创建的胶粘剂和可溶性梯度荧光显微镜成像细胞迁移

为组件的粘接剂和可溶性的梯度在显微镜室，用于活细胞迁移研究的方法，进行说明。该工程环境结合溶液梯度的防污表面和粘接剂的轨道，并因此允许一个确定指导线索的相对重要性。

该程序的总体目标是创建粘附性和可溶性梯度来研究细胞迁移。这是通过首先钝化来实现的，钝化表面以防止非特异性细胞粘附。第二步是用微触点印刷制作邮票。

接下来，通过微接触印刷在表面形成链球菌亲和线图案。捆扎的 din 也可以使用连接到微流体设备底部的浸渍笔平版印刷打印成点。修饰的表面将作为生物素 RGD 粘附梯度的基础。

最后一步是在存在可溶性化疗引诱剂梯度的情况下，用粘合剂提示将细胞加载到表面上。最终，活细胞显微镜用于显示响应粘附性和可溶性线索的细胞迁移。与现有方法（如 transwell 或空腔室测定）和常规微流体设置相比，该技术的主要优点是表面模式微流控装置的分解系统允许观察细胞对空间控制的粘附线索和粘附梯度的反应同时以及可溶性梯度。

好吧，这种方法可以帮助回答细胞迁移领域的关键问题，例如细胞粘附的重要性，并导致化疗 Texas 受体（如受体看到激酶 G 蛋白偶联受体）和粘附受体（如 RIN）吃玻璃盖玻片。首先，将盖玻片浸入 100% 乙醇的架子中，然后将架子放入儿子滑冰水浴中 30 分钟，以清洁盖玻片。在空气中擦干玻璃盖玻片。

接下来，将玻璃盖玻片在 1 摩尔氢氧化钠中超声处理 30 分钟。然后，小心地将架子倒入装满一升半毫立方水的烧杯中，冲洗玻璃表面。每次使用新鲜的毫立方水重复冲洗过程 3 次。

第三次漂洗后，玻璃盖在 60 摄氏度的烤箱中滑动约半小时。将一半干净的玻璃盖玻片单独放入由 24 孔板制成的潮湿室中，该室部分装满水。井中装满水，将玻璃盖玻片放在井的顶部进行化解，使用聚赖氨酸和聚乙二醇的共聚物，其中 20% 的 peg 分子接枝到生物素上。

缩写为 PLL Peg 生物素在每个玻璃盖玻片上滴入 15 微升 PLL Peg 生物素的 PBS 中。取剩余的另一半干净的玻璃盖玻片，小心地将 PEG 溶液夹在中间。将盖玻片在潮湿室中放置 1 小时。

滑动一小时后，夹层盖轻轻滑开，无需刮擦 PEG 涂层表面，并用 UE 水冲洗。水应该很容易在钉子处理的一侧滑落。如有必要。

将玻璃盖玻片放在纸巾上风干，处理过的表面朝上存放。玻璃盖在真空干燥中滑落，直到进一步使用。该程序所需的硅母版是通过光刻技术制造的，将 PDMS 弹性体的 A-P-D-M-S 印章铸造到培养皿内的硅母版上，高度约为 1 厘米，并将母版和 PDMS 混合物在 70 摄氏度的烘箱中固化 1 小时。

随后，将 PDMS 印章从硅母版中取出并切割成一定尺寸，以使用微接触印刷技术打印蛋白质图案，首先清洁，并在臭氧处理后立即在 UV 和臭氧清洁剂中处理图案面一个半小时，使 PDMS 印章更加亲水性。并将 10 微升剥离的 adin 涂抹在 PDMS 邮票上。如果在荧光显微镜下应该可以看到轨迹，请使用与荧光 4 偶联的剥离的 Aden，例如剥离的 avid 和 LOR three 50。

在潮湿的房间里放置一小时。用纸巾、纸张和空气去除邮票上多余的链球菌 din。将邮票擦干约 1 分钟。

将邮票轻轻按压到 PLL peg 生物素涂层玻璃盖玻片上。如果使用荧光链球菌 din，请在落射荧光显微镜下检查图案。蛋白质图案也可以使用浸笔平版印刷进行打印。

首先将一份 1 毫克/毫升、剥离蛋白或剥离的 avidan elif Fluor 3 50 与 10 份甘油混合，然后将 5 微升混合物加载到悬臂上。调整打印速度。悬臂在表面上的接触时间或悬臂到表面的垂直距离，以减小光斑尺寸。

大约 5 微米开始打印过程，如 dip pen lithography instrument store 的作手册中所述。所有印刷表面都干燥。市售的微流体装置用于创建表面梯度。

