，并合并生成一张代表性的平均谱图（图 2A）。可通过质荷比（m/z）鉴定代表特定寡糖的离子。将所有目标离子的离子强度（峰高）加总至 100%，从而得出各样品中每种寡糖的相对丰度（图 2B）。</li> 
</ol> 4. 原位 OLIMP分析 OLIMP 也可直接用于组织，无需进行任何细胞壁制备步骤。以去黄化的拟南芥（Arabidopsis）下胚轴作为植物组织来源为例，同样使用内切葡聚糖酶来分析半纤维素木葡聚糖的结构。根据所需的分析内容，可采用相同实验流程替换相应的酶和组织材料。 <ol> <li>采集一株黄化幼苗，将其放置于空的MALDI靶板上，并让幼苗自然干燥。</li> <li>在干燥后的幼苗指定位置加入0.5μl内切葡聚糖酶（0.4U/μl，溶于50mM甲酸铵缓冲液，pH 4.5）。确保酶液滴部分接触靶板表面。</li> <li>将MALDI靶板置于密闭容器中，容器内保持饱和湿度，以防止酶液滴干燥。在37°C条件下孵育16小时。</li> <li>在真空条件下干燥含有植物组织和酶液滴的MALDI靶板。</li> <li>在每个干燥的酶反应位点上加入0.5μl基质（DHB；10mg/l），静置2分钟。</li> <li>再次在真空条件下干燥MALDI靶板。</li> <li>使用MALDI-TOF质谱仪进行样品分析。将含有植物组织及酶/基质反应点的靶板放入MALDI-TOF质谱仪中。仪器参数应设置为正离子反射模式，加速电压为20000V，延迟时间为350 nm；质荷比扫描范围应设为500–3000 Da（可根据预期寡糖片段大小进行调整）。</li> <li>开始用激光照射基质/样品结晶区域中紧邻组织的位置。务必避免直接照射组织本身，否则会导致分子飞行时间偏移。每个位点采集约20–50张谱图，并合并生成一张代表性平均谱图（图3）。通过质荷比（m/z）识别代表特定寡糖的离子信号。可报告离子强度（峰高），并将所有目标离子信号归一化至100%，以获得各样品中各寡糖的相对丰度。</li> </ol> 5. 代表性结果 图2展示了拟南芥（Arabidopsis）幼苗中半纤维素木葡聚糖的OLIMP分析示例。由于离子之间的质量差异以及已知且特征明确的酶（内切葡聚糖酶）的特异性，可将各离子指认为特定的寡糖结构（图2A）。显然，该方法无法区分结构异构体。确定各种寡糖相对丰度（图2B）的基本假设是，这些寡糖在质谱中的响应因子非常相似。如本图所示，OLIMP定量具有高度可重复性。但需注意，该方法的稳健性在很大程度上依赖于各种寡糖离子的信噪比。例如，盐类污染或寡糖含量较低均可能降低该比值。 组织原位的OLIMP分析能够研究非常微小且特定的区域，并且所需样品制备极少。在本示例中（图3），茎与根组织之间未观察到定性差异（离子种类相同），但存在定量差异（离子强度的变化） 拟南芥 幼苗。因此，OLIMP方法的多种变化可实现组织“成像”。 <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig1.jpg" alt="植物细胞壁分析；酶解；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；流程图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. OLIMP 方法流程图（使用完整样本） 拟南芥 以幼苗作为植物来源。首先，将组织进行研磨并制备细胞壁材料（图片改编自 Fujino 等人）。10然后使用特异性水解酶释放细胞壁多糖的寡糖片段。最后，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）测定可溶性寡糖的相对丰度。 <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig2.jpg" alt="质谱分析；木葡聚糖寡糖；质荷比与强度图；相对丰度柱状图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 黄化幼苗中木葡聚糖寡糖的相对丰度 拟南芥 由OLIMP测定。A）代表性木葡聚糖寡糖质谱图；每个离子代表一种特定的寡糖结构，无法区分结构异构体。B）用于确定寡糖相对丰度的相应柱状图。 <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig3.jpg" alt="毛发分析及采样点与色谱图谱；法医学调查" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 原位 使用黄化幼苗进行OLIMP分析 拟南芥 例如，每个酶/消化液滴（彩色圆圈）均可独立分析，并可获得和分析相应的质谱图。 <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig4.jpg" alt="质谱图；戊糖分析，葡萄糖醛酸峰，强度百分比 vs m/z 比值。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. 采用木聚糖酶（Megazyme）消化芒草叶片材料后，通过OLIMP方法获得的半纤维素木聚糖的质谱图。

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</ol>

无利益冲突声明。

本文介绍的 OLIMP 方法能够对细胞外基质中存在的多聚物进行高灵敏度且快速的分析。OLIMP 方法结合了酶解释放寡聚物与后续的 MALDI-TOF 分析。生成一张 MALDI-TOF 谱图耗时不到一分钟，因此 OLIMP 适用于多种应用，包括高通量研究，如突变体筛选。OLIMP 不仅限于植物多糖，理论上可应用于多种多聚物，其应用范围仅受限于特异性水解酶的可获得性。然而，OLIMP 的一个局限性在于无法获得多聚物的绝对丰度。 如前所述，OLIMP 可用于研究多种物种细胞外基质中多种多糖的结构。例如，图 4 展示了禾本科植物中主要半纤维素——木聚糖的 OLIMP 谱图。在此实验中，来源于温带禾草芒属（Miscanthus）的细胞壁材料经木聚糖酶消化处理。

