创建黏附性与可溶性梯度以荧光显微镜成像细胞迁移

本实验的总体目标是构建黏附性与可溶性梯度，以研究细胞迁移。首先通过钝化表面，防止细胞非特异性黏附；第二步是利用微接触印刷技术制备印模。

接下来，通过微接触印刷在经处理的表面印上链霉亲和素条带。也可使用连接在微流控装置底部的蘸笔光刻技术将链霉亲和素打印成点状。经修饰的表面将作为生物素-RGD黏附梯度的基底。

最后一步是在存在可溶性趋化因子梯度的情况下，将细胞接种到带有黏附信号的表面。最终，通过活细胞显微镜观察细胞对黏附信号和可溶性信号的迁移反应。该技术相较于现有的方法（如Transwell或盲室实验以及传统的微流控装置）的主要优势在于，这种表面图案化的微流控装置的分离式系统能够同时观察细胞对空间可控的黏附信号、黏附梯度以及可溶性梯度的响应。

该方法有助于回答细胞迁移领域中的关键问题，例如细胞黏附的重要性，以及趋化性受体（如受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联受体）与黏附受体（如RIN）之间相互作用导致中风的机制。首先，将盖玻片放入盛有100%乙醇的烧杯中，置于超声水浴中震荡清洗30分钟。随后将玻璃盖玻片在空气中晾干。

随后，将玻璃盖玻片在1摩尔氢氧化钠溶液中超声处理30分钟。之后，将放置盖玻片的架子小心地倾斜放入盛有1.5升超纯水的烧杯中，冲洗玻璃表面。每次使用新鲜的超纯水，重复冲洗过程三次。

第三次清洗后，将玻璃盖玻片置于 60 摄氏度的烘箱中干燥约半小时。取一半干净的玻璃盖玻片，分别放入由 24 孔板制成的湿室中，孔内部分充水。在孔内加水后，将玻璃盖玻片覆盖于各孔上方以进行后续操作。使用一种聚赖氨酸与聚乙二醇的共聚物，其中 20% 的聚乙二醇分子接枝有生物素。

简称为 PLL Peg 生物素，将15微升溶解于PBS中的PLL Peg生物素滴加到每片玻璃盖玻片上。取剩余洁净玻璃盖玻片的另一半，小心地将PEG溶液夹在中间。将盖玻片置于湿润 chamber 中孵育一小时。

孵育一小时后，将夹心式盖玻片轻轻分开，避免刮擦 PEG 涂层表面，并用超纯水冲洗。经 PEG 处理的一侧，水应能顺利滑落。如有必要。

将处理过的玻璃盖玻片有处理面朝上放置在纸巾上，空气干燥。随后将玻璃盖玻片存放在真空干燥器中，直至后续使用。本实验所需的硅模板通过光刻法制作，用于浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体的A-P-D-M-S印章。将PDMS浇注到培养皿中的硅模板上，厚度约为一厘米，然后将硅模板与PDMS混合物置于70摄氏度的烘箱中固化一小时。

随后，将PDMS印章从硅母模上取下，并裁剪至合适尺寸，以用于微接触印刷技术打印蛋白图案。首先，需对PDMS印章进行清洁处理，并通过紫外臭氧清洗仪处理印章的图案面一个半小时，以增强其亲水性。臭氧处理后应立即进行下一步操作，将10微升的链霉亲和素（stripped adin）均匀涂布在PDMS印章表面。若需在荧光显微镜下观察轨迹，请使用与荧光染料偶联的链霉亲和素，例如与LOR three 50偶联的stripped avid。

在湿盒中静置一小时。用纸巾和空气去除印章上多余的链霉亲和素，然后将印章干燥约一分钟。

将印章轻轻按压到PLL聚乙二醇生物素包被的玻璃盖玻片上。如果使用了荧光链霉亲和素，可在倒置荧光显微镜下观察图案。蛋白质图案也可通过蘸笔光刻技术进行打印。

首先将一份浓度为一毫克每毫升的链霉亲和素Alexa Fluor 350与十份甘油混合，取五微升该混合物点样至悬臂上。调节打印速度、悬臂与表面的接触时间或悬臂相对于表面的垂直距离，以减小点样斑点的尺寸。

大约五微米时，按照蘸笔光刻仪器商店的操作手册所述开始打印过程。所有打印的表面均置于干燥器中。使用市售的微流控装置来创建表面梯度。

将涂有或图案化三丁基锡的玻璃盖玻片粘附到装置的粘性侧，以确保数小时内无泄漏。用一层薄薄的温热凡士林密封装置边缘，并用一份凡士林与一份石蜡混合物的第二层进一步密封。向装置的通道中加入6 µL PBS，以形成两个相对的梯度。