将这种涂有 Tritin 或图案的玻璃盖玻片粘附在设备的粘性面上，以确保数小时内无泄漏。用一层温热的凡士林薄层和第二层一份凡士林与一份石蜡的混合物密封装置的边缘。用 6 微升 PBS 填充设备的通道，以产生两个相反的梯度。

填充两个储液槽，一个加入 70 微升生物素、四个荧光素，另一个加入 70 微升生物素与生物素化肽精氨酸甘氨酸、斯巴达酸或 RGD 偶联的生物素，在室温下避光孵育样品一小时。冲洗微流体装置的生物素、RGD 和生物素适配性是此过程中最困难的方面，因为存在捕获气泡和干扰微接触印刷轨迹的风险。为确保成功，必须小心缓慢地去除生物素和 PBS。

取出生物素溶液，用 PBS 小心冲洗表面两次，同时仍连接到微流体装置上。在将荧光标记的细胞加载到微流体装置中之前，标记粘附梯度的方向。计数细胞并将它们分成两个细胞编号相等的试管。

清洗和复苏。用含有化疗引诱剂的培养基（例如含 10% FBS 洗涤液的低葡萄糖 DMEM）悬浮一管细胞，将另一管细胞悬浮在培养基中。如果没有化疗引诱剂，例如含 0% FBS 的 DMEM，每管中细胞的最终浓度应为每毫升第五个细胞的 10 倍的 5 倍。

从微流体装置中取出所有溶液，并将其放在预热显微镜上。将 70 微升细胞重悬于 0% F-B-S-D-M-E-M 中，放入一个储液器中。将 70 微升重悬于 10% F-B-S-D-M-E-M 中的细胞加载到另一个储液器中。

将胶带松散地贴在储液槽上以避免蒸发。确保微流体装置的通道在视野中并且细胞聚焦。选择图像采集参数，例如曝光时间和荧光滤光片。

细胞和跟踪的明场和荧光的图像序列以及时间点和记录长度启动图像采集程序。本视频演示了一种对在具有竞争性粘合剂和可溶性梯度的环境中迁移的细胞进行活细胞成像的方法。含有荧光剥离蛋白和生物素化 RGD 的胶轨是通过微接触印刷或浸笔光刻创建的。

成功的微接触打印由磁道上荧光强度的线轮廓表示，其中可以清楚地区分胶粘剂磁道和防污区域。使用浸笔平版印刷印刷的网点呈圆形，而不是撕裂状，表明印刷过程成功。在此示例中，将网点打印成一条线，行和列间距设置为 10 到 15 微米。

此距离足以防止点相互合并，但允许在单个视野中查看多个点。在大多数显微镜设置中，打印轨道上的粘附线索格雷迪是使用简单的微流体设备创建的。通过将生物素、四种荧光素和生物素 RGD 加载到微流体室面板的相对两侧。

A 显示了 60 张拍摄的马赛克图像，图像总长度为 3072 微米。在图 B 中，在整个马赛克的长度上测量荧光强度。将线性趋势线拟合到荧光强度，以指示通道中的 RGD 梯度。

除去生物素后，生物素 RGD 溶液，可在同一腔室中引入可溶性梯度。图 A 显示了荧光素染料在 PBS 和充满荧光素的储液槽附近以及 T 等于零时穿过通道的荧光强度。图 B 显示了可溶性线索的荧光强度。

孵育 16 小时后，等效结果表明梯度稳定至少 16 小时。He，使用这种方法观察到细胞在具有相反梯度的微流体室中的迁移，此处显示了一个具有代表性的电影。粘附梯度固定在链球菌 avidan 轨道上的 RGD，可溶性梯度为 0 至 10%FBS。

图像每 15 分钟拍摄一次，总共 20 小时。显示的图像过渡为每秒 8 帧。第二部电影是单个螺旋细胞向 FBS 源迁移的画面。

显示的图像过渡为每秒 8 帧。代表细胞轨迹的蓝线是通过细胞追踪软件获得的。最后一张图显示了第一部电影中图像的细胞轨迹。

向较高浓度可溶性 FPS 迁移的细胞轨迹显示在黑色中，向较高浓度贴壁 RGD 迁移的红细胞轨迹显示为黑色。这些轨迹表明，更多的 hela 细胞迁移到化疗引诱剂的来源，而不是迁移到更高浓度的贴壁 RGD。虽然尝试此程序很重要，但请记住避免在粘合剂梯度准备和生活方式成像期间蒸发微流体设备中的 PBS 或介质，如果需要，请使用胶带覆盖微流体设备的所有入口。遵循此程序。

可以进行其他方法，如转染和杂交溶液显微镜检查，以回答其他问题，如细胞迁移过程中蛋白质、黏着斑蛋白和受体作用的细胞骨架的生物力学。