<table><tbody><tr><td>2,5-二羟基苯甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37550</td><td>10mg/mL 水溶液</td></tr><tr><td>BioRex MSZ 501(D) 树脂</td><td>Bio-Rad</td><td>142-7425</td><td></td></tr><tr><td>内切葡聚糖酶</td><td>Megazyme</td><td>E-CELTR</td><td></td></tr><tr><td>木聚糖酶 M6</td><td>Megazyme</td><td>E-XYRU6</td><td></td></tr><tr><td>3mm 金属球</td><td>Retsch</td><td>22.455.0011</td><td></td></tr><tr><td>球磨机</td><td>Retsch</td><td>Mixer Mill MM400</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Shimadzu Corporation</td><td>Axima Performance</td><td></td></tr><tr><td>MALDI 目标靶板</td><td>Kratos Analytical</td><td>DE4555TA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Eppendorf</td><td>Vacufuge 5301</td><td></td></tr><tr><td>真空抽滤装置</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Welch Allyn</td><td>DryFast Ultra 2032</td><td></td></tr></tbody></table>

细胞外多糖的寡糖质谱分析（olimp）

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

在许多生物体中，细胞与环境之间的直接接触由细胞外基质介导。细胞外基质的一个共同特征是含有以糖蛋白、蛋白聚糖和/或多糖形式存在的复杂糖类结构。例如，人类和动物细胞的细胞外基质主要由纤维状蛋白和蛋白聚糖组成，植物和真菌的细胞壁以多糖为主，而细菌的细胞壁则基于蛋白聚糖和糖脂。所有这些糖结构在细胞间以及细胞与环境之间的通讯和信号传导中发挥着至关重要的作用。
高等植物细胞壁中存在着一种极为复杂的细胞外基质实例。植物细胞壁几乎完全由糖类构成，占干重的75%之多，包含地球上最丰富的生物聚合物。因此，研究人员致力于探索如何将这些材料作为碳中性的可再生资源加以充分利用，以替代源自化石燃料的石化产品。目前燃料转化面临的主要挑战在于，由于这种独特的生物复合材料中存在特有的糖结构，导致其细胞壁对酶解或化学降解具有较强的抗性。
本文介绍一种用于快速、灵敏分析植物细胞壁糖结构的方法。该方法称为寡糖质谱分析法（OLIMP），基于特异性糖基水解酶从细胞壁材料中酶促释放寡糖，并利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF/MS）1（图1）对溶解后的寡糖混合物进行后续分析。OLIMP 完整分析仅需约 5000 个细胞的细胞壁材料，可直接在组织样本上进行2，并适用于高通量分析3。尽管 OLIMP 无法测定溶解寡糖的绝对含量，但可通过质谱图中不同寡糖离子的相对丰度，揭示细胞壁中天然多糖的取代模式。
OLIMP可用于分析多种细胞壁多糖，其应用范围仅受限于特异性酶的可获得性4例如，可利用木葡聚糖酶分析存在于植物细胞壁中的半纤维素木葡聚糖5, 11, 12, 13，使用木聚糖 内皮-β-(1-4)-木聚糖酶 6,7，或使用多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲酯酶的组合来处理果胶多糖 8此外，利用相同的原理，OLIMP 还可用于监测和测定糖基水解酶甚至糖基转移酶的活性。 9.