将两个储液池分别加入70微升生物素、四氟光素，以及70微升与生物素化肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）偶联的生物素，随后将样品在室温避光条件下孵育一小时。冲洗微流控装置中的生物素、RGD及生物素fitsy是该实验步骤中最困难的部分，因为存在困住气泡并扰动微接触打印轨迹的风险。为确保成功，必须小心且缓慢地去除生物素和PBS。

从微流控装置上移除生物素溶液，并在仍连接于微流控装置时用 PBS 轻轻冲洗表面两次。在将荧光标记的细胞加入微流控装置前，标记黏附梯度的方向。对细胞进行计数，并将其均分为两管，每管细胞数量相等。

洗涤并重悬。用含有趋化因子的培养基（如含10% FBS的低糖DMEM）洗涤后，将其中一管细胞悬浮于该培养基中，另一管细胞则悬浮于不含趋化因子的培养基中（如含0% FBS的DMEM）。每管细胞的最终浓度应为每毫升5 × 10⁵ 个细胞。

将微流控装置中的所有溶液移除，并将其放置在预热的显微镜载物台上。向其中一个储液池中加入70微升用0%FBS-DMEM重悬的细胞，向另一个储液池中加入70微升用10%FBS-DMEM重悬的细胞。

在储液池上松散地覆盖胶带以防止蒸发。确保微流控装置的通道位于视野范围内，且细胞处于聚焦状态。选择图像采集参数，例如曝光时间和荧光滤光片。

明场和荧光图像序列显示细胞及其轨迹，以及时间点和记录时长，启动图像采集程序。本视频演示了一种活细胞成像方法，用于观察在存在竞争性黏附性与可溶性梯度环境中的迁移细胞。通过微接触印刷或蘸笔光刻技术，制备了含有荧光标记strippin和生物素化RGD的黏附性轨迹。

成功的微接触印刷可通过沿轨迹的荧光强度线轮廓来判断，其中粘附性轨迹与抗污区域能够清晰区分。采用蘸笔光刻技术打印的点呈圆形而非泪滴形，表明印刷过程成功。在本示例中，点以行列排列方式打印，行与列之间的间距设定为10至15微米。

这一距离足以防止点状物相互融合，同时允许在单个视野中观察多个点状物。通过使用简单的微流控装置，在大多数显微镜设置下，可在打印的轨迹上形成黏附性信号的浓度梯度。通过将生物素标记的荧光素和生物素化 RGD 分别加载到微流控腔室板的相对两侧实现。

展示60张马赛克图像，总图像长度为3072微米。在B图中，沿整个马赛克的长度方向测量了荧光强度。对荧光强度拟合了线性趋势线，以显示通道中RGD的梯度分布。

去除生物素、生物素化 RGD 溶液后，可使用同一小室引入可溶性梯度。图 A 显示了在 T 等于零时，PBS 和含荧光素染料的储液池附近以及通道内的荧光强度。图 B 显示了可溶性信号分子的荧光强度。

经过16小时孵育后，相似的实验结果表明，该浓度梯度至少在16小时内保持稳定。利用此方法观察了微流控腔室内在相反梯度作用下的细胞迁移，此处展示了一段代表性视频。黏附性梯度是在链霉亲和素轨道上固定的RGD，而可溶性梯度为0至10%胎牛血清（FBS）。

每15分钟拍摄一次图像，共持续20小时。所示图像过渡速度为每秒8帧。这段第二个视频展示了一个单个heli细胞向FBS源迁移的过程。

所示图像转换速度为每秒八帧。代表细胞轨迹的蓝线是通过细胞追踪软件获得的。最后一幅图显示了来自第一段视频图像的细胞轨迹。

向可溶性FPS浓度较高区域迁移的细胞轨迹以红色显示，向黏附性RGD浓度较高区域迁移的细胞轨迹以黑色显示。这些轨迹表明，相较于黏附性RGD浓度较高的区域，更多的HeLa细胞向化学引诱剂源方向迁移。在执行该操作时，需注意避免在黏附梯度制备和活细胞成像过程中微流控装置内的PBS或培养基蒸发；如有需要，可在完成此步骤后使用胶带覆盖微流控装置的所有入口。

为了回答更多问题，例如细胞迁移过程中由蛋白质、黏着斑蛋白和受体介导的细胞骨架的生物力学特性，还可以采用转染和混合溶液显微镜等其他方法。