本文描述了一种快速了解细胞外基质中多糖结构的方法。该方法利用了糖基水解酶的特异性和质谱技术的高灵敏度，可分析极微量的样品。此技术可直接应用于组织本身。

细胞外多糖的寡糖质谱分析（OLIMP）

许多生物体的细胞与环境之间的直接接触由细胞外基质介导。细胞外基质的一个共同特征是……

此处展示的寡聚体质量谱分析或Olympic实验，可快速揭示生物体细胞外基质或细胞壁中聚合物的结构。在此实例中，首先使用70%乙醇去除植物幼苗中的细胞组分，制备细胞壁；随后用特异性的水解酶消化目标壁聚合物，将特定的壁组分以寡聚体形式溶解出来。另一种方法是在组织上直接使用 C two 中的酶消化细胞壁。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF 质谱）和统计分析，确定释放的多糖链的相对丰度。大家好，我是来自加州大学伯克利分校能源生物科学研究所的 Marcus Polly。大家好，我是马库斯·雷。我是阿莎·吉勒，也来自能源生物科学研究所。生物体周围都存在着细胞外基质，这些基质根据生物体的不同，由复杂的聚合物网络构成。一种快速且灵敏的细胞外基质评估方法，我们称之为寡聚物质量谱分析（oli mass profiling short oleum），今天将向您展示该方法。此操作也可直接在植物组织上进行。现在，让我们开始吧。开始本实验前，需先分离植物组织的细胞外基质或细胞壁。取五株拟南芥幼苗或其他等量的植物材料，转移至一个1.5毫升的离心管中。确保材料位于离心管底部。向反应管中加入两到三个直径为三毫米的金属球，置于液氮中快速冷冻。然后使用球磨机以25赫兹频率研磨冷冻样品2.5分钟。研磨完成后，向样品中加入1毫升70%的乙醇水溶液。使用磁铁去除金属小球，并充分涡旋振荡。该处理可溶解大部分蛋白质和细胞器，将样品在14,000 RPM下离心10分钟，使酒精不溶性残渣沉淀，形成细胞壁材料。小心吸取上清液，确保不要扰动沉淀物。向离心管中残留的沉淀物加入1毫升氯仿-甲醇溶液，充分涡旋混合以重悬沉淀物，并离心分离氯仿-甲醇提取物中的疏水性化合物（如脂质）。离心后，移除上清液，并使用真空离心机将沉淀物完全干燥。至此完成细胞壁材料的分离，该材料可进一步处理以获得特定的连接分子。此处演示的示例为木葡聚糖（Xlo glucan）的溶解过程，木葡聚糖是拟南芥等双子叶植物细胞壁中存在的主要半纤维素。木葡聚糖是一种由葡聚糖主链构成的聚合物，其主链上大量连接有其他糖残基。为溶解该聚合物，使用一种真菌来源的内切葡聚糖酶。将干燥的分离细胞壁沉淀重悬于25 µL 50 mM甲酸铵缓冲液（pH 4.5）中，并加入0.2单位的内切葡聚糖酶。涡旋混匀悬浮液，然后离心收集液体。将试管放入混匀仪中，在37摄氏度下振荡消化管壁16小时，转速为300 RPM。当分离的细胞壁消化完成后，使用真空离心浓缩仪去除溶剂，然后通过质谱分析释放的寡糖；使用Biox MSD 5 0 1阳离子交换树脂珠去除消化样品中的盐类和酶。首先将所需量的珠子置于空柱中，并用大量水洗涤珠子以进行预处理。向已消化并干燥的样品中加入5到10个经预处理的Biox阳离子珠。若样品量较少，则加入10微升水。可使用5 µL水。将珠子浸入溶液中，短暂离心管子，在室温下孵育至少10分钟，同时消化物与珠子一起孵育。取2 µL DHB基质点样于MALDI靶板上。在真空条件下蒸发基质溶剂，得到基质化学晶体。随后，在靶板上的基质晶体上点样2微升脱盐后的消化液。再次在真空条件下蒸发样品基质斑点的溶剂。在结晶前，必须按照随附书面方案中详细描述的方法，控制样品基质液混合的适当时间。样品干燥后，将靶板放入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪中。将仪器设置为正离子模式，加速电压为 20,000 伏特，延迟时间为 350 纳秒。这些半纤维素配体的选定质荷比范围为500至3000道尔顿。应根据预期配体的大小调整质荷比范围。启动激光并为每个样品采集100至200张质谱图，这些质谱图将被整合以生成一张具有代表性的平均质谱图。这是半纤维素的寡糖谱。本视频中展示的寡糖分析方法也可直接用于植物组织，无需进行任何细胞壁制备步骤。该原位分析流程以暗培养的拟南芥幼苗为例进行演示。将样本直接置于靶板上，并在板上干燥至干苗状态。在指定位置加入0.5微升的适当酶缓冲液混合物。确保酶液滴部分接触组织和靶板表面。将 MALDI 靶板放入密闭容器中，并保持饱和湿度，以防止酶液滴干燥。将靶板在 37 °C 下孵育 16 小时。孵育结束后，在真空条件下干燥酶点，然后在每个已干燥的酶点上加入 0.5 µL 液态 DHB 基质。然后在真空条件下干燥MALDI靶板。为分析NC，需准备两个样品。将包含组织样本、酶和基质点的靶板放入质谱仪中，使用与分离的细胞壁样品相同的参数设置记录质谱图。开始将激光照射到基质上。样品晶体位于组织旁边。注意不要照射到组织本身，否则分子的飞行时间将出现偏差。每个位点采集约20至50张谱图，并整合生成一张代表性的平均谱图。此图为来源于AOPs中HemosIL葡聚糖的寡糖所得到的代表性平均谱图。将所有目标离子的离子强度或离子峰高加总至100%，从而获得各种寡糖的相对丰度。NC双OMP方法的结果具有相似性。每个由彩色圆圈标记的酶消化液滴均可独立分析，并可获得和分析相应的质谱图。如果存在合适的水解酶，Oola也可应用于细胞外基质的其他聚合物。例如，这是生物能源作物中血红纤维素环的 oola 谱图。Ms.Canus 在获取所示数据时，将来自 m campus 叶片的材料用 xin 进行了消化处理。关于离子结构的归属，请参阅配套的实验方案。我们刚刚向您展示了在胞外基质上进行寡核苷酸大规模谱型分析的步骤。在进行该操作时，需要注意：为了获得最佳结果，应确保基质在OV MS分析中具有均一性。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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胞外多糖的OLIGO质谱分析（OLIMP）

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